تاثیر مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر تکثیر، بقا، وضعیت آنتی‏اکسیدانی و پاسخ ایمنی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جوجه تحت تنش حرارتی

تاثیر مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر تکثیر، بقا، وضعیت آنتی‏اکسیدانی و پاسخ ایمنی سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جوجه تحت تنش حرارتی

حدیث میرزایی¹، علی آقائی^1*، الهام حویزی² و محمود نظری¹

¹ ایران، ملاثانی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، گروه علوم دامی

² ایران، اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

تاریخ دریافت: 06/10/1401          تاریخ پذیرش: 24/07/1402

چکیده

زمینه و هدف: تاثیر همزمان مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر سلول‏های بنیادی مزانشیمی جدا شده از مغز استخوان (BMSCs) تاکنون مشخص نشده است. این مطالعه با هدف بررسی تاثیر مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر تکثیر و بقاء BMSCs جوجه گوشتی، وضعیت آنتی‏اکسیدانی و پاسخ ایمنی سلول‏های کشت شده تحت تنش حرارتی طراحی شده است. BMSCs از جوجه یک‏روزه نژاد راس 308 جدا و با بیان نشانگرهای سطحی با استفاده از فلوسایتومتری تایید شدند. گروه‏های آزمایشی شامل: سلول‏های بدون هیچ گونه تیماری، سلول‏هایی که دچار تنش حرارتی شدند، سلول‏های تحت تنش حرارتی تیمار شده با غلطت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و 100 میکرومولار اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان. سـپس، BMSCs از لحاظ مورفولوژی، بقا، سنجش فاکتورهای آنتی‏اکسیدان و میزان بیان ژن‎‎‏های مرتبط با ایمنی مقایـسه شـدند. سلول‏های جدا شده از نظر ریخت‏شناسی، فیبروبلاستی بودند و با استفاده از فلوسایتومتری و پتانسیل تمایزی تعیین هویت شدند. بیشترین میزان فعالیت آنزیم‏های SOD، CAT، GPX و TAC در گروه اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی مشاهده شد و بترتیب در گروه سلول‏های تیمار شده همزمان 58/45 واحد بر میلی‏لیتر، 64/11، 22/37 و 45/0 واحد بر میلی‏گرم ارزیابی شد که در مقایسه با سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری (05/0≥P) تغییر داشت. بیان IL-2، IL-6 و INF-γ بترتیب در گروه‌ تیمار هم‏زمان 97/0، 67/0 و 2 ارزیابی شد که در مقایسه با سایر گروه‏ها تغییر معنی‏داری (05/0≥P) مشاهده شد. نتایج نشان داد که استفاده از مکمل‏های آنتی‏اکسیدان در شرایط تنش حرارتی سبب بهبود پاسخ‏های آنتی‏اکسیدانی و ایمنی می‏شود.

واژه‏های کلیدی: سلول‏های بنیادی مزانشیمی، اسید آلفا لیپوئیک، کروم، پاسخ ایمنی، وضعیت آنتی‏اکسیدانی.

* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی: aghaei@asnrukh.ac.ir

مقدمه

مغز استخوان بافت پیچیده‏ای شامل سلول‏های بنیادی خون‏ساز و سلول‏های بنیادی مزانشیمی است. سلول‏های بنیادی خون‏ساز می‏توانند انواع سلول‏های خونی را ایجاد کنند و سلول‏های بنیادی مزانشیمی نیز توانایی تولید انواع دودمان‏های بافت همبند از قبیل: غضروف، استخوان و چربی را دارند (30، 15). سلول‏های بنیادی مزانشیمی اولین بار به‏وسیله فریدنستین و همکاران در سال 1992 و سپس به‏وسیله محققین دیگر (14) بر اساس چسبندگی آن‏ها به سطح کشت بافت جدا شدند. با توجه به ویژگی‏های مطلوب، محققین سلول‏های بنیادی مزانشیمی را به‏عنوان منبع مناسبی برای استفاده در پژوهش‏های حیاتی و در زمینه‏های درمانی می‏دانند (4). از جمله عوامل مهم و تاثیرگذار بر روند تکوین و زنده‏مانی سلول‏ها و به‏طبع موجودات زنده می‏توان به تنش‏های دمایی اشاره کرد. تنش گرمایی یکی از مهم‏ترین عوامل تنش‏زای محیطی است، که باعث عملکرد ضعیف، عدم تعادل سیستم اکسیدان /آنتی‏اکسیدان، وضعیت ایمنی و سلامتی در سلول‏ها و بافت‏های طیور می‏شود. همچنین، تنش گرمایی باعث ترشح کورتیکواسترون و کاته‏کول آمین‏ها و آغاز پراکسیداسیون لیپید در غشای سلولی می‏شود (33). علاوه‏بر این، تنش گرمایی از طریق ترشح نشانگرهای التهابی مانند اینترلوکین 6 (IL-6)، پروتئین واکنش پذیر C (CRP) و فاکتور غده بافت‏های مرده آلفا (TNF-alpha) باعث برهم خوردن وضعیت آنتی‏اکسیدان می‏شود (18). پیشرفت‌های اخیر در زمینه بیوتکنولوژی، کشف اثرات تنش گرمایی بر سطوح مولکولی را ممکن ساخته است (35، 18). ارزیابی بیان ژن بینشی در مورد چگونگی واکنش سلول‏ها به تنش گرمایی ارائه می‏دهد. از این‏رو، شناسایی رویکردهای برای بهبود اثرات تنش گرمایی بر سلامت و تولید طیور اخیرا مورد توجه قرار گرفته است (24). روش‏های مختلفی برای کاهش اثرات مضر تنش گرمایی بر وضعیت سلامت بافت طیور در دسترس است، مانند استفاده از افزودنی‏های خوراکی از جمله روش‏های رایج و اقتصادی می‏باشند (11، 1). در این میان اسید آلفا لیپوئیک (α-LA) یا 1,2-dithiolane-3-pentanoic acid، یک ترکیب دیتیول طبیعی است که بصورت آنزیمی در میتوکندری از اسید اکتانوئیک سنتز می‏شود و نقش مهمی در متابولیسم انرژی میتوکندری دارد. در داخل سلول‏ها به دو شکل مختلف اکسید شده (α-LA) و احیا شده (دی هیدرولیپوئیک اسید، (DHLA)) وجود دارد. α-LA محلول در آب و چربی است، بنابراین بطور گسترده‏ای در گیاهان و حیوانات جذب شده و از طریق غشای سلولی و سیتوزول منتقل می‏شود (13). در شرایط تنش α-LA مستقیما از طریق رفع رادیکال‏های آزاد، تشکیل باند با فلزات و بطور غیرمستقیم از طریق بازیافت سایر آنتی‏اکسیدان‏های سلولی مانند گلوتاتیون، آسکوربات و ویتامین E به‏عنوان آنتی‏اکسیدان عمل می‏کند (29). در دوزهای بالا، α-LA مجموعه‏ای از فعالیت‏های بیولوژیکی خاص را با ارزش دارویی بالقوه در برابر طیف بسیار گسترده‏ای از شرایط پیش پاتولوژیک و پاتوفیزیولوژیک نشان می‏دهد (29).

استفاده از α-LA باعث افزایش فعالیت SOD و کاهش فعالیت CAT در بافت معده موش صحرایی شد (23). استفاده از غلظت‏های پایین (میکرومولار تا میلی‏مولار)، α-LA برای سلول‏های سرطانی کشت شده نشان داد که باعث القا آپوپتوز، فعالیت آنتی‏اکسیدان، آزاد شدن H2O2 و تحریک مکانیسم‏های پاسخ به تنش می‏شود. همچنین مکمل α-LA ‏بعنوان یک آنتی‏اکسیدان عمل کرده و وضعیت تنش اکسیداتیو را در شرایط درون‏تنی و برون‏تنی بهبود می‏بخشد. علاوه‏بر این، α-LA دارای خواص ضدالتهابی است و افزودن آن به جیره غذایی جوجه‏های گوشتی بیان ژن‏های مرتبط با التهاب طحال را بهبود می‏بخشد (27). همچنین نشان داده شده است که α-LA می‏تواند آزادسازی سیتوکین‏های مختلف از جمله TNFα و IL-6 را مهار کند (27). کوبان و همکاران (2017)، گزارش کردند که α-LA و DHLA قادر به کاهش زنده ماندن سلول‏های سرطان سینه به روشی وابسته به غلظت هستند (26). جوریرو و همکاران (2011)، نشان دادند که اسید آلفا لیپوئیک، کافئیک اسید و اسید 2-S-لیپویل-کافئیک باعث کاهش سیتوکین‏های پیش التهابی مانند TNF-α، IL-1β و IL-8 و افزایش سیتوکین‏های ضدالتهابی مانند IL-10 می‏شوند (16). گزارش‏های مختلف نشان می‌دهند که اسید آلفا لیپوئیک و کافئیک اسید به روشی وابسته به دوز فعال‌سازی NF-kB ناشی از TNF-α را هم در سلول‌های بافتی U937 انسان و هم در سلول‌های اندوتلیال آئورت انسان مهار می‌کنند (40). کاهش IL-8 پس از درمان سلول‌های HepG2 و Huh7 با لیپوئیک اسید، کافئیک اسید و اسید 2-S-لیپوئیل-کافئیک به دست آمد، نشان می‏دهد که می‌تواند از تهاجم تومور جلوگیری کند. گزارش شده است α-LA سمیت عصبی ناشی از مس را در کشت‌های سلولی کاهش می‌دهد (36).

از دیگر افزودنی‏های خوراکی جیره طیور می‏توان به کروم (Cr) اشاره کرد که یک عنصر معدنی ضروری است، این عنصر و نمک‏های آن کاربردهای گسترده‏ای در تغذیه و صنایع مختلف دارد (32). کروم سه ظرفیتی (III) Cr پایدارترین شکل در عرضه مواد غذایی و در داخل بدن است (32). کروم برای متابولیسم کربوهیدرات‏ها، لیپیدها و پروتئین‏ها در پرندگان ضروری می‏باشد، زیرا یک جز فعال فاکتور تحمل گلوکز را تشکیل می‏دهد، که باعث تأثیر متابولیکی انسولین می‏شود (32). استفاده از کروم در اثر عواملی که معمولا عامل تنش‏زا نامیده می‏شوند، به‏ویژه در هنگام فشارهای مختلف تغذیه‏ای، متابولیکی و جسمی در حال افزایش است. آزمایشات مختلف نشان داده‏اند که مکمل غذایی کروم می‏تواند اثرات مخرب تنش گرمایی در طیور را کاهش دهد (34). کروم می‏تواند از طریق فعالیت آنتی‏اکسیدانی خود از پراکسیداسیون لیپید ناشی از تنش گرمایی جلوگیری کند، به‏ویژه هنگامی که به جیره غذایی طیور اضافه شود. از دیگر مکانیسم‏های عملکردی کروم، کاهش سرکوب سیستم ایمنی در زمان تنش می‏باشد (6). کروم از طریق القای انتشار سیتوکین‏ها، پاسخ ایمنی در حیوانات، از جمله طیور را تحت تاثیر قرار می‏دهد. مکمل کروم از طریق تاثیر بر بیان ژن IFN-γ در بافت طحال جوجه‏های گوشتی، در تعدیل سیستم ایمنی نقش دارد (5). مکمل کروم از افزایش ترشح TNF-α، سطوح پراکسیداسیون لیپیدی و استرس اکسیداتیو ناشی از H2O2 و سطوح بالای گلوکز در سلول‌های U937 کشت شده جلوگیری کرد (21) که به نظر می‏رسد با اثر آنتی‏اکسیدانی آن مرتبط باشد. نتایج مطالعه ژا و همکاران (2008) نشان داد که انتقال نانوکروم (CrNano)، پیکولینات کروم (CrPic) و کلریدکروم (CrCl3) در سلول‏های Caco-2 عمدتا از طریق مسیرهای انتقال غیرفعال انجام می‏شود (39). علاوه‏بر این، CrNano راندمان جذب بسیار بالاتری نسبت به CrPic و CrCl3 در سلول‏های Caco-2 نشان داد. گزارش شده که جذب کروم کمپلکس شده با برخی لیگاندهای آلی افزایش می‏یابد (11).

با توجه به مطالب مورد اشاره در ارتباط با تنش حرارتی و تنش اکسیداتیو ناشی از آن، که وضعیت ایمنی و در نتیجه سلامتی و عملکرد پرنده را تحت تاثیر قرار می‏دهد و نیز خواص آنتی‏اکسیدانی اسید آلفا لیپوئیک و نقش کروم در متابولیسم گلوکز که با کاهش اثرات ناشی از تنش اکسیداتیو همراه است، همچنین کاربرد سلول‏های بنیادی، تاکنون تاثیر همزمان مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر تکثیر و بقاء سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جوجه گوشتی مشخص نشده است. لذا مطالعه حاضر، با هدف بررسی تاثیر مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر تکثیر و بقاء سلول‏های بنیادی مزانشیمی جدا شده از مغز استخوان جوجه گوشتی، وضعیت آنتی‏اکسیدانی و پاسخ ایمنی سلول‏های کشت شده تحت تنش حرارتی و دستیابی به یک منبع با ارزش سلول‏های بنیادی مزانشیمی، بمنظور استفاده در روش‏هایی هم‏چون؛ شبیه‏سازی، انتقال ژن و یا مطالعه بیماری‏های ویروسی در پرندگان طراحی شده است. همچنین از آن‏ها می‏توان جهت استفاده در تحقیقات واکسن، تست‏های تشخیصی ویروس شناسی، ژن درمانی، حفظ گونه‏های با ارزش پرندگان در حال انقراض، درمان بیماری‏های پرندگان و درمان بیماری‏های مشترک انسان و طیور بهره جست.

مواد و روشها

جداسازی و تعیین هویت سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جوجه: در مطالعه حاضر از جوجه یک‏روزه نژاد راس 308 استفاده شد. جوجه‏ها توسط کلروفرم بیهوش و استخوان پا جدا شدند و با PBS (سیگما، آمریکا) محتوی 3% پنی‏سیلین/ استرپتومایسین شسته و به محیط (Dulbecos Modified Eagle Medium) DMEM (Gibco، آمریکا) منتقل شدند. قسمت اپی‏فیزها قطع و با استفاده از سرنگ انسولین مغز استخوان خارج شد و از مش 40 و 70 میکرومتری عبور داده شد و رسوب سلولی با محیط DMEM، محتوی 10% FBS (Gibco، آمریکا) سوسپانسیون و در فلاسک کشت T25 (SPL 70025، کره) در شرایط 5% دی‏اکسید کربن و 38 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. بمنظور تکثیر سلولی، اولین پاساژ سلولی با استفاده از ترپسین/EDTA (Gibco، آمریکا) انجام گرفت.

تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به آدیپوسایت: سلول‏ها به تعداد 4×104 cell/well در پلیت‏های ۲۴ خانه (SPL، کره) به مدت ۳ هفته با محیط آدیپوژنیک تیمار شدند. محیط آدیپوژنیک شامل محیط DMEM، 50 میکروگرم در میلی‌لیتر اسکوربیک اسید، 7- 10 مولار دگزامتازون، 50 میکروگرم در میلی‌لیتر ایندومتاسین و 10 درصد FBS بود. بمنظور تشخیص واکوئل‏های چربی از رنگ آمیزی اویل رد استفاده شد. برای این رنگ آمیزی در ابتدا سلول‌ها با فرمالین %۴ به مدت ۱ ساعت تثبیت و سپس با اتانول 70% شستشو شدند و با محلول رنگی اویل رد %5/0 در الکل ایزوپروپیل 99% به مدت ۱۰-۱۵ دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند.

تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به استئوبلاست: سلول‏ها به تعداد 4×104 cell/well در پلیت‏های ۲۴ خانه به مدت ۳ هفته با محیط استئوژنیک تیمار شدند. محیط تمایز به سمت استئوبلاست شامل DMEM حاوی10 درصد FBS، 50 میکروگرم در میلی‏لیتر اسکوربیک 3-فسفات، دگزامتازون 8- 10 مولار و بتا گلیسرول فسفات 10 میلی‏مولار بود. بمنظور ارزیابی تمایز، رنگ آمیزی برای تشخیص رسوب کلسیمی صورت گرفت. برای ارزیابی تمایز استئوژنیک، از رنگ ‏آمیزی اختصاصی آلیزارین رد استفاده شد. برای این رنگ آمیزی سلول‌ها به مدت ۱۰ دقیقه با متانول در دمای اتاق تثبیت و با رنگ آلیزارین رد 1% در آب آمونیاکی %۲۵ به مدت ۲ دقیقه رنگ آمیزی شدند.

فلوسایتومتری: به این منظور از سلول‏های پاساژ 3 استفاده شد. پس از شستشو سلول‏ها با PBS، غلظت مناسب از آنتی بادی‏های‎‌ کنژوگه (Clini Sciences, MBS8582781-0) CD29، (Clini Sciences, 8400-02) CD44،(Clini Sciences, E3451) CD34، (Clini Sciences) CD31 را در محیط تاریک به آن اضافه شد. سپس نمونه‏ها در یخچال و دور از نور نگهداری گردید و جهت فلوسایتومتری به آزمایشگاه ارسال شدند.

تقسیم بندی گروه‏های مورد آزمایش: گروه‏های آزمایشی شامل: گروه 1 (سلول‏های تحت تنش حرارتی که با غلظت 100 میکرومولار اسید آلفا لیپوئیک تیمار شدند)، گروه 2 (سلول‏های تحت تنش حرارتی که با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم تیمار شدند)، گروه 3 (سلول‏های تحت تنش حرارتی که همزمان با غلظت 100 میکرومولار اسید آلفا لیپوئیک و100 میکرومولار پروپیونات کروم تیمار شدند)، گروه 4 ( سلول‏های تحت تنش حرارتی (HS) ) و گروه 5 (گروه کنترل که سلول‏ها بدون هیچ گونه تیماری نگه‏داری می‏شوند).

اعمال تنش حرارتی: پس از پاساژ سوم سلول‏ها تعداد 104 × 4 در چاهک‏های پلیت 24 خانه کشت شدند و تنش حرارتی به مدت 1 ساعت در دمای 39 تا 42 درجه سانتی‏گراد اعمال گردید.

بررسی سمیت سلولی: بمنظور سنجش سمیت، بقای سلول و مطالعات تکثیر تست MTT مورد استفاده قرار گرفت. لازم به ذکر است که از مرحله‏ی اضافه کردن MTT (سیگما، آمریکا)، کار در شرایط تاریکی انجام شد و هر غلظت از ترکیب در 5 چاهک تکرار شد. از سوی دیگر هر آزمایش، در سه تکرار مجزا صورت گرفت. این تست برای اسید آلفا لیپوئیک با غلظت‌های 100، 250، 500 و 1000 میکرومولار و پروپیونات کروم با غلظت‏های 1، 10، 50 و 100 میکرومولار روی سلول‏های مزانشیمی مغز استخوان جوجه انجام شد.

بررسی و سنجش فاکتورهای آنتی‏اکسیدانی: به این منظور در گروه‏های مختلف، سلول‏های بنیادی مغز استخوان در پلیت 24 خانه تیمار و در پایان دوره با استفاده از بافر ریپا، لیز شدند. تمامی مراحل برای جلوگیری از دناتوره شدن و لیز شدن پروتئین‌ها، بر روی یخ انجام شد. در ابتدا با استفاده از روش برادفورد مقدار کل پروتئین موجود در نمونه محاسبه و سپس سطح ظرفیت آنتی‏اکسیدانی کل (TAC)، گلوتاتیون پراکسیداز (GPx)، گلوتاتیون احیاء، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) مورد سنجش قرار گرفت. TAC، بر اساس توانایی آنتی‏اکسیدانی نمونه در احیا یون فریک به فروس و ایجاد کمپلکس آبی طراحی شده که با روش فتومتریک قابل ارزیابی است. فعالیت آنزیم SOD به کمک سنجش مهار احیای نیترولوتترازولیوم (NBT) درحضور SOD در طوح موج 560 نانومتر انجام گرفت. فعالیت CAT براساس روش رنگ‏سنجی مبتنی بر واکنش پراکسید هیدروژن تجزیه نشده با مولیبدات آمونیوم برای تولید رنگ زرد، که حداکثر جذب در طول موج 374 نانومتر را دارد، اندازه‏گیری شد. گلوتاتیون پراکسیداز، اکسیداسیون گلوتاتیون توسط هیدروپراکسید را کاتالیز می‏کند. در حضور گلوتاتیون ردوکتاز و NADPH، گلوتاتیون اکسید شده بلافاصله با اکسیداسیون NADPH به NADP⁺ به شکل احیا شده تبدیل می‏شود. کاهش جذب در طول موج 340 نانومتر اندازه‏گیری شد.

ارزیابی مقدار پروتئین به روش برادفورد: بمنظور تعیین مقدار پروتئین در نمونه‏ها از روش برادفورد استفاده شد. بدین منظور مقدار 20 میکرولیتر نمونه‏ی حاصل از لیز سلولی و 20 میکرولیتر آب مقطر (بلانک) بصورت دو بار تکرار در چاهک‏های پلیت 96 خانه اضافه شد. سپس به نمونه‏ها و بلانک مقدار 40 میکرولیتر معرف برادفورد و 140 میکرولیتر آب مقطر اضافه شد و پس از مخلوط نمودن با استفاده از دستگاه پلیت‏ریدر (Bioteck، آمریکا)، جذب نمونه‏ها در طول موج 495 نانومتر قرائت گردید. بمنظور تعیین غلظت پروتئین در نمونه‏ها از منحنی استاندارد پروتئین سرم آلبومین گاوی با غلظت‏های 2، 5، 10، 20، 50 و 100 میکروگرم بر میلی‏لیتر استفاده شد. پس از رسم منحنی استاندارد تغییرات جذب نمونه‏های استاندارد در برابر غلظت آن‏ها، فرمول خط، استخراج شد و با استفاده از فرمول خط، غلظت نمونه‏های مجهول محاسبه گردید.

بررسی بیان ژن‏های مرتبط با ایمنی در گروه‏های مختلف: الگوی بیان mRNA ژن اینترلوکین 2، اینترلوکین 6 و IFN-γ دخیل در ایمنی با استفاده از qRT-PCR (ABI، آمریکا)، انجام شد. برای استخراج RNA سلول‏ها با استفاده از تریازول لیز شدند و بعد از استخراج با استفاده از دستگاه نانودراپ (Thermo، آمریکا)، بررسی غلظت و خلوص انجام شد. برای سنتز cDNA از TaqMan Reverse Transcription استفاده شد. برای هر نمونه 40 نانوگرم از cDNA سنتز شده با 10 میکرولیتر ازPower SYBER Green master mix  و 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر مخلوط و Ct هر نمونه با استفاده از نرم‌افزار StepOne محاسبه و نرمالیزاسیون با استفاده از ژن GAPDH انجام گرفت و هر آزمایش سه بار تکرار گردید. برای طراحی پرایمر اختصاصی برای ژن‌های مورد نظر ابتدا با استفاده از سایت NCBI، توالی نوکلئوتیدی مربوط به رونوشت‌های ژن‌های مورد مطالعه بدست آمد. پس از بررسی مناطق مختلف رونوشت از جمله محل اگزون و اینترون، محل مناسب بصورت آنلاین و بوسیله‏ی نرم‏افزار Olig7 محل‏یابی شد. با کمک نرم افزارPrimer BLAST از سایت NCBI شرایط اختصاصی بودن و دینامیکی پرایمر بررسی شد .پرایمرهای بکار رفته در این مطالعه دارای خصوصیات ذکرشده در جدول 1 می‌باشند.

جدول 1- توالی و خصوصیات آغازگرهای رفت و برگشت استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

روش آماری تجزیه و تحلیل داده‏ها

نتایج حاصل از این تحقیق در قالب طرح کاملا تصادفی مورد تجزیه واریانس قرار گرفتند. مقایسه میانگین‏ها با استفاده از آزمون Tukey انجام و سطح معنی‏داری 5 صدم درنظر گرفته شد. برای تجزیه و تحلیل داده‏ها از نرم افزار آماری SAS و برای رسم نمودارها از نرم‏افزار Excel استفاده شد.

نتایج

بررسی مورفولوژی سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان جوجه: سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جوجه در طی روند استحصال و پس از کشت (پاساژ صفر) و در طی پاساژهای متوالی بصورت روزانه توسط میکروسکوپ معکوس مورد مشاهده و عکس‏برداری قرار گرفتند. این سلول‌ها از لحاظ مورفولوژی و تراکم نیز مورد بررسی قرار گرفتند. همانگونه که در تصویر1 مشاهده می‌شود شکل کشیده و دوکی آن‌ها با مورفولوژی سلول‌های فیبروبلاستی، توانایی چسبندگی، برقراری اتصالات محکم به کف فلاسک و مورفولوژی طبیعی قابل مشاهده بود. در مراحل اولیه استحصال، شکل سلول‌ها نامنظم، با کشیدگی کمتر و با تعداد کمی سلول‏های غیراختصاصی همراه بود که پاساژ‌های سلولی بعدی منجر به جداسازی سلول‌های غیر اختصاصی گردید، به نحوی که در پاساژ سوم کلیه سلول‌ها اختصاصی با مورفولوژی دوکی بودند. همچنین سلول‌ها تمایل بالایی را جهت تکثیر و برقراری اتصال با سلول‌های مجاور نشان ‌دادند. بعلاوه تراکم بالای سلول‏ها که نشان‌دهنده رشد نرمال آن‌ها است، قابل توجه بود. این سلول‏ها بدون رنگ‏آمیزی هستند؛ بنابراین کنتراست کمی با بستر زمینه دارند (شکل1 A و B).

تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به سلول‌های آدیپوسایت: قدرت تمایز سلول‌های بنیادی به آدیپوسایت یکی از ویژگی‌های فنوتیپی مهم بمنظور تایید بنیادی و چندتوان بودن سلول‌های بنیادی جداسازی شده در شرایط آزمایشگاهی می‌باشد. در سلول بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان جوجه بعد از قرار گرفتن در معرض محیط تمایز آدیپوژنیک، واکوئل چربی تشکیل شد و این واکوئل‌ها به تدریج افزایش یافت. واکوئل‌های چربی حاوی تری‌گلیسیرید می‌باشند که به‏راحتی با رنگ‏آمیزی Oil red قابل تایید هستند. تمایز آدیپوسایت از سلول‏های بنیادی مغز استخوان از طریق این رنگ‏آمیزی و مشاهده وزیکول‌های چربی به رنگ قرمز به کمک میکروسکوپ معکوس در روز 21 تمایز آدیپوژنیک تایید شد (شکل1 C).

شکل 1- بررسی بررسی مورفولوژی BMSCs توسط میکروسکوپ معکوس. A. BMSCs که در پاساژ اول بعد از کشت، اتصال و رشد سلول‌ها را نشان می‌دهد. B. BMSCs در پاساژ سوم. C. بررسی تمایز BMSCs به سلول‌های آدیپوسایت با رنگ آمیزی اویل رد. D. بررسی تمایز BMSCs به سلول‌های استئوبلاست با رنگ آمیزی آلیزارین رد.

تمایز سلول‌های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان به سلول‌های استئوبلاست: سلول‌های بنیادی مزانشیمی در محیط استئوژنیک در مدت 21 روز به سلول‌های استئوبلاست تمایز داده شدند. بعد از تمایز، سلول‌های استئوبلاست کلسیم-فسفات تولید می‏کنند؛ که با رنگ‏آمیزی الیزارین رد قابل شناسایی می‌باشند. تشکیل سلول‌های استئوبلاست از طریق این رنگ‏آمیزی و مشاهده رسوبات ذخیره کلسیمی به رنگ قرمز به کمک میکروسکوپ معکوس در روز 21 تمایز تایید شد (شکل1 D).

بررسی نشانگرهای سلول‌های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان با استفاده از فلوسایتومتری: بیان یا عدم بیان نشانگرهای پروتئینی سطحی یکی از مهم‏ترین روش‌های تایید فنوتیپ سلول‌های بنیادی مزانشیمی پس از جداسازی می‌باشد. مشخص شده است که سلول‌های بنیادی مشتق شده از مغز استخوان، بیان نشانگرهای سطحی CD29 و CD44 و عدم بیان نشانگرهای خونساز CD34 و CD31 را نشان می‌دهند. در این مطالعه بیان و عدم بیان نشانگرهای سطحی با استفاده از آنتی‏بادی‌های اختصاصی و روش فلوسایتومتری ارزیابی شد. بر اساس نتایج فلوسایتومتری سلول‏های پاساژ سوم نشانگر CD29 را در حدود 5/98 درصد و نشانگر CD44 در حدود 5/95 درصد بیان داشتند، که این نشانگرها به‏عنوان نشانگرمثبت برای سلول‌های مزانشیمی مغز استخوان در نظر گرفته می‌شوند. نشانگر CD34 که یک نشانگر منفی است در حدود 03/1 درصد و نشانگر منفی CD31 در حدود 25/0 درصد بیان داشتند (شکل2).

شکل 2- بررسی نشانگرهای BMSCs با استفاده از فلوسایتومتری بعد از پاساژ سوم. میزان بیان نشانگر CD29 در حدود 5/98 درصد بود. میزان بیان نشانگر CD44 در حدود 5/95 درصد بیان داشت. نشانگر CD31 در حدود 25/0 درصد بیان داشت. نشانگر CD34 در حدود 03/1 درصد بیان داشت.

بررسی زنده‏مانی سلول‏ها به روش MTT: در این بخش اثرات پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بر بقاء سلول‌های بنیادی مغز استخوان جوجه با تست MTT در مقایسه با گروه‌های کنترل بررسی شد. در این آزمایش، میانگین درصد بقای سلولی به‌دست آمده از سلول‌هایی که تحت تاثیر غلظت‌های مختلف پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک قرار گرفتند، با میانگین درصد زنده‏مانی سلول‌های نمونه کنترل مقایسه شدند. بر اساس نتایج در غلظت‌های 1، 10 و 50 میکرومولار پروپیونات کروم، زنده‏مانی سلول‌های بنیادی مغز استخوان 100% بوده است و این ماده در غلظت‏های ذکر شده اثر توکسیک نداشت ولی در غلضت‌ 100 میکرومولار زنده‏مانی سلول‌ها به 92 درصد رسید. همچنین در غلظت‌های 100، 250، 500 و 1000 میکرومولار اسید آلفا لیپوئیک، زنده‏مانی سلول‌های بنیادی مغز استخوان بیشتر از 100% بود و هیچ گونه اثرات توکسیک در این غلظت‏ها مشاهده نشد (شکل 3).

شکل 3- نتایج مربوط به بررسی بقای سلول‌های بنیادی مغز استخوان جوجه با استفاده از MTT در 24 ساعت بعد از تیمار با غلظت‏های مختلف A. پروپیونات کروم و B. اسید آلفا لیپوئیک. (05/0≥*= P، 01/0≥*= P*، 001/0≥*= P**). آلفا لیپوئیک= LA و پروپیونات کروم= Cr-Pro.

نتایج حاصل از بررسی تغییرات میزان فعالیت آنزیم SOD سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

پس از محاسبه میزان فعالیت آنزیم SOD در گروه کنترل، سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان فعالیت آنزیم SOD در گروه سلول‏های تحت تنش حرارتی 22/9 واحد بر میلی‏لیتر ارزیابی شد که نسبت به سلول‏های کنترل افزایش معنی‏داری نشان داد (05/0≥P). میزان فعالیت آنزیم SOD در گروه‌ سلول‏های تیمار شده با پروپیونات کروم تحت تنش حرارتی نسبت به گروه HS بصورت معنی‌داری (001/0≥P) افزایش یافته است (شکل4). همچنین میزان فعالیت این آنزیم در سلول‏های تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی نسبت به گروه HS و سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش نشان داد. بطوری‏که بیشترین میزان فعالیت در این گروه مشاهده شد. میزان فعالیت SOD در گروه سلول‏های تیمار شده هم زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی 58/45 واحد بر میلی‏لیتر ارزیابی شد، که در مقایسه با گروه HS و گروه تیمار شده با پروپیونات کروم بطور معنی‏داری افزایش (001/0≥P) و در مقایسه با گروه تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک بطور معنی‏داری (001/0≥P) کمتر بود (شکل 4).

شکل 4- مقایسه مقدار فعالیت آنزیم SOD در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان بعد از ۲۴ ساعت (05/0≥*= P، 01/0≥*= P*، 001/0≥*= P**). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی=  HS(*= مقایسه با کنترل، += مقایسه گروه‏های مختلف).

نتایج حاصل از بررسی تغییرات میزان فعالیت آنزیم CAT سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

پس از محاسبه میزان فعالیت آنزیم CAT در گروه HS، سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان فعالیت آنزیم CAT در گروه سلول‏های تحت تنش حرارتی 61/2 واحد بر میلی‏گرم پروتئین ارزیابی شد، که نسبت به سلول‏های کنترل افزایش معنی‏داری نشان داد (05/0≥P). میزان فعالیت آنزیم CAT در گروه‌ سلول‏های تیمار شده با ‌پروپیونات کروم تحت شوک حرارتی نسبت به گروه HS بصورت معنی‌داری (001/0≥P) افزایش یافته است (شکل 5). همچنین میزان فعالیت این آنزیم در گروه‌ سلول‏های تیمار شده با‌ اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی نسبت به گروه HS و سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش نشان داد بطوری‏که بیشترین میزان فعالیت در این گروه مشاهده شد. در گروه‌ سلول‏های تیمار شده هم زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی میزان فعالیت CAT، 11/64 واحد بر میلی‏گرم پروتئین ارزیابی شد؛ که در مقایسه با گروه HS و گروه تیمار شده با پروپیونات کروم بطور معنی‏داری افزایش (001/0≥P) و در مقایسه با گروه تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک بطور معنی‏داری (001/0≥P) کمتر بود (شکل 5).

شکل 5- مقایسه مقدار فعالیت آنزیم CAT در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان بعد از ۲۴ ساعت (05/0≥*= P، 01/0≥*= P*، 001/0≥*= P**). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی= HS (*= مقایسه با کنترل، += مقایسه گروه‏های مختلف).

نتایج حاصل از بررسی تغییرات میزان فعالیت آنزیم GPX سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

پس از محاسبه میزان فعالیت آنزیم GPX در گروه کنترل، سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان فعالیت آنزیم GPX در گروه سلول‏های تحت تنش حرارتی 23/8 واحد بر میلی‏گرم پروتئین ارزیابی شد. میزان فعالیت آنزیم GPX در گروه‌ سلول‏های تیمار شده با پروپیونات کروم تحت تنش حرارتی‌ نسبت به گروه HS بصورت معنی‌داری (001/0≥P) افزایش یافته است (شکل 6). همچنین میزان فعالیت این آنزیم در سلول‏های تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی نسبت به گروه HS و سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش نشان داد بطوری‏که بیشترین میزان فعالیت در این گروه مشاهده شد. در گروه‌ سلول‏های تیمار شده هم زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی میزان فعالیت GPX، 37/22 واحد بر میلی‏گرم پروتئین ارزیابی شد که در مقایسه با گروه HS و گروه تیمار شده با پروپیونات کروم بطور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش و در مقایسه با گروه تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک بطور معنی‏داری (001/0≥P) کمتر بود (شکل 6).

شکل 6 - مقایسه مقدار فعالیت آنزیم GPX در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان بعد از ۲۴ ساعت (05/0≥*= P، 01/0≥*= P*، 001/0≥*= P**). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی= HS (*= مقایسه با کنترل، += مقایسه گروه‏های مختلف).

نتایج حاصل از بررسی تغییرات میزان فعالیت آنزیم TAC سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

پس از محاسبه میزان فعالیت آنزیم TAC در گروه کنترل، سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان فعالیت آنزیم TAC در گروه سلول‏های تحت تنش حرارتی 22/0 واحد بر میلی‏گرم پروتئین ارزیابی شد. میزان فعالیت آنزیم TAC در گروه‌ سلول‏های تیمار شده با پروپیونات کروم تحت شوک حرارتی‌ نسبت به گروه HS بصورت معنی‌داری (001/0≥P) افزایش یافته است (شکل 7). همچنین میزان فعالیت این آنزیم در سلول‏های تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک تحت شوک حرارتی نسبت به گروه HS و سایر گروه‏ها به‏طور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش نشان داد؛ به‏طوری‏که بیشترین میزان فعالیت در این گروه مشاهده شد. در گروه‌ سلول‏های تیمار شده هم زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی میزان فعالیت TAC، 45 واحد بر میلی‏گرم پروتئین ارزیابی شد؛ که در مقایسه با گروه HS و گروه تیمار شده با پروپیونات کروم بطور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش و در مقایسه با گروه تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک بطور معنی‏داری (001/0≥P) کمتر بود (شکل 7).

شکل 7- مقایسه مقدار فعالیت آنزیم TAC در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان بعد از ۲۴ ساعت (05/0≥*= P، 01/0≥*= P*، 001/0≥*= P**). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی= HS (*= مقایسه با کنترل، += مقایسه گروه‏های مختلف).

نتایج حاصل آنالیز بیان ژن IL-2 در سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان بیان ژن IL-2 در گروه کنترل، 1 در نظر گرفته شد و بیان این ژن در گروه سلول‏های تحت تنش حرارتی 1/5 محاسبه شد که نسبت به گروه کنترل بطور معنی‏داری (001/0≥P) افزایش نشان داد. میزان بیان ژن IL-2 در گروه‌ سلول‏های تیمار شده با پروپیونات کروم تحت تنش حرارتی‌ نسبت به گروه HS، 3/7 برآورد شد که بصورت معنی‌داری (001/0≥P) کاهش یافته است (شکل 8). همچنین میزان بیان این ژن در سلول‏های تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی حدود 8/1 برآورد شد که نسبت به گروه HS و گروه تیمار شده با پروپیونات کروم بطور معنی‏داری کاهش (001/0≥P) نشان داد. میزان بیان ژن IL-2 در گروه‌ سلول‏های تیمار شده هم‏زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی 97/0 ارزیابی شد که در مقایسه با میزان بیان این ژن در سایر گروه‏ها کاهش معنی‏داری (001/0≥P) مشاهده شد. بطوری‏که کمترین میزان بیان ژن IL-2 در این گروه مشاهده شد (شکل 8).

شکل 8- مقایسه میزان بیان ژن IL-2 با استفاده از روش qRT-PCR در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان جوجه بعد از ۲۴ ساعت. از ژن GAPDH به عنوان کنترل داخلی و نرمالایزر استفاده شد. در هر ستون، میانگین‏های دارای حروف مختلف تفاوت آماری معنی‏داری دارند (05/0≥P). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی= HS.

نتایج حاصل آنالیز بیان ژن IL-6 در سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک بصورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان بیان ژن IL-6 در گروه کنترل، 1 در نظر گرفته شد و بیان این ژن در گروه سلول‏های تحت تنش حرارتی 9/3 محاسبه شد که نسبت به گروه کنترل بطور معنی‏داری افزایش (001/0≥P) نشان داد. میزان بیان ژن IL-6 در سلول‏های تیمار شده با ‌پروپیونات کروم تحت تنش حرارتی 7/1 برآورد شد که نسبت به گروه HS بصورت معنی‌داری (001/0≥P) کاهش یافته است (شکل 9). همچنین میزان بیان این ژن در سلول‏های تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی حدود 2/0 برآورد شد که نسبت به نمونه HS و سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری (001/0≥P) کاهش نشان داد. بطوری‏که کم‏ترین میزان بیان ژن IL-6 در این گروه مشاهده شد. میزان بیان ژن IL-6 در گروه‌ سلول‏های تیمار شده هم‏زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت تنش حرارتی 67/0 ارزیابی شد که در مقایسه با گروه HS و گروه پروپیونات کروم کاهش معنی‏داری (001/0≥P) و در مقایسه با گروه اسید آلفا لیپوئیک افزایش معنی‏داری (001/0≥P) مشاهده شد (شکل 9).

شکل 9- مقایسه میزان بیان ژن IL-6 با استفاده از روش  qRT-PCR در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان جوجه بعد از ۲۴ ساعت. از ژن GAPDH به‏عنوان کنترل داخلی و نرمالایزر استفاده شد. در هر ستون، میانگین‏های دارای حروف مختلف تفاوت آماری معنی‏داری دارند (05/0≥P). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی= HS.

نتایج حاصل آنالیز بیان ژن INF-γ در سلول‌های مغز استخوان جوجه تیمار شده در گروه‏های مورد آزمایش

سلول‌های مغز ‌استخوان تحت تیمار 24 ساعته با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک به صورت جداگانه و هم‏زمان قرار گرفتند. میزان بیان ژن INF-γ در گروه کنترل، 1 در نظر گرفته شد و بیان این ژن در گروه سلول‏هایی تحت شوک حرارتی 2/4 محاسبه شد که نسبت به سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری افزایش نشان داد. میزان بیان ژن INF-γ در سلول‏های تیمار شده با ‌پروپیونات کروم تحت تنش حرارتی 1/3 برآورد شد که نسبت به گروه HS بصورت معنی‌داری کاهش (05/0≥P) یافته است (شکل 10). همچنین میزان بیان این ژن در سلول‏های تیمار شده با اسید آلفا لیپوئیک تحت شوک حرارتی حدود 2/1 برآورد شد که نسبت به نمونه HS و سایر گروه‏ها بطور معنی‏داری کاهش نشان داد. میزان بیان ژن INF-γ در گروه‌ سلول‏های تیمار شده هم‏زمان با پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک تحت شوک حرارتی 2 ارزیابی شد که در مقایسه با گروه شوک حرارتی و گروه پروپیونات کروم کاهش(01/0≥P) معنی‏داری و در مقایسه با گروه اسید آلفا لیپوئیک افزایش معنی‏داری (05/0≥P) مشاهده شد (شکل 10).

شکل 10- مقایسه میزان بیان ژن INF-γ با استفاده از روش  qRT-PCR در گروه‌ کنترل و تیمار با غلظت 100 میکرومولار پروپیونات کروم و اسید آلفا لیپوئیک در سلول‏های بنیادی مغز استخوان جوجه بعد از ۲۴ ساعت. از ژن GAPDH به‏عنوان کنترل داخلی و نرمالایزر استفاده شد. در هر ستون، میانگین‏های دارای حروف مختلف تفاوت آماری معنی‏داری دارند (05/0≥P). اسید آلفا لیپوئیک= LA، پروپیونات کروم= Cr-Pro، تنش حرارتی= HS.

بحث و نتیجه‏گیری

در این مطالعه سلول‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان جوجه استحصال، شناسایی و تعیین هویت شدند. سپس این سلول‏ها تحت تاثیر تنش حرارتی قرار داده شده و با استفاده از غلظت‏های مناسب اسید آلفا لیپوئیک و پروپیونات کروم بصورت مستقل و همزمان تیمار گردیدند. سپس زنده‏مانی سلول‏ها، بیان آنزیم‏ها و ژن‏های درگیر در فرایندهای استرس اکسیداتیو در گروه‏های مختلف بررسی و مقایسه شد.

استفاده از آنتی‏اکسیدان‏ها ممکن است ابزار مفیدی برای هومئوستازی یا متعادل کردن مراحل رشد و نموی سلول‏ها باشد، بنابراین آن‏ها می‏توانند منبع موثری در استراتژی‏های درمانی محسوب گردند. دو مولکول آنتی‏اکسیدان طبیعی (یعنی اسید آلفا لیپوئیک و اسید کافئیک)، پتانسیل خوبی به‏عنوان مهارکننده‌های رشد سلول‌های تومور در شرایط آزمایشگاهی با اثر سمی وابسته به دوز و زمان دارند. نتایج مطالعات قبلی تایید کرد که کاهش قابل توجهی در تکثیر سلول‌های HepG2 پس از 72 ساعت انکوباسیون با اسید آلفا لیپوئیک (100-500 میکرومولار) نشان ‌داد (37). همچنین گزارش شده است α-LA از طریق باند شدن با مس سمیت عصبی ناشی از مس را در کشت‌های سلولی کاهش می‌دهد (36). انتقال نانوکروم، پیکولینات کروم و کلرید کروم در سلول‏های Caco-2، وابسته به غلظت، زمان و مستقل از دما بود، که نشان‌دهنده فرآیندهای انتقال غیرفعال در تک‌لایه‌های سلولی Caco-2 است. علاوه‏بر این کروم به شکل پیکولینات کروم بهتر از کلرید کروم معدنی در سلول‌های Caco-2 منتقل می‌شود (39). کوبان و همکاران (2017) گزارش کردند که α-LA و DHLA قادر به کاهش زنده ماندن سلول‏های سرطان به روشی وابسته به غلظت هستند. پس از 24 ساعت درمان با 100 و 500 میکرومولار α-LA و DHLA، زنده ماندن سلول‏ها (سرطان سینه MCF-7) بطور معنی‏داری کاهش یافت (26).

تنش اکسیداتیو با تولید رادیکال‏های آزاد بیش از حد مشخص می‏شود (7). چندین سیستم آنتی‏اکسیدانی موثر در کنار هم برای جلوگیری از آسیب اکسیداتیو کار می‏کنند. دفاع آنتی‏اکسیدانی آنزیمی و غیر آنزیمی شاملSOD، GST، CAT، GSH، GPX، α-توکوفرول، ویتامین C، بتاکاروتن و ویتامین A است (25).

SOD اصلی‌ترین آنزیم دفاعی است که تبدیل رادیکال‌های سوپراکسید به پراکسید هیدروژن را کاتالیز می‌کند (17). CAT بهمراه SOD بخشی از سیستم آنتی‏اکسیدانی است و در تثبیت تولید رادیکال‏های آزاد بیش از حد تولید شده در پاسخ به تنش گرمایی نقش دارد. کاتالاز تجزیه پراکسید هیدروژن تولید شده توسط SOD به آب و اکسیژن مولکولی را کاتالیز می‌کند. مطالعات قبلی نشان داده‏اند که قرار گرفتن در معرض دمای بالای محیط به دلیل ایجاد آسیب بافتی و ضایعات در سلول‏ها باعث افزایش فعالیت SOD، GSH-Px و CAT در سرم، کبد و ماهیچه جوجه‏های گوشتی می‏شود (3). مکانیسم افزایش این سیستم‏های آنزیمی بسیار مهم است. قرار گرفتن در معرض افزایش دما باعث تولید رادیکال‏های آزاد بیش از حد می‏شود و برای مقابله با ضررهای آن، اقدام محافظتی کوتاه مدت از طریق سیستم آنتی‏اکسیدانی با آزادسازی آنزیم‏هایی مانند SOD، GSH-Px و CAT انجام می‏شود (28).

فعالیت گلوتاتیون S-ترانسفراز (GST) با تجویز 300 میلی‏گرم در کیلوگرم  α-LAدر بافت معده در معرض ایندومتاسین افزایش یافت. برخلاف بافت‏های تحت درمان با ایندومتاسین، α-LA، لانزوپرازول و رانیتیدین باعث افزایش فعالیت SOD و کاهش فعالیت CAT شدند (23). α-LA ممکن است به‏عنوان یک عامل پیشگیرانه در نظر گرفته شود که آنزیم GST را فعال می‏کند. آنزیم‏های متصل به GSH، و GSH در بافت‏ها، به‏ویژه GPx و GST، به‏عنوان عوامل پیشگیرانه بالقوه برای خواص آنتی‏اکسیدانی و سم‏زدایی آن‏ها پیشنهاد شده‏اند (25). کاپلان و همکاران (2012)، گزارش کردند α-LA اثر بهبود بخشی بر سیستم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی در برابر آسیب‌های اکسیداتیو در بافت معده موش‌ دارد. همچنین این اثرات محافظتی گوارشی و آنتی‏اکسیدانی α-LA متناسب با دوز افزایش می‏یابد که نشان می‏دهد α-LA اثرات خود را بصورت وابسته به دوز اعمال می‏کند.

در دهه گذشته، تعداد فزاینده‏ای از تحقیقات با تمرکز بر اثر مکمل α-LA بر سیستم دفاع آنتی‏اکسیدانی در جوجه‏ها انجام شده است. گزارش شده است استفاده از α-LA (500 میلی‌گرم/کیلوگرم در جیره) جوجه‌های گوشتی باعث افزایش فعالیت آنزیم‏های SOD، GPx و کاهش فعالیت MDA پلاسما می‌شود (12). علاوه‏بر این، نشان داده شده است که استفاده از 300 میلی‏گرم بر کیلوگرم α-LA قابلیت آنتی‏اکسیدانی را افزایش می‏دهد و استرس اکسیداتیو در کبد و ماهیچه‏های جوجه‏ گوشتی نر نژاد راس را مهار می‏کند (9). مطالعات قبلی نشان داده‏اند که تجویز داخل صفاقی α-LA (16-5 میلی‏گرم بر کیلوگرم در روز) به مدت 11 روز منجر به افزایش سطح گلوتاتیون کلیه در موش صحرایی می‏شود (8). استفاده از α-LA باعث افزایش قابل توجهی در فعالیت GPx کلیه و کبد و کاهش قابل توجه در سطوح SOD کلیه، کبد و قلب موش، در مقایسه با گروه‏های تحت تنش و کنترل شد (31). با این حال تغییرات ناشی از α-LA در فعالیت آنزیم‏های آنتی‌اکسیدانی، مانند افزایش GPx و کاهش SOD، در بافت‌های محیطی موش ممکن است به اثرات همه‌کاره آن‌ها که در سیستم اندام‏های مختلف مشاهده می‌شود کمک کند. یعنی اثر سودمند یا پرواکسیدانت α-LA نه تنها به شرایط مدل مرتبط با تنش اکسیداتیو، بلکه به بافتی که برای محافظت در نظر گرفته شده است نیز بستگی دارد.

ایمنی یکی از جنبه‏های مهم طیور به دلیل ارتباط مستقیم آن با عملکرد تولید است. گزارش‌های قبلی نشان داده‌اند که ایمنی تحت دمای بالای محیط سرکوب می‌شود (10). سیتوکین‏ها و گیرنده‏های Toll مانند (TLRs) نشانگرهای مهم ایمنی هستند. سیتوکین‏ها بر تنظیم ایمنی از طریق سلول‏های خون‏ساز نقش دارند. همچنین دفاع میزبان و هموستاز را تسهیل می‎‏کنند (22). آن‏ها عمدتا شامل اینترفرون‏ها، اینترلوکین‏ها، فاکتورهای رشد (TGFs)، TNFs و کموکین‏های پپتیدی کوچک هستند.

سیتوکین‏ها پروتئین‏های کد کننده ژن ایمنی ضروری هستند که به‏عنوان مولکول‏های سیگنال‏دهی درون‏زا شناخته شده‏اند؛ که با چارچوب دفاع سلولی در برابر پاسخ التهابی ناشی از افزایش دما تداخل دارند (20). IL‏ها جزء گروه سیتوکین‏ها هستند که نقش عمده‏ای در تحریک پاسخ‏های ایمنی و التهاب دارند. آن‏ها از IL-1 تا IL-17 طبقه‏بندی شده‏اند و برای هر نوع نقش خاصی دارند. علاوه‏بر این، IL1، IL-2، IL-6، IL-8 و TNFα متعلق به خانواده سیتوکین‏های پیش التهابی هستند. آن‏ها نقش فعالی در پاسخ التهابی تحت دمای بالای محیط دارند (19). بیان این سیتوکین‏های پیش التهابی تحت تنش گرمایی، احتمالا از طریق فعال کردن عملکردهای ایمنی از طریق افزایش تکثیر لنفوسیت‏ها و ماکروفاژها در دمای بالای محیط، افزایش می‏یابد (18). بیان بیش از حد و افزایش تکثیر ممکن است منجر به آسیب بافت شود. به خوبی شناخته شده است که ویتامین‏ها به کاهش اثرات منفی بر عملکرد رشد و ایمنی در پاسخ به تنش گرمایی به دلیل عملکرد سرکوب کننده آن‏ها در برابر بیان سیتوکین‏های پیش التهابی کمک می‏کنند (38). بنابراین، در مناطق گرمسیری، مکمل این ویتامین‏های آنتی‏اکسیدانی در جیره غذایی بسیار توصیه می‏شود. در یک مطالعه اخیر، گزارش شده است که تنش گرمایی حاد در دمای 40 درجه سانتی‏گراد به مدت 7 ساعت باعث افزایش بیان ژن IL-15 طحال در مرغ می‏شود (35). این نشان می‏دهد که IL-15 به سرعت به تنش گرمایی واکنش نشان می‏دهد تا با تکثیر سلول‏های ایمنی به جوجه کمک کند تا هومئوستاز را حفظ کند.

تنش اکسیداتیو، که از عدم تعادل بین سیستم‏های اکسیدان و آنتی‏اکسیدان ناشی می‏شود، باعث آسیب به سلول‏ها و بافت‏ها در حیوانات می‏شود (7). در عین حال، نشان داده شده است که عدم تعادل در حالت تنش اکسیداتیو سطوح بیان ژن‌های مرتبط با آپوپتوز را افزایش می‌دهد و باعث ایجاد یک سری مسیرهای سیگنالینگ می‌شود (2).

جاین و کانان (2001) نشان دادند که استفاده از کروم (1000 نانومول در لیتر) از تحریک ترشح TNF-α توسط اکسیدان شناخته شده H2O2 در سلول‏های مونوسیتی کشت شده جلوگیری می‏کند. بطور مشابه، مکمل کروم از افزایش تنش اکسیداتیو در مونوسیت‏های تیمار شده با گلوکز بالا و H2O2 جلوگیری کرد. این نشان می‏دهد که اثر مهاری کروم بر ترشح TNF-α در مونوسیت‏های تیمار شده با گلوکز بالا ممکن است با اثر بازدارندگی کروم بر تنش اکسیداتیو مرتبط باشد. در نتیجه، مطالعه آن‏ها برای اولین بار نشان دادند که کروم ترشح TNF-α را در مدل کشت سلولی مونوسیت U937 تحت درمان با گلوکز بالا مهار می‌کند. مطابق با نتایج فوق نتایج پژوهش حاضر نشان داد که شرایط تنش گرمایی و تنش اکسیداتیو ناشی از آن سبب افزایش بیان نشانگرهای التهابی می‏شود. در حالی که استفاده از افزودنی‏های آنتی‏اکسیدان (اسید آلفا لیپوئیک و پروپیونات کروم) از طریق کاهش بیان ژن‏های پیش التهابی می‏تواند سبب بهبود پاسخ ایمنی گردد.

بطورکلی نتایج بررسی حاضر استحصال موفق سلول‏های بنیادی مزانشیمی با شکل کشیده و دوکی، مورفولوژی فیبروبلاستی، تمایل بالای سلول‌ها جهت اتصال و تکثیر را نشان ‌داد. به‏علاوه این سلول‏ها در شرایط تمایزی به سلول‏های استئوبلاست و آدیپوسایت تبدیل می‏شوند. این نتایج اولین گزارش استفاده از ترکیبات آنتی‏اکسیدان در کشت سلول‏های بنیادی تحت شرایط تنش گرمایی را ارائه می‏کند. نتایج این مطالعه نشان داد استفاده همزمان از مکمل‏های کروم و اسید آلفا لیپوئیک در تیمار سلول‏های BMSCs تحت تنش حرارتی از طریق بهبود وضعیت آنتی‏اکسیدانی اثرات مثبتی بر زنده‏مانی، عملکرد بیوشیمیایی و پاسخ ایمنی این سلول‏ها داشته است. افزودن مکمل پروپیونات کروم با غلظت 100 میکرومولار در کشت سلول‏های BMSCs تحت تنش حرارتی باعث کاهش معنی‏دار بیان اینترفرون گاما، اینترلوکین‏های 2 و6 و همچنین افزایش معنی‏دار سطح آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانی مانند سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز گردید؛ که این تاثیرات با افزودن همزمان اسید آلفا لیپوئیک تغییرات معنی‏داری را در جهت بهبود فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانی و خواص ضدالتهابی نشان داد.

بنابراین به دلیل نقش اسید آلفا لیپوئیک و پروپیونات کروم در بهبود فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدان و افزایش پاسخ ایمنی می‏توان با افزودن این مکمل‏ها به جیره جوجه‎های گوشتی سبب کاهش تنش اکسیداتیو ناشی از تنش حرارتی در آن‏ها گردید. همچنین استفاده از این ترکیبات در جهت تحقیقات کاربردی در زمینه پرورش پرندگان مقاوم در برابر تنش‏های محیطی و بیماری‏ها پیشنهاد می‏گردد.

سپاسگزاری

بدین‎وسیله از مسئولان دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان بسبب فراهم کردن امکانات پژوهشی انجام این تحقیق، قدردانی بعمل می‏آید.