مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

بررسی تنوع گونه ای حلزون های خشکی زی (Mollusca: Gastropoda) اثر ملی طبیعی جنگل خشکه داران در استان مازندران با استفاده از تکنیک DNA بارکدینگ

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم ها، پژوهشکده علوم محیطی، دانشگاه شهید بهشتی،‌ تهران

2 گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم ها،‌ پژوهشکده علوم محیطی،‌دانشگاه شهید بهشتی، تهران

چکیده

حلزون‌های خشکی‌زی به‌عنوان یکی از متنوع‌ترین جانوران کره زمین در زیستگاه‌های مختلفی از جمله جنگل‌ها یافت می-شوند. یکی از مهم‌ترین زیستگاه‌های این گروه از نرم‌تنان جنگل‌های هیرکانی واقع در شمال ایران می‌باشد. این پژوهش به شناسایی حلزون‌های خشکی‌زی ساکن در جنگل خشکه‌داران که از مهم‌ترین زیستگاه‌های ناحیه هیرکانی محسوب می‌شود با به کارگیری دو رویکرد ریخت شناختی و بارکدینگ DNA پرداخت. در ابتدا نمونه های جمع‌آوری شده بر اساس ویژگی‌های ریخت شناسی صدف حلزون‌ها از جمله اندازه و رنگ صدف،‌ دیسکی یا مخروطی بودن صدف ، داشتن درپوش دریچه صدف و وجود یا عدم وجود ناف در سطح خانواده شناسایی شدند. سپس از هر خانواده 2 تا 3 فرد جهت انجام مطالعات ژنتیکی انتخاب شدند.‌ توالی‌های مورد نظرجهت انجام آنالیزهای ژنتیکی شامل محاسبه مدل تکاملی،‌ محاسبه فاصله ژنتیکی و در نهایت رسم درخت تبار شناختی پس از انجام مراحل آزمایشگاهی مربوط به تکثیر ژن COI بدست آمدند. نتایج نشان داد نمونه‌های جمع‌آوری شده متعلق به چهار خانواده، ‌پنج جنس و شش گونه می‌باشند. همچنین به دلیل عدم وجود توالی مشابه با نمونه مربوط به گونه Caspicyclotus sieversi شناسایی این حلزون با استفاده از ویژگی‌های ریخت شناسی صورت پذیرفت. این مطالعه به‌عنوان اولین مطالعه بارکدینگ بر روی حلزون‌های جنگل‌های هیرکانی منجر به دست‌یابی به اطلاعات جدیدی در مورد تنوع زیستی این ناحیه شده است. با گسترده‌تر کردن نواحی مورد بررسی به همراه بررسی آماری جوامع حلزون می‌توان به اطلاعات جامعی در مورد تنوع زیستی این منطقه دست یافت که در زمینه مدیریت زیستگاه و حفظ این اکوسیستم منحصر‌به‌فرد حائز اهمیت است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Investigating the species diversity of land snails (Mollusca: Gastropoda) of the natural monument Khoshkedaran forest in Mazandaran province using DNA barcoding technique

نویسندگان [English]

  • Sima Mohammadi 1
  • Faraham Ahmadzadeh 2

1 Department of Biodiversity and Ecosystem Management, Environmental Sciences Research Institute, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran

2 Department of Biodiversity and Ecosystem Management, Environmental Sciences Research Institute, Shahid Beheshti University, Tehran Iran

چکیده [English]

Land snails, known for their exceptional diversity inhabit various environments, including forests. The Hyrcanian forests in northern Iran are one of the most important habitats for this group of terrestrial mollusks. The main objective of this study was to identify land snails inhabiting the Khoshkedaran Forest, a significant habitat in the Hyrcanian area using both morphological taxonomy and DNA barcoding methods. Gathered samples were classified at the family level based on their morphological characteristics such as shell size and color, presence of operculum, and open or closed umbilicus. Subsequently, a subset of 2-3 individuals from each family underwent genetic analysis. Following laboratory procedures, the obtained genetic sequences underwent thorough analysis, including the determination of an evolutionary model, calculation of genetic distances, and constructed phylogenetic tree. The collected samples could be categorized into four families, five genera, and six species. No sequences in the Gene Bank matched the sequence attributed to Caspicyclotus sieversi. Therefore, the identification of this species was reliant on morphological techniques. Being the first DNA barcoding study on land snails in the Hyrcanian forests, this research has offered significant contributions to understanding the biodiversity of the region. By extending the scope of the study to encompass a broader area and employing more comprehensive statistical analyses of snail populations, we can obtain detailed information on the land snail diversity within the Hyrcanian forests. This valuable information plays a pivotal role in the effective management and conservation of this exceptional ecosystem.

کلیدواژه‌ها [English]

  • land snails
  • DNA barcoding
  • Hyrcanian Forest
  • biodiversity
  • morphology

بررسی تنوع گونه­ای حلزون­های خشکی­زی (Mollusca: Gastropoda) اثر ملی طبیعی جنگل خشکه­داران در استان مازندران با استفاده از تکنیک DNA بارکدینگ

سیما محمدی و فراهم احمدزاده*

ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، ‌پژوهشکده علوم محیطی،‌ گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم­ها

تاریخ دریافت: 31/04/1402          تاریخ پذیرش: 13/07/1402

چکیده

حلزون­های خشکی­زی که به­عنوان یکی از متنوع­ترین جانوران کره زمین شناخته شده­اند به­دلیل ویژگی­های اکولوژیکی خود نقشی کلیدی در حفظ پایداری اکوسیستم­ها ایفا می­کنند. این گونه­ها در زیستگاه­های مختلفی از جمله جنگل­ها یافت می­شوند. یکی از مهم­ترین زیستگاه­های این گروه از نرم­تنان جنگل­های هیرکانی واقع در شمال ایران می­باشد. این پژوهش به شناسایی حلزون­های خشکی­زی ساکن در جنگل خشکه­داران که از مهم­ترین زیستگاه­های ناحیه هیرکانی محسوب می­شود با بکارگیری دو رویکرد ریخت شناختی و بارکدینگ DNA پرداخت. در ابتدا 135 نمونه جمع­آوری شده بر اساس ویژگی­های ریخت شناسی صدف حلزون­ها شامل اندازه صدف،‌ رنگ صدف،‌ دیسکی یا مخروطی بودن صدف،‌ داشتن درپوش دریچه،‌شکل دریچه صدف و وجود یا عدم وجود ناف در صدف در سطح خانواده شناسایی شدند. سپس از هر خانواده 2 تا 3 فردجهت انجام مطالعات ژنتیکی انتخاب شدند.‌ توالی­های مورد نظرجهت انجام آنالیزهای ژنتیکی شامل محاسبه مدل تکاملی،‌ محاسبه فاصله ژنتیکی و در نهایت رسم درخت تبار شناختی پس از انجام مراحل آزمایشگاهی مربوط به تکثیر ژن COI بدست آمدند. نتایج بدست آمده مشخص نمود نمونه­های جمع­آوری شده متعلق به چهار خانواده، ‌پنج جنس و شش گونه می­باشند. همچنین بدلیل عدم وجود توالی مشابه با نمونه مربوط به گونه Caspicyclotus sieversi شناسایی این حلزون با استفادهاز ویژگی­های ریخت شناسی مربوط به صدف و بر اساس کلیدهای شناسایی موجود صورت پذیرفت. با این وجود تنوع زیستی منطقه، بالا ارزیابی نشده و غالبیت افراد جامعه متعلق به دو جنس Pyrenaearia و Schileykula بوده­اند. همچنین این دو جنس بهمراه جنس Theba‌ برای اولین بار در این پژوهش برای این منطقه گزارش شده­اند. این مطالعه به­عنوان اولین مطالعه بارکدینگ بر روی حلزون­های جنگل­های هیرکانی منجر به دست­یابی به اطلاعات جدیدی در مورد تنوع زیستی این ناحیه شده است. با گسترده­تر کردن نواحی مورد بررسی بهمراه بررسی آماری جوامع حلزون می­توان به طلاعات جامعی در ارتباط با تنوع زیستی حلزون­های جنگل­های هیرکانی دست یافت و گونه­های بومی این منطقه را پیش از حذف از طبیعت شناسایی نمود. اطلاعاتی از این دست در زمینه مدیریت زیستگاه و حفظ این اکوسیستم منحصر­به­فرد حائز اهمیت است.

واژه های کلیدی: حلزون­های خشکی­زی، بارکدینگ DNA،‌ جنگل­های هیرکانی، تنوع زیستی،‌ ریخت­شناسی

* نویسنده مسئول، تلفن:  29906001(021) ، پست الکترونیکی: F_ahmadzade@sbu.ac.ir

مقدمه

 

حلزون­های خشکی­زی، ‌متعلق به رده شکم­پایان بخش مهمی از تنوع زیستی اکوسیستم­ها را تشکیل می­دهند (9). این موجودات به‌طور گسترده‌ای در طیف مختلفی از زیستگاه­ها شامل جنگل‌، باغ‌، مزارع و کوهستان‌ یافت می‌شوند و پراکنش آن­ها وابسته به عوامل مختلفی می­باشد که از مهم­ترین آن­ها می­توان به رطوبت و دما اشاره نمود. علاوه بر این، ترکیب خاک زیستگاه به­ویژه در دسترس بودن کلسیم نیز از عوامل محدود کننده پراکنش آن­ها می‍باشد زیرا وجود کلسیم در رژیم غذایی آن­ها به­جهت بازسازی پوسته صدف حلزون­ها ضروری است (19، 21).

این نرم­تنان از اهمیت بالایی در زنجیره­های غذایی و در نتیجه حفظ تعادل زیستگاه خود برخوردارند. از یک سو، به­عنوان غذایی برای موجودات دیگر، از جمله پرندگان، حشرات و حیوانات کوچک عمل می‌کنند. از سویی دیگر با تجزیه مواد آلی به بازگشت عناصر ضروری حیات به طبیعت کمک می­کنند(13). می­توان اینگونه بیان کرد که حذف آن­ها می­تواند اثرات نامطلوبی را بر اکوسیستم برجای گذارد. به­عنوان مثال مطالعاتی که در اروپا انجام شد کاهش جمعیت پرندگان را مرتبط با از بین رفتن حلزون­های خشکی به دلیل بارش باران­های اسیدی دانستند (7، 18).

تحرک کم حلزون­ها سبب شده تا این موجودات به تغییرات محیط اطراف خود از جمله تغییر در شرایط اقلیمی و یا ترکیب خاک منطقه حساس باشند و به آن­ها واکنش نشان دهند. این واکنش­ها در گونه­های مختلف حلزون­ها متفاوت است و می­تواند بصورت تغییر در رنگ پوسته صدف، تغییر محدوده پراکنش و یا حتی حذف یک گونه از اکوسیستم باشد. این ویژگی سبب شده است تا حلزون­ها خشکی­زی بعنوان شاخص مناسبی برای ارزیابی وضعیت اکوسیستم­ها در نظر گرفته شوند به گونه­ای که با بررسی تنوع زیستی و همچنین ترکیب جوامع آن­ها می­توان به اطلاعات ارزنده­ای در ارتباط با کیفیت زیستگاه­شان دست پیدا کرد و همچنین زیستگاه­های مختلف را با یکدیگر مقایسه نمود (33).

در ارتباط با اهمیت اقتصادی این موجودات می­توان به این موارد اشاره نمود که از نوروتوکسین­هایی که در غدد بزاقی آن­ها تولید می­شود برای تولید داروها در علم پزشکی استفاده می­شود. علاوه بر این حلزون‌های خشکی­زی می‌توانند با تغذیه‌شان بر روی گیاهان از گسترش برخی آفات کشاورزی جلوگیری کنند. از سویی دیگر برخی از گونه­های حلزون، گاه خود به­عنوان آفت محصولات زراعی و باغ­ها عمل می­کنند و باعث بروز خساراتی می­شوند (32). با در نظر گرفتن اهمیت زیست­محیطی و اقتصادی این گروه از جانوران با مطالعه بر روی آن­ها می­توان به اطلاعات ارزنده­ای دست یافت که هم در زمینه حفظ تنوع زیستی و هم در زمینه کنترل آفات حائز اهمیت می­باشند.

یکی از مهم­ترین زیستگاه­های این موجودات در ایران جنگل­های هیرکانی است این جنگل­ها یکی از مهم ترین بازماندگان جنگل­های سنوزوئییک می­باشند و پناهگاه گونه­ها­ی متنوعی در آخرین عصر یخبندان بوده­اند و بسیاری از گروه­های گیاهی از جمله Pterocarya، Albizia و Parrotia از آن زمان تنها در این منطقه باقی مانده­اند (37). تا کنون تحقیقات اندکی بر روی حلزون­های جنگل­های هیرکانی در ایران صورت پذیرفته است. این مطالعات که به شناسایی حلزون­های خشکی زی جنگل­های شمال ایران پرداخته­اند منجر به گزارش حدود 40 گونه حلزون در شمال ایران شده است (1، 2،‌ 5، 6،‌ 14، 16، 20، 36). شایان ذکر است در تمامی مطالعات صورت گرفته شناسایی حلزون­ها بر اساس ویژگی­های ریخت­شناسی صدف آن­ها بوده است. ویژگی­های ظاهری صدف که بمنظور شناسایی حلزون­های خشکی­زی مورد استفاده قرار می­گیرند عبارتند از: جهت چرخش صدف(راستگرد و یا چپگرد)، مخروطی و یا دیسکی بودن صدف، رنگ صدف، وجود و یا عدم وجود برجستگی، پرز و یا طرح(خط، خال و ..) در سطح پوسته صدف،‌ وجود و یا عدم وجود درپوش بر روی دریچه صدف، جنس و شکل درپوش صدف، شکل دریچه صدف، صاف و یا برگشته بودن دریچه صدف، باز و یا بسته بودن ناف صدف و اندازه آن و تعداد پیچ­های صدف (8). همانطور که پیش­تر ذکر شد صدف حلزون­ها ممکن است تحت تاثیر شرایط محیطی قرار گیرد و دچار تغییراتی ظاهری شود به این معنی که برخی از گونه­ها مختلف حلزون­ها مانند بسیاری دیگر از جانوران ممکن است ظاهری مشابه داشته باشند اما ساختار ژنتیکی متفاوتی داشته باشند و یا بالعکس در نتیجه شناسایی آن­ها تنها بر اساس ویژگی­های ظاهری ممکن است منجر به اشتباه و شناسایی نادرست شود که بدنبال آن سبب ارزیابی نادرستی از تنوع زیستی منطقه شود که از لحاظ تصمیمات حفاظتی حائز اهمیت است (25،‌ 27، 34). جهت غلبه بر این مشکل و برطرف نمودن عدم قطعیت­ها در شناسایی، در سال­های اخیر استفاده از روش­های شناسایی مولکولی (بارکدینگ DNA) به­عنوان ابزاری دقیق و سریع جهت شناسایی گونه­های مختلف جانوری از جمله حلزون­ها بسیار مورد توجه قرار گرفته است (17، 26).

در این پژوهش تنوع زیستی حلزون­های جنگل خشکه­داران، به­عنوان یکی از منحصر­به­فرد ترین مناطق ناحیه هیرکانی از نظر تنوع زیستی، مورد بررسی قرار گرفته است. جهت افزایش قطعیت در نتایج، شناسایی حلزون­ها با به­کار گیری تکنیک بارکدینگ DNA با استفاده از ژن COI صورت پذیرفت. از آنجایی که این پژوهش اولین مطالعه بارکدینگ بر روی حلزون­ها در محدوده­ی مورد مطالعه می­باشد می­تواند منجر به یافتن اطلاعات جدیدی در ارتباط با ترکیب جوامع حلزون­های جنگل­های خشکه­داران شود که در زمینه مدیریت این اکوسیستم منحصر به فرد شایان توجه باشد.

مواد و روشها

منطقه مورد مطالعه: اثر طبیعی ملی خشکه داران با مساحتی حدود 265 هکتار در استان مازندران در کیلومتر 12 جاده تنکابن-چالوش و در شرق شهرنشتارود در شمال کشور ایران قرار گرفته است (شکل 1). طول جغرافیای منطقه از´´30 ´02 °51 تا ´´00 ´05 °51 و عرض جغرافیایی ´´30 ´42 °36 تا ´´00´45 °36 می­باشد. اقلیم این منطقه با متوسط دمای 16 درجه سانتیگراد و بارندگی سالیانه 1100 میلی­متر مرطوب و معتدل می­باشد. این جنگل جلگه­ای و بکر از آخرین بازمانده های اکوسیستم های جنگلی جلگه ای شمال ایران به­شمار می­رود و زیستگاه گونه­های گیاهی و جانوری مختلفی است که از دیرباز در این منطقه می­زیسته­اند. از جمله این گونه­ها ی با اهمیت می­توان به توسکا، ممرز، بلوط، ‌گربه وحشی حواصیل خاکستری و باکلان اشاره نمود. ویژگی­های زیست­محیطی خاص این منطقه سبب گشته تا از سال 1354 تحت عنوان اثر طبیعی ملی مورد حفاظت قرار گیرد (3). این جنگل بخشی از جنگل­های هیرکانی به شمار می­رود که بدلیل شرایط زیستگاهی خاص و تنوع زیستی منحصر­به­فرد به­عنوان یکی از مهم­ترین بیوم­های کره زمین شناخته می­شود. شایان ذکر است این جنگل­ها بدلیل خدمات اکوسیستمی ارزشمندی که ارائه می­دهند بر روی زندگی مردم بومی منطقه نیز تاثیرگذارند. حفظ این اکوسیستم در گرو شناخت کامل تنوع زیستی این منطقه و بدنبال آن مدیریت مناسب جهت حفظ این ذخیرهگاه زیست­کره می­باشد (37).

نمونه­برداری: حلزون­ها بدلیل نیازهای زیست­محیطی خود یعنی وابستگی به رطوبت و دمای معتدل شب­فعال می­باشند و همچنین معمولا درفصل­های سرد و گرم سال در صدف خود پنهان شده و به خواب می­روند و با مساعد شدن شرایط مجددا فعالیت خود را از سر گیرند لذا فصل بهار زمان مناسب­تری جهت نمونه­برداری از این گونه­ها بمنظور بررسی تنوع زیستی آن­ها می­باشد (30) با توجه به این موارد نمونه­برداری از حلزون­ها در بهار سال 1400 و در روزهای ابری صورت پذیرفت. نمونه­ها از روی سطح خاک، تنه درختان، تنه­های در حال پوسیدن درختان و سنگ­ها از سه ایستگاه مختلف در محدوده حفاظت شده جنگل خشکه­داران واقع در عرض­های جغرافیایی با دست جمع­آوری شدند. بجهت انتقال 135 نمونه جمع­آوری شده به آزمایشگاه ابتدا آن­ها بمدت یک روز در آب قرار گرفتند و پس از آن به ظرف حاوی الکل اتانول 96% منتقل شدند.

استخراج DNA و واکنش زنجیره­ای پلیمراز: نمونه­های جمع­آوری شده بر اساس ویژگیهای ریخت شناسی با استفاده از کلیدهای شناسایی معتبر (14، 15، 26) در سطح خانواده شناسایی شدند و از هر خانواده 2 تا 3 فرد برای مطالعات بارکدینگ انتخاب شد. در مرحله بعد استخراج DNA با استفاده از روش استاندارد نمکی انجام شد (31) و جهت بررسی کیفیت DNA استخراج شده، از روش اسپکتروفوتومتری (نانودراپ) استفاده شد. پس از آن تکثیر ژن سیتوکروم اکسیداز زیرواحد I  (Cytochrome oxidase I (COI)) با استفاده از فرآیند واکنش زنجیره­ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction (PCR)) صورت پذیرفت. آغازگرهای مورد استفاده در این مطالعه شامل (15) LCO 1490/HCO 2198 بودند. واکنش زنجیره­ای پلیمراز در حجم 25 میکرو­لیتر شامل 1 میکرو­لیتر DNA،‌ 5,0 میکرو­لیتر آغازگر پیشرو(Primer forward) ،‌5,0 میکرو­لیتر آغازگر پسرو (Primer revearse)، ‌5,12 میکرو­لیتر Mastermix Red و 5,10 میکرولیتر آب مقطر انجام گرفت.

شرایط انجام چرخه این واکنش بدین شرح می­باشد: واسرشت­سازی اولیه در درمای C °94 بمدت 5 دقیقه، واسرشت در درمای C °94 بمدت 30 ثانیه،‌ اتصال آغازگر در درمای C °72 بمدت 30 ثانیه (35 چرخه)، طویل­سازی در درمای C °49 بمدت 1 دقیقه،‌ طویل­سازی نهایی در درمای C °72 بمدت 5 دقیقه و خنک شدن درمای C °25 بمدت 5 دقیقه. در نهایت کیفیت محصولات PCR با استفاده از ژل آگارز 1% بررسی شد و آمپلیکون­های با کیفیت مناسب برای توالی یابی به شرکت پیشگام (تهران، ایران) ارسال شد. در نهایت تمامی توالی­های به­دست آمده در پایگاه بانک ژن (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ثبت شدند (جدول 1).

آنالیزهای ژنتیکی: توالی­های خام DNA (کاروماتوگراف)‌ به­دست آمده از 10 فرد با استفاده از (www.geneious.com) Geneious Prime v. 2022.1.1 ویرایش شدند. هم­ردیف­سازی توالی­های ویرایش شده با استفاده از نسخه تحت وب MAFFT صورت پذیرفت (23). مدل TIM1+I+G به­عنوان بهترین مدل تکاملی با به­کارگیری نرم­افزار MrModeltest V.2.3 با استفاده از معیار آکاییکه (Akaike) انتخاب شد (Nylander, 2004). در گام بعدی درخت تبار­شناختی با به­کارگیری آنالیز بیزین (BI) با استفاده از نرم­افزارMrBayes  نسخه .2 .3 (35) ترسیم شد (گونه Enchytraeidae sp  به­عنوان ریشه درخت انتخاب شد). فاصله ژنتیکی اصلاح نشده (P-distance) میان افراد نیز با استفاده از نرم افزارMEGA V.11 محاسبه شد.

بمنظور مشخص نمودن تعداد واحدهای عملیاتی طبقه­بندی (OTU= Operational taxonomic unit) موجود در مجموعه داده­ها روش­های آماریABGD  (automatic barcode gap discovery)(30) و bPTP (Bayesian implementation of the Poisson tree processes)(39) به­کار برده شد. تجزیه و تحلیل ABGD یک روش خوشه­بندی بر اساس فاصله زوجی بین توالی­ها جهت تعیین مرز گونه­ها (Species delimitation) است و بر روی وب سرور (40) با استفاده از فاصله کیمورا (K80) با نسبت Ts/Tv = 2,0 (پیش­فرض) و شرایط زیر انجام شد: محدوده واگرایی درون گونه­ای پیشین از 0.01 (Pmin) تا 0.1 (Pmax) با 20 مرحله میانی، X (وسعت گپ نسبی): 0.05 و = Nbin 10 (25). bPTP یک روش مبتنی بر درخت است که به درخت فیلوژنتیک غیر اولترا متریک بعنوان ورودی نیاز دارد (24). تجزیه و تحلیل بر روی وب سرور bPTP (41) و شرایط پیش فرض آن انجام شد.

نتایج

شناسایی حلزون­ها: نمونه­های حلزون­های جمع­آوری شده ابتدا بر اساس ویژگی­های ریخت شناسی از جمله تعداد پیچ­های صدف، چپ­گرد یا راست­گرد بودن صدف، وجود یا عدم وجود دریچه صدف و شکل صدف با کمک کلید­های شناسایی موجود (13، 14، ،26) در سطح خانواده شناسایی شدند. شناسایی اولیه­ی نمونه­های جمع­آوری شده بر اساس ویژگی­های ریخت­شناسی مشخص نمود حلزون­های مورد مطالعه متعلق به چهار خانواده­ی Orculidae, Helicidae, Hygromiidae وCyclophoridae  می­باشند، ویژگی­های ریخت شناسی آن­ها به شرح زیر می­باشد:

خانواده Hygromiidae : خانواده Hygromiidae (Tryon, 1866) دارای صدف دیسکی است و اندازه صدف آن کوچک تا متوسط می­باشد و در بین جنس­های مختلف آن از mm 7 تا mm 25 متغیر است. طول صدف کوچک­تر از عرض آن و رنگ صدف قهوه­ای روشن و گاهی مایل به زرد است. پوسته صدف دارای خطوط و شیارهایی می­باشد که آن­ها را از سایر گروه­های با صدف گرد متمایز می­کند. دهانه صدف معمولا گرد و یا بیضی شکل است و لبه صدف اندکی برگشته و زاویه دار است. دارای ناف باریکی است که در بعضی جنس­ها توسط لبه برگشته صدف پوشانده می­شود. نقطه اتصال دو قسمت ابتدایی و انتهایی دهانه صدف ضعیف است و بوسیله کالوس به هم متصل شده­اند، در برخی جنس­ها این دو قسمت بهم متصل نشده­اند. این خانواده از حلزون­ها در سراسر اروپا، بخش­هایی از آمریکای شمالی و بخش­هایی از آسیا از جمله ایران و ترکیه پراکنده شده­اند.

خانواده Helicidae : حلزون­های خانواده  Helicidae (Ferussac, 1822)دارای صدف گرد و مسطح می­باشند. اندازه صدف کوچک تا متوسط و با تعداد پیچ­های کم است و اندازه آن­ها از mm 10 تجاوز نمی­کند. سطح صدف صاف و بدون برآمدگی و خطوط برجسته می­باشد. دریچه صدف بشکل دایره­ای،‌نیم­دایره­ای و یا نیمه بیضی می­باشد و با درپوشی شاخی و یا آهکی بسته می­شود. ناف صدف با کالوس پوشیده شده است. بسیاری از گونه­ها ی این خانواده در مناطق گرمسیری (بجز آفریقا) پراکنده­اند و تعداد کمی از آن­ها نیز در مناطق معتدل زندگی می­کنند.

خانواده Orculidae : اعضای خانواده Orculidae (Pilsbry, 1918) بدلیل شکل خاص صدفشان متمایز تر از سایر حلزون­های خشکی­زی می­باشند. صدف آن­ها مخروطی کشیده و مورب است. طول صدف آن­ها بیشتر از عرض آن می­باشد. اندازه طول صدف کوچک و حداکثر mm 5 است. دریچه صدف ساده و بدون حاشیه و یا برگشتی است و همچنین این دریچه بدون درپوش می­باشد. محدوده­ی پراکنش آن­ها اروپا ،آمریکا، هند، ترکیه و بخش­هایی از شمال ایران می­باشد.

خانواده Cyclophoridae : صدف خانواده  Cyclophoridae (Gray, 1847)راستگرد ، تقریبا مخروطی کوتاه ودر بعضی موارد‌ با برآمدگی کم و بشکل دیسکی می­باشد. عرض صدف بیشتر از طول آن است. اندازه صدف آن­ها معمولا کوچک (mm 10) و متوسط (mm‌ 10 تا mm 30) و بندرت بزرگ (mm  30 تا mm 50) می­باشد. بدنه ‌صدف معمولا خطوط یا برجستگی­هایی دارد و دارای ناف است. دریچه صدف با درپوش دایره ای بسته می­شود. این درپوش غالبا شاخی و گاهی اوقات نیز آهکی است. لبه­ی دریچه صدف بزرگ و برگشته است، گونه های متعددی ‌از این خانواده در مناطق گرمسیری آفریقا، آسیا، استرالیا و جزایر مجاور پراکنده شده­اند. همچنین یک گونه از آن در شرق قفقاز و شمال ایران زندگی می­کند.

از میان 12 فرد انتخاب شده بمنظور مطالعات بارکدینگ نتایج توالی­یابی مربوط به 10 نمونه، دارای کیفیت مناسب جهت انجام آنالیزهای ژنتیکی بودند. بلاست 10 سکانس مورد بررسی در سایت NCBI مشخص نمود که نه فرد از آن­ها متعلق به چهار جنس مختلف به نام­های Caucasotachea, Pyrenaearia Theba و Schileykula می‍باشند. با توجه به گسترده نبودن داده­های توالی­یابی شده مربوط به حلزون­های خشکی­زی در پایگاه بانک ژن، برای یکی از نمونه­ها با کد شناسایی ES3388 توالی مشابهی در بانک ژن وجود نداشت. در نتیجه شناسایی این نمونه با کمک ویژگی­های ظاهری آن انجام شد و بر اساس کلیدهای شناسایی موجود، مشخص شد این نمونه به جنس و گونه Caspicyclotus sieversi تعلق دارد که ویژگی­های ریخت­شناسی این جنس به شرح زیر می­باشد:

Caspicyclotus sieversi

صدف حلزون (Forcart, 1935) Caspicyclotus sieversi راستگرد و تقریبا گرد است اما راس آن برآمدگی کوچکی دارد و طول آن کوچک­تر از عرض آن می­باشد. اندازه صدف متوسط و قطر آن بین mm 5/6 تا mm 5/7 و ارتفاع آن بین mm 5 تا  mm5/6 است. رنگ صدف زرد مایل به خاکستری و یا خاکستری است و تعداد پیچ­های صدف 4-5/4 دور می­باشد همچنین آخرین پیچ صدف پهنای بیشتری از سایر پیچ­ها دارد. دیواره صدف تقریبا ضخیم بوده و خطوطی مورب بر روی آن قابل مشاهده است. دارای درپوش دایره­ای شکل ضخیم و آهکی است و دریچه صاف و بدون برگشتگی است علاوه بر این، صدف این جنس دارای ناف بزرگ می­باشد. حضور این حلزون در شرق گرجستان،‌ قفقاز و شمال ایران گزارش شده است.

لازم بذکر است تنها یک گروه از حلزون­ها بنام Caucasotachea luaranea به­وسیله بلاست تا سطح گونه شناسایی شدند (جدول 1). طبق نتایج حاصل از درخت بیزین شش دودمان در محدوده مورد مطالعه وجود دارد همچنین بوت استرپ میان دودمان­ها بالای 95% بوده است (شکل 2).

تعیین مرزهای گونه­ای: نتایج مربوط به تعیین مرزهای گونه­ای با استفاده از آنالیز ABGD و bPTP مشابه بودند و هر دو آنالیزتعداد شش OTU را در مجموعه داده­ها مشخص نمود (شکل 2). فاصله ژنتیکی بین OTU های مختلف بر اساس نتایج حاصل از آنالیزP-distance  بین 10% تا 32% تخمین زده شد. بیشترین فاصله ژنتیکی بین OTU 1 و OTU 6 و همچنین OTU 1 و  OTU 3مشاهده شد و کمترین فاصله ژنتیکی بین OTU 3 و  OTU 4گزارش شد (جدول 2). علاوه بر این، توپولوژی درخت بیزین با نتایج حاصل از ABGD‌ و bPTP همخوانی داشت.

ترکیب جامعه حلزون­ها: بررسی فراوانی هر یک از OTU های یافت شده در منطقه مورد بررسی نشان داد که OTU 3 وOTU 6  که بترتیب متعلق به جنس­های Pyrenaearia و Schileykula می­باشند غالبیت افراد جامعه را تشکیل می‍دهند. در مقابل OTU 1 که مربوط به گونه Caspicyclotus sieversi می­باشد کم­جمعیت­ترین گروه در جامعه مورد بررسی می­باشند(شکل 3).

 

 

جدول 1 - فهرست گونه­های شناسایی شده بهمراه کد شناسایی

Code ID

OTU

Accession Number

Family

Genus

Species

ES3388

OTU 1

OR189159

Cyclophoridae

Caspicyclotus

Caspicyclotus sieversi

ES3364

OTU 2

OR189161

Helicidae

Caucasotachea

Caucasotachea Leuaranea

ES3371

OTU 2

OR189162

Helicidae

Caucasotachea

Caucasotachea Leuaranea

ES3379

OTU 2

OR189168

Helicidae

Caucasotachea

Caucasotachea Leuaranea

ES3375

OTU 3

OR189165

Hygromiidae

Pyrenaearia

-

ES3376

OTU 3

OR189166

Hygromiidae

Pyrenaearia

-

ES3387

OTU 3

OR189169

Hygromiidae

Pyrenaearia

-

ES3377

OTU 4

OR189167

Hygromiidae

Pyrenaearia

-

ES3373

OTU 5

OR189164

Helicidae

Theba

-

ES3360

OTU 6

OR189160

Orculidae

Schileykula

-

جدول 2 - برآورد فاصله ژنتیکی اصلاح نشده (P-distance) بین گونه­های مختلف حلزون­های خشکی­زی در جنگل خشکه­داران

OTU 6

OTU 5

OTU 4

OTU 3

OTU 2

OTU 1

 

 

 

 

 

 

0

OTU 1

 

 

 

 

 

0.31

OTU 2

 

 

 

 

0.21

0.32

OTU 3

 

 

 

0.10

0.20

0.31

OTU 4

 

 

0.11

0.12

0.21

0.31

OTU 5

0

0.26

0.24

0.26

0.26

0.32

OTU 6

شکل 1 - منطقه نمونه­برداری

 

بحث و نتیجه گیری

حلزون­های خشکی­زی بدلیل داشتن ویژگی هایی از جمله نمونه­برداری آسان و قدرت انتشار اندک شاخص قابل اعتمادی برای بررسی تغییرات طولانی مدت محیط و همچنین ارزیابی تنوع زیستی در طیف وسیعی از زیستگاه‍ها هستند(9).

 

شکل 2 - درخت بیزین (BI) حاصل از ژن COI مربوط به حلزون­های خشکی­زی جنگل خشکه­داران. مقادیر احتمالات پسین در بالای هر شاخه نشان داده شده است. نتایج مربوط به آنالیزهای ABGD‌ و bPTP‌ نیز در شکل آمده است که هر دو نتایج مشابهی داشتند و تعداد 6 گونه فرضی را در میان داده­ها مشخص نمودند.

 

شکل 3 - فراوانی حلزون­ها و تنوع گونه­ای آن­ها در جنگل خشکه­داران

 

 

در این پژوهش تنوع زیستی حلزون­های خشکی­زی ساکن در جنگل خشکه­داران به­عنوان یکی از مهم­ترین زیستگاه­های باقیمانده از جنگل­های سنوزوئییک در شمال ایران با استفاده از روش بارکدینگ  DNAو همچنین بر اساس ویژگی­های ریخت­شناسی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد حلزون-های جمع­آوری شده متعلق به چهار خانواده،‌پنج جنس و شش OTU می­باشند. از آنجاییکه بیشتر از 50% جمعیت جامعه متعلق به دو جنس Pyrenaearia و Schileykula بوده است می­توان اینگونه بیان کرد که تنوع زیستی منطقه پایین می­باشد.

در میان گروه­های شناسایی شده دو گونه Caspicylotus sieversi و Caucasotachea leuaranea که بترتیب متعلق به OTU 1 و OTU 2‌ می­باشند در مطالعات پیشین توسط Eliazian et al. (14) ، یاسینی (6) و منصوریان(5) در شمال ایران گزارش شده­اند. سه جنس(OTU5)   Pyrenaearia (OTU 3, OTU 4) ,Thebaو(OTU 6)  Schileykula برای اولین بار در این پژوهش در منطقه خشکه­داران گزارش شده­اند.

علاوه بر این مطالعات معدودی بر روی حلزون­های خشکی­زی در سایر نقاط ایران نیز صورت گرفته است. از جمله می­توان به مطالعه شمسی و همکاران(4) اشاره نمود که به شناسایی حلزون­های خاکزی شهرستان ارومیه پرداختند را برای آن و در مجموع 9 گونه حلزون منطقه معرفی کردند که تشابهی با گونه­های نام برده در مطالعه حاضر نداشتند.همچنین آن­ها بیان داشتند تنوع حلزون­ها در ارومیه در مقایسه با شمال ایران کمتر است و علت این امر را کمتر بودن میزان رطوبت ارومیه نسبت به شمال ایران دانستند.

در زمینه شناسایی حلزون­های خشکی­زی تکیه انحصاری به روش­های ریخت­شناسی به دلایل متعددی از جمله تغییرات در پوسته صدف در اثر شرایط محیطی خاص زیستگاه بویژه در گونه­های کوچک، وجود گونه­های مرموز (Cryptic) در میان حلزون­ها و همچنین تعداد کم متخصصان با تجربه و دانش کافی جهت شناسایی دقیق گونه­ها­ی حلزون، می­تواند منجر به اشتباه در شناسایی گونه­ها شود(38). جهت غلبه بر مشکل­هایی از این دست روش بارکدینگ DNA‌ به­عنوان روشی با دقت و اعتبار بالا جهت شناسایی موجودات در دهه­ای اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته است اما علیرغم تنوع میتوکندریایی قابل توجه حلزون های خشکی­زی، مطالعات بارکدینگ گسترده­ای بر روی آن­ها صورت نگرفته و اکثر تحقیقات صورت گرفته بر روی شکم­پایان دریایی متمرکز شده است (9، 22). در نتیجه، داده‌های ژنتیکی در بانک ژن برای مطالعات بارکدینگ محدود می­باشد و در حال حاضر داده‌های ژن COI به تنهایی نمی‌تواند به­عنوان یک روش عملی برای شناسایی گونه‌های حلزون زمینی عمل کند. در نتیجه می­توان اینگونه بیان نمود در حال حاضر با توجه به محدود بودن توالی­های مربوط به گونه­های مختلف حلزون­های خشکی­زی در مخازن بانک ژن، ترکیبی از دو روش ریخت شناسی و مولکولی رویکرد مناسبی جهت شناسایی حلزون­های خشکی­زی می­باشد. همانطور که در این پژوهش نیز سکانس مشابه با نمونه مربوط به OTU 6‌ در بانک ژن وجود نداشت و در نتیجه شناسایی این گونه با استفاده از ویژگی­های ریخت­شناسی صدف آن صورت پذیرفت اما شناسایی سایر گونه­ها با استفاده از بارکدینگ صورت پذیرفت. با توجه به اینکه در سال­های اخیر پژوهش­های مولوکلی بیشتری بر روی این موجودات صورت پذیرفته (17، 22، 23،‌ 25، 26، 33) و توجه جامعه علمی به انجام مطالعات ژنتیکی بر روی این موجودات بیشتر شده است، انتظار می­رود در آینده نزدیک بواسطه انجام مطالعات گسترده­تر در این زمینه و افزودن توالی­های مربوط به گونه­های مختلف حلزون به پایگاه داده بانک ژن این محدودیت برطرف شده و رویکرد مولکولی به تنهایی بعنوان روشی قابل اعتماد و البته با دقت بیشتر جهت شناسایی این موجودات مورد استفاده قرار گیرد.

لازم به ذکر است در زمینه مطالعات اکولوژیکی، زمانیکه محاسبه تعداد گونه­های موجود در منطقه به منظور بررسی تنوع زیستی و ویژگی­های جوامع زیستی و ارزیابی سلامت اکوسیستم مد نظر است رویکرد مولکولی و تعیین مرزهای گونه­ای به تنهایی می­توانند منجر به دست­یابی به نتایج دقیق و قابل اعتمادی شوند. زیرا در این نوع مطالعات تنها تعداد گونه­های موجود در منطقه مورد بررسی قرار میگیرد و نیازی به شناسایی حلزون­ها و دانستن نام جنس و یا گونه آن­ها نیست در نتیجه با محاسبه تعداد OTU های موجود در محدوده مورد بررسی می­توان به داده­های قابل قبول و معتبری برای ارزیابی تنوع زیستی یک اکوسیستم دست یافت (11، 29).

بررسی جوامع حلزون­های خشکی­زی، به­عنوان گونه­ای با اهمیت که دارای نقش­های اکولوژیک فراوان در طبیعت می­باشند، حفظ آن­ها بعنوان گونه­های بومی و یا کنترل آن­ها بعنوان گونه­های آفت در گرو شناخت کامل گونه­های موجود در منطقه و بررسی پراکنش آن­ها است. پیشنهاد می­شود با انجام مطالعات مولکولی گسترده­تر در این منطقه هیرکانی بهمراه بررسی آماری جوامع حلزون در بخش­های مختلف جنگل­های هیرکانی به شناسایی تنوع زیستی کشف نشده در این ذخیره­گاه زیست­کره پرداخت و گونه­های بومی این منطقه را پیش از حذف از طبیعت شناسایی نمود. همچنین در نهایت این داده­ها می­توانند به توسعه یک شاخص زیستی مناسب برای ارزیابی کیفیت زیستگاه در این جنگل­ها و زیستگاه­های مشابه به منظور بررسی کمک کنند.

سپاسگزاری

بدینوسیله مراتب تشکر و قدردانی خود را از تمامی اساتید و عزیزانی که در مراحل مختلف این تحقیق با ما همکاری داشته­اند ابراز می­داریم.

  1. اکبری، ر.، بلقیس­زاده، ح.، یوسفی سیاه کلرودی، س.، 1396. بررسی فونستیک حلزون­های خشکی زی (Gastropoda) در بخش مرکزی استان مازندران. فصلنامه محیط زیست جانوری، شماره 1، سال 9، صفحات 159-166.
  2. احمدی، ا.، 1391. شناسایی حلزون­های باغات پرتقال تامسون در استان مازندران. مجله حشره­شناسی گیاهان زراعی. سال 1، شماره 2،‌صفحات 57-64.
  3. پیام ، ح .، 1378. شناسایی فلور و فون مهم اثر طبیعی ملی خشکه داران. پایان نامه کارشناسی ارشد ،دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران.
  4. شمسی، ل.، توسلی، م.، نائم، ث.، احمدی، ا.، محمودیان، ع.، 1398. شناسایی حلزون­های خاکزی شهرستان ارومیه، مجله پژوهش­های جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)، شماره 32، سال 1، صفحات 29-37.
  5. منصوریان، ا.، 1384. شناسایی نرم­تنان خاکزی استان­های گلستان و مازندران، مجله دانشکده دامپزشکی دانشگاه تهران. سال 6، شماره 1، صفحات 31-36.
  6. یاسینی، ا.، 1355. بررسی پاره­ای از شکم­پایان هوازی کثیرالانتشار استان­های مازندران، گیلان، آذربایجان شرقی و غربی. محیط شناسی. مرکز هماهنگی مطالعات زیستی دانشگاه تهران. شماره 6، صفحات 130-165.

 

  1. Bishara, S. I., Hassan, M. S. and Kalliny, A. S., 1968. Studies on some land snails injurious to agriculture in U.A.R. Revue de zoologie et de botanique africaines Lxx, VII, 239-252.
  2. Cameron, R., and Redfern, M., 2009. British land snails: Mollusca, Gastropoda: keys and notes for the identification of the species. Linnean Society of London by Academic Press, 64.
  3. Campbell, D. C., Johnson, P. D., Williams, J. D., Rindsberg, A. K., Serb, J. M., Small, K. K., and Lydeard, C., 2008. Identification of ‘extinct freshwater mussel species using DNA barcoding. Molecular Ecology Resources, 8(4), 711-724.‏
  4. Chavhan, A., Pawar, S. and Jadhao, R., 2015. Study of Biodiversity of Terrestrial Snail in Selected Locality of Amravati City, Central India. Indian Journal of Applied Research, 5(8), 713-714.
  5. Davison, A., Blackie, R. L., and Scothern, G. P., 2009. DNA barcoding of stylommatophoran land snails: a test of existing sequences. Molecular Ecology Resources, 9(4), 1092-1101.‏
  6. Dempsey, Z. W., Goater, C. P., and Burg, T. M., 2020. Living on the edge: Comparative phylogeography and phylogenetics of Oreohelix land snails at their range edge in Western Canada. BMC Evolutionary Biology, 20(1), 1-13.
  7. Dourson, D. and Dourson, J., 2006. Land snails of the great Smoky Mountains (Eastern Region). Appalachian Highlands Science Learning Center, Purchase Knob, Great Smokey Mountains National Park.‏
  8. Eliazian, M., Tamiji, Y., Akbarzadeh, M., and Hagh-Nazari, J., 1979. Snails from the northern parts of Iran (Caspian Area). Archives of Razi Institute, 31(1), 29-36.‏
  9. Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., and Vrijenkoek, R., 1994. Molecular Marine Biology and Biotechnology. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates, 3, 294-299.‏
  10. Forcart, L., 1935. Die Mollusken der nordpersischen Provinz Masenderan und ihre tiergeographische Bedeutung. Archiv für Naturgeschichte, N.F., 4(3), 404-447.
  11. Galan, G. L., Mendez, N. P., and dela Cruz, R. Y., 2018. DNA barcoding of three selected gastropod species using cytochrome oxidase (COI) gene. Annales of West University of Timisoara. Series of Biology, 21(1), 93-102.
  12. Hames, R. S., Rosenberg, K. V., Lowe, J. D., Barker, S .E. and Dhondt, A. A., 2002. Adverse effects of acid rain on the distribution of the Wood Thrush Hylocichla mustelina in North America. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(17), 235-240.
  13. Hotopp, K. P., 2002. Land snails and soil calcium in central Appalachian Mountain forest. Southeastern Naturalist, 1(1), 27-44.‏
  14. Issel, A., 1866. Dei molluschi raccolti nella provincial de Pisa. Memorie della Societa Italiana di Scienze Naturali, 2(23), 411-426.
  15. Jurickova, L., Horsák, M., Cameron, R., Hylander, K., Míkovcová, A., Hlaváč, J. Č., and Rohovec, J., 2008. Land snail distribution patterns within a site: the role of different calcium sources. European Journal of Soil Biology, 44(2), 172-179.
  16. Kelly, R. P., Sarkar, I. N., Eernisse, D. J., Desalle, R., 2007. DNA barcoding using chitons (genus Mopalia). Molecular Ecology Notes, 7, 177–183.
  17. Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., and Miyata, T., 2002. MAFFT: a novel method for rapid multiple sequence alignments based on fast Fourier transform. Nucleic Acids Research, 30 (14), 3059–3066.
  18. Mason, K., Fehér, Z., Bamberger, S., Reier, S., Szekeres, M., Sattmann, H., ... and Haring, E., 2020. New insights into and limitations of the molecular phylogeny in the taxon‐rich land snail genus Montenegrina (Mollusca: Gastropoda: Clausiliidae). Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research, 58(3), 662-690.‏
  19. Mouahid, G., Clerissi, C., Allienne, J. F., Chaparro, C., Al Yafae, S., Mintsa Nguema, R., ... and Moné, H., 2018. The phylogeny of the genus Indoplanorbis (Gastropoda, Planorbidae) from Africa and the French West Indies. Zoologica Scripta, 47(5), 558-564.‏
  20. Nantarat, N., Sutcharit, C., Tongkerd, P., Wade, C. M., Naggs, F., and Panha, S., 2019. Phylogenetics and species delimitations of the operculated land snail Cyclophorus volvulus (Gastropoda: Cyclophoridae) reveal cryptic diversity and new species in Thailand. Scientific Reports, 9(1), 1-12.
  21. Nekola, J. C. and Coles, B. F., 2010. Pupillid land snails of eastern North America. American Malacological Bulletin, 28(2), 29-57.
  22. Puillandre, N., Lambert, A., Brouillet, S., and Achaz, G. J. M. E., 2012. ABGD, Automatic Barcode Gap Discovery for primary species delimitation. Molecular Ecology, 21(8), 1864-1877.‏
  23. Ranasinghe, U. G. S. L., Eberle, J., Thormann, J., Bohacz, C., Benjamin, S. P., and Ahrens, D., 2022. Multiple species delimitation approaches with COI barcodes poorly fit each other and morphospecies–An integrative taxonomy case of Sri Lankan Sericini chafers (Coleoptera: Scarabaeidae). Ecology and Evolution, 12(5), 8942.‏
  24. Sallam, A. and El-Wakeil, N., 2012. Biological and ecological studies on land snails and their control. Integrated Pest Management and Pest Control-Current and Future Tactics, 1.
  25. Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., 1989. Molecular cloning: a laboratory manual (No. Ed. 2). Cold Spring Harbor Laboratory press.‏ 2100 pp.
  26. Shahawy, W. A., Hendawy, A. S., Abada, A. E. and Kassem, A. A., 2008. Land snails infesting rice plants and their accompanied parasitoids and predators at Kafr El-Sheikh governorate, Egypt. Egyptian Journal of Agricultural Research, 86, 971-980.
  27. Shimizu, Y., and Ueshima, R., 2000. Historical biogeography and interspecific mtDNA introgression in Euhadra peliomphala (the Japanese land snail). Heredity, 85(1), 84-96.‏
  28. Smith, U. E. and Hendricks, J. R., 2013. Geometric morphometric character suites as phylogenetic data: extracting phylogenetic signal from gastropod shells. Systematic Biology, 62(3), 366-385.‏
  29. Stamatakis, A., 2014. RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. Bioinformatics, 30(9), 1312-1313.‏
  30. Starmühlner, F. and Edlauer, A., 1957. Ergebnisse der Österreichischen Iran-Expedition 1949/50. Beiträge zur Kenntnis der Molluskenfauna des Iran. Sitzungsberichte der Österreichischen Akademie der Wissenschafte, 166(9-10), 435–494.
  31. Tohidifar, M., Moser, M., Zehzad, B. and Ghadirian, T., 2016. Biodiversity of the Hyrcanian forests. A Synthesis Report. 1, 10.‏
  32. Zeng, X., Yiu, W. C., Cheung, K. H., Yip, H. Y., Nong, W., He, P., ... and Hui, J. H. L., 2017. Distribution and current infection status of Biomphalaria straminea in Hong Kong. Parasites and vectors, 10(1), 1-12.‏
  33. Zhang, J., Kapli, P., Pavlidis, P., Stamatakis, A., 2013. A general species delimitation method with applications to phylogenetic placements. Bioinformatics, 29, 2869–2876.
  34. https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/abgd/abgdweb.html
  35. Species delimitation server (h-its.org)
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 36، شماره 4
دی 1402
صفحه 275-291
  • تاریخ دریافت: 31 تیر 1402
  • تاریخ بازنگری: 11 شهریور 1402
  • تاریخ پذیرش: 13 مهر 1402