نوع مقاله : مقاله پژوهشی
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله English
نویسندگان English
Previous studies show that herbal compounds can be effective in the treatment of many diseases, including diabetes. Diabetes is a serious metabolic disease that can disrupt the normal function of the reproductive system. In this study, 35 male Wistar rats were divided into 5 groups. In order to induce diabetes, the drug streptozotocin was used in the amount of 90 mg/kg. In order to evaluate the effect of saffron extract, the treatment of animals continued for 35 days. After the end of the treatment period the animals were euthanized by deep anesthesia.Blood samples were collected to measure the testosterone serum level. Then, sampling of the testicular tissue was done and the routine steps of tissue section preparation were performed. Finally, the samples were prepared for the histomorphometry evaluations of the testis. In addition to these, Tubular Differentiation Index (TDI) and Spermiogenesis Index (SI) were calculated. Also, sperm motility and viability were analyzed.
In the diabetic group, the thickness of the epithelium and the diameter of the spermatogenic tubes decreased, and the saffron extract with doses of 120 and 240 mg improved the damage. Also, diabetes causes a decrease in serum testosterone, and saffron extract, especially with a dose of 120, causes a significant increase in this hormone. Observations showed that saffron extract can reduce the negative effects of diabetes on testicular tissue and its histomorphometric characteristics due to its antioxidant properties.
کلیدواژهها English
مطالعۀ ارزیابی هورمون تستوسترون و شاخص های اسپرماتوژنز در موش های صحرایی دیابتی تحت تیمار عصاره ی آبی زعفران (Crocus Sativus L.)
فربد پورصادقی١، احمدعلی محمدپور1* و زهرا موسوی2
1ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکدۀ دامپزشکی، گروه علوم پایه
2 ایران، مشهد، دانشگاه فردوسی مشهد، دانشکدۀ دامپزشکی، گروه پاتوبیولوژی
تاریخ دریافت: 08/11/1402 تاریخ پذیرش: 16/07/1403
چکیده
مطالعات پیشین نشان می دهد که, ترکیبات گیاهی می توانند در درمان بسیاری از بیماری ها از جمله دیابت موثر باشند. دیابت یک بیماری متابولیکی جدی است که می تواند باعث اختلال در عملکرد طبیعی سیستم تناسلی شود. به همین منظور، تاثیر عصاره ی آبی زعفران بر سطح هورمون تستوسترون و شاخص های اسپرماتوژنز در موش های صحرایی دیابتی شده ی نژاد ویستار مورد بررسی قرار گرفت. در این مطالعه 35 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار به 5 گروه 7 تایی تقسیم شدند. جهت القای دیابت از داروی استرپتوزوتوسین به میزان 90 میلی گرم بر کیلوگرم استفاده شد. جهت ارزیابی اثر عصاره ی زعفران، درمان حیوانات به مدت 35 روز ادامه پیدا کرد. متعاقب پایان یافتن دوره ی درمان، حیوانات توسط بیهوشی عمیق آسان کشی شدند. نمونۀ خون جهت اندازه گیری سطح سرمی تستوسترون، جمع آوری شد. سپس ، نمونه برداری از بافت بیضه انجام شد و مراحل روتین آماده سازی مقاطع بافتی انجام پذیرفت. در نهایت نمونه ها ، جهت ارزیابی های هیستومورفومتریک بیضه آماده شدند. علاوه بر اینها شاخص تمایز لوله ای و شاخص اسپرمیوژنز محاسبه گردید. همچنین تحرک و زنده مانی اسپرمها, بررسی شد. نتایج نشان داد که, در گروه دیابتی ضخامت اپی تلیوم و قطر لوله های اسپرم ساز کاهش یافته بود و عصاره ی زعفران با دوز های 120 و 240 میلی گرم سبب بهبود آسیب حاصله شده بود. دیابت سبب کاهش سطح تستوسترون سرمی شده بود که عصاره ی زعفران خصوصا با دوز 120 میلی گرم سبب افزایش قابل توجه این هورمون شده بود. مشاهدات نشان داد که, عصاره ی زعفران بدلیل خاصیت آنتی اکسیدانی می تواند باعث کاهش اثرات منفی دیابت بر روی بافت بیضه و خصوصیات هیستومورفومتریک آن شود.
واژه های کلیدی: هیستومورفولوژی، عصاره ی آبی زعفران، دیابت، بیضه، شاخص های اسپرماتوژنز، موش صحرایی
* نویسنده مسئول، پست الکترونیکی:mohammadpoor@um.ac.ir
مقدمه
با توجه به عوارض جانبی بسیاری از داروهای شیمیایی، استفاده از ترکیبات طبیعی و گیاهان دارویی در طب مدرن رواج بیشتری یافته است و مطالعات فراوانی در راستای کشف و معرفی افزودنی های ایمن تر بویژه با منشا گیاهی در سالهای اخیر انجام شده است(13و 14و7). یکی از این ترکیبات گیاهی , زعفران یا زرپران (Crocus Sativus L) است که از تیره ی زنبقیان بوده و گیاهی است بسیار منعطف و کم توقع که در غالب مناطق بصورت طبیعی و در برخی دیگر از مناطق بد آب و هوا در شرایط کنترل شده بصورت کشت گلخانه ای قابل کاشت می باشد. زعفران حاوی 28 ترکیب آلی فرار می باشد که در حضور عوامل اکسایش مثل نور و هوا به سادگی تخریب می شود. به همین دلیل بایستی در ظروف دربسته و به دور از نور خورشید نگهداری شود (15) . علاوه بر آن، دیابت شایع ترین بیماری غدد درون ریز بدن است که با عوارض شدید عملکردی و ساختاری همراه است (17). دیابت اثرات نامطلوبی بر روی اندامها و بافت های بدن از جمله سیستم تناسلی دارد (9). استرس اکسیداتیو نقش موثری در بیماریزایی دیابت و عوارض ناشی از آن دارد (3). بنابراین با توجه به تاثیر منفی دیابت روی سیستم تناسلی و اثرات مثبت گیاهان دارویی روی دیابت، در این پژوهش ما بر آن شدیم که اثرات عصاره ی آبی زعفران بدلیل داشتن ترکیبات طبیعی و دارا بودن خاصیت آنتی اکسیدانی، بر روی بافت بیضه و سطح هورمون تستوسترون سرمی را مورد بررسی و آنالیز دقیق قرار دهیم.
مواد و روشها
حیوانات: در این پژوهش 35 سر موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 20±150 گرم مورد آزمایش قرار گرفت. حیوانات از مرکز نگهداری و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه تهیه و در قفس های مخصوص در 5 گروه 7 تایی نگهداری شدند. حیوانات توسط پلت تغذیه و جهت آبدهی از شیر آب شهری استفاده شد. حیوانات در دمای 2±22 و تحت شرایط استاندارد (12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی) و رطوبت نسبی 68-50 درصد نگهداری شدند. قبل از تزریق استرپتوزوتوسین و خون گیری، حیوانات شبانه در گرسنگی، قرار گرفتند در حالیکه دسترسی آزاد به آب داشتند. قبل از شروع آزمایش، موش های صحرایی نر بالغ به مدت 14 روز در مرکز پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه در کنار هم بصورت گروه بندی شده قرار داده شدند تا با شرایط محیطی سازش پیدا کرده و استرس های محیطی بر نتیجه آزمایش ها تاثیری نداشته باشد.
تمام مراحل انجام این طرح طبق موازین اخلاقی کمیتة حمایت از حیوانات دانشگاه فردوسی مشهد صورت گرفت ( کد مصوبۀ اخلاق (IR.UM.REC.1401.019
القای دیابت: جهت القای دیابت از داروی استرپتوزوتوسین(سیگماآلدرچ، ایالات متحده آمریکا) به میزان 90 میلی گرم بر کیلوگرم حل شده در محلول سیترات بافر با 5/4PH: بصورت تزریق داخل صفاقی(IP) استفاده شد. پس از 48 ساعت، خون گیری از طریق ورید دمی صورت گرفت و خون تهیه شده جهت اندازه گیری سطح سرمی گلوکز استحصال گردید. لازم به ذکر است که میزان گلوکز یا قندخون 250 میلی گرم بر دسی لیتر یا بالاتر از آن، القای موفقیت آمیز دیابت را اثبات میکند. علاوه بر آن، پرنوشی، تکرر ادرار و کاهش ناگهانی وزن و بیحالی هم در موش های صحرایی اتفاق می افتد.
تهیه ی عصاره ی آبی زعفران : برای تهیه ی عصاره ی آبی زعفران، مقدار 25 گرم عصاره از مرکز رشد فرآورده های دارویی شرکت پویش داروی سینا تهیه گردید.
گروه بندی حیوانات: پس از اطمینان از دیابتی شدن حیوانات و تعیین دز موثر عصاره ی آبی زعفران در حیوانات، ابتدا آنها را در 5 گروه 7 تایی تقسیم بندی کردیم و در طول دوره ی آزمایش که 35 روز تعیین شد، عملیات بشرح زیر انجام شد:
گروه 1یا کنترل (Control) : این گروه از حیوانات بعنوان شاهد آزمایش درنظر گرفته شده و در طول مدت زمان آزمایش حجم مشخصی از آب مقطر را به روش گاواژ دریافت کرد و با حرف N نشان داده شده است .
گروه 2 یا دیابتی( Diabetic Group) : این گروه از حیوانات توسط استرپتوزوتوسین دیابتی شده و روزانه حجم مشخصی از آب مقطر را دریافت کردند و با حرف NC نشان داده شده است .
گروه 3 دیابتی و درمان با دوز کم از عصاره ی آبی زعفران(Diabetic + low dose aqueous saffron extract) : این گروه از حیوانات که دیابتی شده هستند روزانه 60 میلی گرم بر کیلوگرم عصاره ی آبی زعفران به صورت گاواژ دریافت کردند و با عدد60 نشان داده شده است.
گروه 4 دیابتی و درمان با دوز متوسط از عصاره ی آبی زعفران ( Diabetic + intermediate dose aqueous saffron extract : این گروه از حیوانات که دیابتی شده هستند روزانه 120 میلی گرم بر کیلوگرم عصاره ی آبی زعفران بصورت گاواژ دریافت کردند و با عدد120 نشان داده شده است.
گروه 5 دیابتی و درمان با دوز بالا از عصاره ی آبی زعفران ( Diabetic + high dose aqueous saffron extract) : این گروه از حیوانات که دیابتی شده هستند روزانه 240 میلی گرم بر کیلوگرم عصاره آبی زعفران بصورت گاواژ دریافت کردند و با 240 نشان داده شده است.
آنالیز سرمی تستوسترون: متعاقب پایان یافتن دوره درمان با عصاره ی آبی زعفران، حیوانات از محل نگهداری به آزمایشگاه منتقل و توسط بیهوشی عمیق آسان کشی شدند. نمونه های خون توسط سرنگ 5 سی سی استریل با توجه به ناحیه توپوگرافیک قلب، مستقیما از قلب جمع آوری شد. سپس به منظور استحصال سرم، نمونه های خون با 3000 RPM به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید. سرم های بدست آمده در داخل میکروتیوب قرار داده شده و در دمای 20- درجه فریز شدند تا برای انجام آزمایش اندازه گیری هورمون تستوسترون نگهداری شوند. جهت سنجش هورمون تستوسترون از کیت Inc-Iran،Monobind استفاده شد.
نمونه برداری و تهیه ی لام بافتی: بیضه های حیوانات با رعایت اصول بهداشتی، پس از ایجاد برش در دیواره ی شکم، خارج و پس از جداسازی بافتهای اطراف، وزن شدند و با نرمال سالین شسته شدند. سپس بیضه ها پس از تثبیت در محلول فرمالین 10 درصد جهت تهیه مقاطع بافتی به منظور هیستومورفولوژی و آسیب شناسی بررسی شدند. نمونه های فیکس شده با استفاده از روش های معمول بافت شناسی پس از عبور از محلول های دستگاه آماده سازی بافت با استفاده از پارافین قالب گیری شدند. بلوکهای بافتی با ضخامت 5 میکرون توسط دستگاه میکروتوم برش داده شدند و رنگ آمیزی نمونه های بافتی توسط رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین صورت پذیرفت. همچنین به منظور بررسی مکانیسم اثر دیابت بر روی بافت بیضه و چگونگی اثر درمانی عصاره ی آبی زعفران بر روی دیابت، ارزیابی های هیستومورفومتریک بیضه نظیر قطر لوله ی اسپرم ساز، قطر لومن و ضخامت اپی تلیوم زایشی در گروههای مختلف انجام شد. در این تحقیق، قطر 100 لوله اسپرم ساز، لومن و ضخامت اپی تلیوم زایشی آن بصورت تصادفی، با استفاده از روش میکرومتری اندازه گیری و سپس میانگین پارامترها در بین گروهها مقایسه شد.
ارزیابی شاخص های اسپرماتوژنز: همچنین برای بررسی دقیق تر اثرات دیابت بر روی بافت بیضه و اثرات درمانی عصاره ی آبی زعفران بر روی دیابت، شاخص های تمایز لوله ای (TDI) که بیانگر درصد لوله های اسپرم سازی است که دارای سه یا بیشتر از سه رده سلول اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلول اسپرماتوگونی A می باشد ، شاخص اسپرمیوژنز(SI) که بیانگر نسبت لوله هایی که دارای اسپرم است به لوله هایی که فاقد اسپرم است، محاسبه گردید.
ارزیابی اسپرم: به منظور پی بردن به اثر دیابت و اثرات درمانی عصاره ی آبی زعفران بر روی تحرک، زنده مانی اسپرم ، ناحیه ی دمی مجرای اپیدیدیم راست جهت آنالیز اسپرمی جدا و پس از ایجاد یک برش در روی آن، در محیط کشت تهیه شده در پتری دیش، به مدت30 دقیقه انکوبه گردید. اسپرمها از اپیدیدیم خارج گردیده و با نسبت 1 به 20 رقیق شدند. لازم به ذکر است، بر اساس دستورالعمل سازمان بهداشت جهانی، جهت بررسی حرکات اسپرم و تعداد اسپرم از لام نئوبار استفاده شد.
تحرک اسپرم: فقط اسپرم هایی که حرکت مستقیم و پیش رونده دارند از لحاظ باروری دارای اهمیت هستند. اسپرم ها بر اساس سرعت حرکت در میدان میکروسکوپی با درشتنمایی بالا (High power field/hpf) به چهار کلاس تقسیم می شوند.
1. اسپرم های دارای حرکت سریع و پیشرونده(Rapid progressive): که سرعت حرکت اسپرم بیش از25 میکرومتر بر ثانیه است که به آن کلاس a نیز گفته میشود.
2. اسپرم های دارای حرکت کند و پیشرونده (Slow progressive): سرعت حرکت آنها 5 الی 25 میکرومتر بر ثانیه است و به این دسته کلاس b نیز گفته می شود.
3. اسپرم های متحرک ولی غیر پیشرونده (Non progressive): اسپرم هایی که در جای خود حرکت میکنند و یا دارای سرعت کمتر از 5 میکرومتر بر ثانیه هستند که به این دسته کلاس c نیز گفته میشود.
4. اسپرم های غیر متحرک (Immotile): اسپرم هایی که به طور کامل بیحرکت هستند و به آنها کلاس d گفته میشود. برای تعیین درصد اسپرم های متحرک، تعداد 10 میکرولیتر از نمونه رقیق شده را به لام نئوبار توسط سمپلر تزریق کرده و پس از شمارش 200 اسپرم درصد اسپرم های متحرک بین آنها را بدست آوردیم.
علاوه بر این برای تعیین میزان زنده مانی اسپرم ها از رنگ آمیزی اختصاصی ائوزین-نکروزین استفاده گردید که اصول کار در این رنگ آمیزی بر این مبنا استوار است که، در اثر آسیب به غشای پلاسمایی، اسپرم ها نسبت به رنگ مذکور نفوذپذیر می شوند. بدین منظور ابتدا نسبت یک حجم سوسپانسیون اسپرم و دو حجم ائوزین، در میکروتیوب مخلوط و پس از 30 ثانیه نگهداری در انکوباتور 37 درجه سانتی گراد، حجم مساوی از محلول نکروزین به آن اضافه شد و گسترش نازکی از نمونه بر روی لام ایجاد گردید. پس از خشک شدن گسترش، با استفاده از میکروسکوپ معمولی با عدسی ،100X تعداد 100اسپرم شمارش شد و نسبت درصد اسپرم در گروههای مختلف محاسبه گردید. در این رنگ آمیزی، سر اسپرمهای زنده، سفید و سر اسپرمهای مرده، قرمز رنگ می شود.
آنالیز داده ها: در نهایت داده های حاصل از مطالعات مورفولوژی و هیستومورفومتری به روش آماری ANOVA و تست تعقیبی دانکن با استفاده از نرم افزار SPSS مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج
سطح تستوسترون: آنالیز مطالعه پیش رو نشان داد دیابت سبب کاهش قابل توجه سطح تستوسترون سرمی می شود که یکی از علت های آن را می توان به کاهش سلول های لیدیک بافت بیضه نسبت داد. مطابق نمودار شمارۀ1، متعاقب درمان با عصاره ی آبی زعفران، افزایش در سطح سرمی تستوسترون را شاهد بودیم که در گروه درمان با دوز 120 نسبت به بقیه ی گروهای درمان، سطح تستوسترون سرمی افزایش قابل توجهی دارد.
ارزیابی های هیستومورفومتریک بافت بیضه: میانگین قطر لوله ی اسپرم ساز: مقایسه ارزیابی هیستومورفومتریک در بین گروههای مورد آزمایش بیانگر این نکته است که دیابت
سبب کاهش میانگین قطر لوله ی اسپرم ساز شده است که متعاقب درمان با عصاره ی آبی زعفران، میانگین قطر لوله ی اسپرم ساز بتدریج افزایش می یابد .
میانگین قطر لومن لوله های اسپرم ساز: مقایسه ی قطر لومن بین گروههای مورد آزمایش، تایید کرد که دیابت باعث کاهش قطر لومن لوله های اسپرم ساز در مقایسه با گروه کنترل می شود. همچنین مشاهده شد درمان با عصاره ی آبی زعفران با دوز کم و متوسط (60 و 120 ) نمی تواند تاثیر قابل چشمگیری روی قطر لومن لوله های اسپرم ساز بگذارد .
میانگین ضخامت اپی تلیوم لوله های اسپرم ساز: نهایتا آخرین ارزیابی هیستومورفومتریک در مطالعه ما ، نشان داد دیابت سبب کاهش ضخامت اپی تلیوم لوله های اسپرم ساز می شود که متعاقب درمان با عصاره آبی زعفران، ضخامت اپی تلیوم لوله ها بصورت تدریجی افزایش می یابد (جدول شمارۀ 1 و تصاویر 1 تا 5).
نمودار 1: مقایسۀ هورمون تستوسترون در گرو ههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد)بر حسب نانوگرم بر میلی لیتر
N- گروه نرمال ، NC-گروه دیابتی، 60- گروه درمان (دوز 60 میلی گرم)،120- گروه درمان (دوز 120 میلی گرم)، 140- گروه درمان (دوز 140 میلی گرم). *ستون هایی که حروف آنها ناهمسان است اختلاف آنها معنی دار می باشد (P≤0.05).
جدول 1- میانگین و انحراف معیار ارزیابی های هیستومورفومتریک بافت بیضه در گروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد) بر حسب میکرون
|
پارامتر اندازه گیری شده |
کنترل |
دیابتی شده |
درمان با دوز60 |
درمان با دوز120 |
درمان با دوز240 |
|
میانگین قطر لوله اسپرم ساز |
9/18±66/276 |
5/28±18/240 |
9/17±76/246 |
2/16±55/260 |
7/16±12/283 |
|
میانگین قطر لومن لوله اسپرم ساز |
3/22±64/151 |
2/21±15/138 |
4/18±32/119 |
5/9±77/133 |
3/19±34/141 |
|
میانگین ضخامت اپی تلیوم لوله اسپرم ساز |
1/6±11/90 |
3/7±89/76 |
6/9±67/80 |
5/5±11/90 |
6/10±88/94 |
X تصویر 1: مقطع بافتی بیضۀ موش صحرایی در گروه کنترل، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، 200
لوله های اسپرم ساز(نوک فلش)، لومن(L)، اپیتلیوم(E).
ارزیابی شاخص های اسپرماتوژنز
شاخص تمایز لوله ای TDI (Tubular Differentiation Index) : مطالعات ما نشان داد دیابت بطور قابل ملاحظه ای شاخص تمایز لوله ای را تحت تاثیر قرار می دهد و درصد لوله هایی که هر سه یا بیشتر از سه رده سلوهای اسپرماتوژنز تمایز یافته از سلول اسپرماتوگونی A را دارند، کاهش قابل توجهی دارند. همچنین مشاهدات ما حاکی از وجود اختلاف معنی دار بین گروه دیابتی با گروهای تحت درمان و کنترل است (P≤0.05) ( جدول و نمودار 2).
X تصویر 2: مقطع بافتی بیضۀ موش صحرایی در گروه دیابتی، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، 100
لوله های اسپرم ساز تغییر شکل یافته(نوک فلش ها)، لومن حاوی ترشحات(سرفلش ها)، اپیتلیوم تخریب شده(E)، بافت همبند گسترده در بین لوله ها(*).
تصویر 3: مقطع بافتی بیضۀ موش صحرایی در گروه دیابتی درمان شده با دوز 60 میلی گرم عصارۀ آبی زعفران، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، 200 X ، لومن(L)، اپیتلیوم(E).
تصویر 4: مقطع بافتی بیضۀ موش صحرایی در گروه دیابتی درمان شده با دوز 120 میلی گرم عصارۀ آبی زعفران، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، 100 X ، لومن(L)، اپیتلیوم(E).فلش ها تراکم لوله های اسپرم ساز را با اپیتلیوم سالم نشان می دهند
تصویر 5: مقطع بافتی بیضۀ موش صحرایی در گروه دیابتی درمان شده با دوز 240 میلی گرم عصارۀ آبی زعفران، رنگ آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، 100 X ، لومن(L)، اپیتلیوم(E).
جدول 2- میانگین و انحراف معیار TDI برحسب درصد در گروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد)
|
انحراف معیار ± میانگین |
گروه |
|
|
96/167±5/67 |
نرمال |
|
|
75/167±10/12 |
دیابتی شده |
|
|
250/82± 8/95 |
60 |
|
|
86±6/40 |
120 |
|
|
90/333±5/07 |
240 |
|
جدول 3- میانگین و انحراف معیارSI در بین گروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد) برحسب درصد
|
انحراف معیار ± میانگین |
گروه |
|
|
94/00±5/27 |
نرمال |
|
|
58/00±12/36 |
دیابتی شده |
|
|
90/00± 5/77 |
60 |
|
|
91/00± 5/68 |
120 |
|
|
95/00±3/69 |
240 |
|
شاخص اسپرمیوژنز SI(Spermiogenesis index) : ارزیابی صورت گرفته نشان داد دیابت، شاخص اسپرمیوژنز را نیز تحت تاثیر قرار داده و درصد لوله هایی که دارای اسپرم هستند به آنهایی که فاقد اسپرم هستند، در گروه دیابتی کاهش قابل توجهی داشتند. متعاقب درمان با عصاره ی آبی زعفران این نسبت افزایش پیدا میکند. هیچ اختلاف معنی داری بین گروه دیابتی شده و گروههای درمان مشاهده نشد (جدول ونمودار 3 ).
نمودار 2- نمودار مقایسه ی TDI در بین گروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد) برحسب درصد
N- گروه نرمال ، Nc-گروه دیابتی، 60- گروه درمان (دوز 60 میلی گرم)، 120- گروه درمان (دوز 120 میلی گرم)، 140- گروه درمان (دوز 140 میلی گرم). *ستون هایی که حروف آنها ناهمسان است اختلاف آنها معنی دار می باشد (P≤0.05)
نمودار 3- نمودار مقایسۀ SI بین گروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد) بر حسب درصد
N- گروه نرمال ، Nc-گروه دیابتی، 60- گروه درمان (دوز 60 میلی گرم)، 120- گروه درمان (دوز 120 میلی گرم)، 140- گروه درمان (دوز 140 میلی گرم).*اختلاف معنی دار بین گروه دیابتی و کنترل مشاهده شد ولی اختلاف معنی داری بین گروه دیابتی با هیچ یک از گروه درمان مشاهده نشد.
تحرک و زنده مانی اسپرم: مطالعه ما نشان داد دیابت سبب کاهش تحرک و حرکات پیشرونده اسپرم می شود و متعاقب درمان توسط عصاره آبی زعفران، افزایش تحرک و حرکات پیشرونده اسپرم ها را شاهد بودیم. بطوری که درمان با عصاره آبی زعفران با دز بالا ، سبب افزایش قابل توجهی در حرکت و پیشروندگی اسپرم ها می شود ( جدول 4).
علاوه بر آن برای تعیین زنده مانی اسپرم ها از رنگ آمیزی اختصاصی ائوزین-نکروزین استفاده شد که مطالعه پیش رو نشان داد دیابت سبب کاهش قدرت زنده مانی اسپرم ها می شود و متعاقب استفاده از عصارۀ آبی زعفران در قدرت زنده مانی اسپرم ها افزایش یافت. (تصویر 6 و جدول 4)
جدول 4- میانگین میزان تحرک اسپرم درگروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد) بر حسب درصد
|
نوع حرکت اسپرم |
نرمال |
دیابتی شده |
60 |
120 |
240 |
|
پیش رونده |
42/37 |
0/00 |
68/15 |
39/39 |
61/36 |
|
غیر پیش رونده |
55/23 |
37/0 |
94/18 |
08/26 |
97/22 |
|
نامتحرک |
02/39 |
63/99 |
37/65 |
52/34 |
41/40 |
|
متحرک |
97/60 |
37/0 |
62/34 |
47/65 |
59/59 |
|
NC |
|
Normal |
|
120 |
|
60 |
|
240 |
|
Scale bar is 50 microns |
تصویر 6: تعیین زنده مانی اسپرم درگروههای مختلف موش صحرایی(هر گروه 7 عدد) با رنگ آمیزی ائوزین -نگروزین
بحث
از زعفران به عنوان یکی از گیاهان دارویی در طب سنتی یاد میشود که از مهمترین ترکیبات موجود در آن میتوان به کروسین، پیکروکروسین و سافرانال اشاره کرد. همچنین مطالعات فراوانی بر روی خاصیت هیپوگلایسمیک، هیپولیپیدمیک و آنتی اکسیدانی زعفران طی سالیان متمادی انجام شده است که نشان می دهد عصاره زعفران و ترکیبات آن علاوه بر اثرات فوق، دارای اثرات ضدافسردگی، ضد تشنجی، ضد التهابی، ضد توموری و از بین برنده رادیکالهای آزاد می باشد (16). روش هایی که در حال حاضر برای درمان دیابت غیر وابسته به انسولین استفاده می شوند مانند تغییرات رژیم غذایی و عوامل هیپوگلیسمیک خوراکی، محدودیت های خاص خودرا دارند. بیماری دیابت سبب آسیب به بافت های مختلف بدن از جمله کلیه و بیضه می گردد که در بعضی مواقع به ناتوانی جنسی منجر می شود. گیاهان دارویی برای درمان دیابت بطور وسیعی بویژه در کشورهای آسیای میانه رایج هستند و سازمان بهداشت جهانی نیز در مورد استفاده از این گیاهان در این کشورها توصیه هایی را ارائه نموده است (1). به با توجه به اهمیت بالای زعفران در ایران، سوابق پژوهشی زیادی در سایر کشورها موجود نمی باشد. لذا با توجه به اثرات نامطلوب دیابت بر سیستم تولید مثل در مردان و بافت بیضه، در این مطالعه اثرات عصاره آبی زعفران بعنوان یک ترکیب آنتی اکسیدانی بر روی شاخص های هیستوموروفومتریک و اسپرماتوژنز و سطح سرمی تستوسنرون و تحرک و قدرت زنده مانی اسپرم مورد بررسی قرار گرفت. غشای اسپرم بدلیل برخورداری از اسیدچرب غیر اشباع ، نسبت به استرس اکسیداتیو بسیار حساس می باشد و همانطور که مطالعات گذشته نشان داد عصاره ی آبی زعفران بدلیل خاصیت آنتی اکسیدانی ، می تواند از بروز استرس اکسیداتیو در بیضه جلوگیری کند(2و11). سفیدگر و همکارانش در سال 2019 نشان دادند که تحرک و زنده مانی اسپرم در گروه دیابتی درمان شده با کروسین که ماده موثره ی زعفران است، افزایش یافت (18). نتایج مطالعه ی ما نیز ثابت می کند که دیابت بر روی تحرک و زنده مانی اسپرم اثرات منفی دارد که این اثرات سو، عمدتا بدلیل اکسیداسیون گلوکز مازاد و در نتیجه آن تولید رادیکال های آزاد است. در مطالعه پیش رو نیز، عصاره آبی زعفران بعنوان یک ترکیب آنتی اکسیدان بر روی حرکات اسپرم مورد بررسی قرار گرفت که نتایج آن نشان داد عصاره ی آبی زعفران با دز متوسط یا 120 سبب افزایش بیشتر حرکات پیشرونده ی اسپرم و بهبود بیشتر اثرات سو دیابت بر روی اسپرم می شود. همانطور که مطالعات هالند و همکارارانش نشان داد دیابت سبب کاهش سطح سرمی تستوسترون و ایجاد قطرات چربی در سلولهای لیدیک بیضه که در حالت طبیعی قابل مشاهده نیست ، می شود (8). مطالعه ما نیز این مطلب را اثبات کرد و نشان داد عصاره آبی زعفران بعنوان یک ترکیب هیپوگلایسمیک با دز متوسط یا 120 سبب افزایش سطح سرمی تستوسترون و بهبود شکل ساختاری و عملکردی سلولهای لیدیک می شود. همانگونه که ذکر شد یکی از ترکیبات فعال موجود در عصاره آبی زعفران، کروسین است که این ماده با مکانیسم های مختلفی سبب افزایش سطح سرمی تستوسترون می شود. مدرسی و همکارانش نشان دادند کروسین حساسیت محور هیپوفوفیزیال-هیپوتالاموسی را برای کنترل بازخورد تستوسترون بر ترشح گنادوتروپین کاهش میدهد. همچنین، اثرات آنتی اکسیدانی کروسین ممکن است غلظت هورمون تستوسترون را در موش های آزمایشگاهی نر تغییر دهد (12).
مطالعات پیشین نشان داد باروری و اسپرماتوژنز تحت تاثیر دیابت، بدنبال کاهش قطر لوله های اسپرم ساز و قطر لومن و ضخامت اپی تلیوم لوله های اسپرم ساز و افزایش ضخامت غشای پایه لوله های اسپرم ساز ، کاهش می یابد (6و10). که مطالعه ما هم این مطلب را تایید میکند و عصاره آبی زعفران سبب افزایش قطر لوله اسپرم ساز و ضخامت اپی تلیوم آنها شد. دیابت همچنین سبب کاهش قطر لومن شد که گروههای درمان با عصاره ی آبی زعفران خصوصا گروههای تحت درمان با در 60 و 120 نتوانستند این کاهش را جبران کنند که علت آن را میتوان به شدت آسیب در موضع مورد نظر ربط داد. علاوه بر آن دیابت سبب کاهش شاخص تمایز لوله ای و شاخص اسپرمیوژنز می شود که متعاقب درمان با عصاره آبی زعفران با افزایش دز تدریجی ، این شاخص ها نیز بصورت تدریجی افزایش می یابند. نهایتا با توجه به نقش استرس اکسیداتیو در بروز عوارض ناشی از دیابت در بافت بیضه، استفاده از یک ترکیب دارای خاصیت آنتی اکسیدانی مثل عصاره ی آبی زعفران میتواند سبب بهبود و کاهش اثرات استرس اکسیداتیو و ROS ها در بافت بیضه شود. ROS ها (Reactive Oxygen Species) به خانواده رادیکالهای آزاد تعلق دارند که به خاطر داشتن حداقل یک الکترون جفت نشده در ساختار خود، بسیار واکنشپذیر بوده، بطوری که قادرند با انواع ماکرومولکولهای زیستی واکنش داده و نهایتاً منجر به اکسیداسیون آنها گردد. تولید کنترلشده و متعادل ROS توسط اسپرماتوزوآ و دیگر سلولها برای متابولیسم هوازی ضروری است، بهطوریکه در غلظتهای پایین، نقشهای فیزیولوژیکی زیادی برای سلولها دارند و به عنوان واسطهگرهای مهمی در مکانیسمهای پیامرسانی داخل سلولی عمل میکنند. اما تولید بیش از حد ROS ها اثرات زیانباری بر عملکرد سلول دارد (19و5). تحقیقات زیادی نشان داده اند که ROS ها با پراکسیداسیون اسید های چرب غیر اشباع در ناحیه سر و قطعه میانی اسپرم و به موجب آن تغییر مورفولوژی اسپرم، کاهش تحرک اسپرم در نقص عملکرد اسپرم نقش اساسی داشته باشد (4).
علی رغم القای دیابت توسط داروی استرپتوزوتوسین و بروز علائم بالینی در حیوانات آزمایشگاهی و بروز تلفات شدید در بین گروه های دیابتی, انجام دقیق آزمایشات سرمی و ارتباط آن با شاخص های اسپرماتوژنز و تحرک و زنده مانی اسپرم از جمله نقاط برجسته مطالعه پیش روی می باشد. همچنین در مطالعات بعدی میتوان نحوه ی بیماریزایی دیابت در بافت بیضه را از جنبه مولکولی مثل میزان بیان آنتی ژن های Bcl2,P53 و Caspase3 بررسی کرد.
نتیجه گیری
نتایج این مطالعه و آنالیز داده های آزمایشات موجود در آن، بر ایجاد آسیب روی بافت بیضه دراثر دیابت و اختلال در باروری مردان تاکید دارد و استفاده از عصاره آبی زعفران با خاصیت آنتی اکسیدانی میتواند در بهبود آسیب های حاصله بویژه حرکات طبیعی اسپرم که نقش اساسی در باروری و لقاح دارد، یاری دهنده باشد.
تضاد منافع: نویسندگان اعلام می کنند که هیچ تضاد منافعی ندارند.
تشکر و قدردانی
بدینوسیله نویسندگان از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی
مشهد که در انجام این پروژه مساعدت لازم را فراهم آوردند، مراتب تشکر و قدردانی خود را اعلام میدارند.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)