اثر تجویز خوراکی و مرکزی کلرید آلومینیوم روی فعالیت حرکتی و تعادل در موش صحرایی نر بالغ 

سهیلا مجدم^*،1 ، احمد علی معاضدی² و غلامعلی پرهام³

¹ اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش فیزیولوژی جانوری

² اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، بخش فیزیولوژی عصب

² اهواز، دانشگاه شهید چمران اهواز، دانشکده علوم ریاضی و کامپیوتر، گروه آمار

تاریخ دریافت: 7/5/89                تاریخ پذیرش: 22/1/91

چکیده

یکی از فراوانترین فلزات موجود بر روی پوسته زمین آلومینیوم می باشد و منابع گوناگونی از این فلز می­تواند انسان را در معرض آلودگی قرار دهد. آلومینیوم در غذا، آب، ترکیبات دارویی و محیط و... وجود دارد و براثر بارش باران اسیدی در خاک قرار می­گیرد. اختلالاتی از قبیل دمانس (ضایعه مغزی) در بیماری آلزایمر و همچنین اختلال اعمال حرکتی در بیماری پارکینسون در انسان و حیوان به افزایش میزان آلومینیوم مربوط می­شود. اما هنوز بطور یقین ثابت نشده که آلومینیوم نقش اساسی را در هر یک از این بیماریها بازی می­کند. به دلیل اهمیتی که آلومینیوم در ایجاد مسمومیت فیبرهای عصبی دارد احتمالاً باعث ایجاد اختلال در حرکت و تعادل در بیماری پارکینسون می­گردد. در این کار پژوهشی اثر تجویز خوراکی و مرکزی کلرید آلومینیوم روی فعالیت­های حرکتی و تعادلی موش صحرایی نر بالغ با استفاده از دستگاه روتارود مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت. معیارهای مورد نظر در این آزمایش، مقاومت حرکتی و حفظ تعادل می­باشند. با توجه به آزمایشات صورت گرفته مشخص گردید که در تجویز خوراکی و مرکزی کلرید آلومینیوم تعادل و هماهنگی موشها کاهش می­یابد. آلومینیوم یک نوروتوکسین انتخابی است و بعنوان یک سم سلولی با پپتیدهای طبیعی موجود در مغز ترکیب می­شود. آلومینیوم با مهار آنزیم­های دستگاه عصبی باعث کاهش انرژی سلولهای مغزی، خستگی و ناتوانی پیش­رونده‌ای می­شود. اختلال سیستم عصبی مرکزی توسط ترکیبات آلومینیوم یک انسفالوپاتی پیشرونده تولید می­کند.

واژه های کلیدی: روتارود، کلریدآلومینیوم، دمانس 

* نویسنده مسئول، تلفن: 09166084562، پست الکترونیکی:   mojadam_sh@yahoo.com

مقدمه 

آلومینیوم عنصر سمی بوده و افرادی را که در معرض ترکیبات یا پودر آن هستند مسموم می­کند و برای بافتهایی همچون مغز سمی می باشد.

غلظتهای متفاوت آلومینیوم که باعث ایجاد مسمومیت در اغلب فرآیندهای بیوشیمیایی می­گردند، حداقل در چندین مورد از اختلالات نرولوژیکی انسان یافت شده­اند، از جمله بیماری آلزایمر، سندرم داون، پارکینسون و.... نتایج تحقیقات وسیع نشان داده است که آلومینیوم با اثر بر عملکرد سیستم کولینرژیک بدن می­تواند نقصهای عصبی – رفتاری و اختلالات شناختی بوجود آورد (12). علاوه بر اختلالات شناختی، یکسری اختلالات بوجود آمده در اثر مسمومیت با آلومینیوم در ارتباط با حرکت می باشند. حیواناتی که در معرض آلومینیوم قرارگرفتند علائمی مثل لرزش (آتاکسیا) و عدم تعادل در حرکت را بعد از گذشت 2 هفته از خود نشان دادند. در مورد انسان علائمی از قبیل ناتوانی در بیان صحیح کلمات، عدم هماهنگی در حرکت ماهیچه­ها بهمراه از دست دادن احساس حرکتی آنها دیده شده است (16).

از جمله بیماریهای که براثر مسمومیت با آلومینیوم ایجاد گردیده و باعث بروز اختلالات حرکتی شده است، بیماری پارکینسون می‌باشد. این بیماری با لرزش غیرارادی ماهیچه­ها (ترمور)، کندی و کاهش حرکت، سفتی و ناپایداری وضعیتی، مشخص می گردد. این بیماری بندرت قبل از 40 سالگی بوجود می­آید (3). ویژگی پاتولوژیک اصلی بیماری پارکینسون، تحلیل سلولهای پیگمانته در جسم سیاه است. این سلولها درحالت طبیعی دوپامین را بعنوان ناقل عصبی سنتز می­کنند که اصطلاحاً نرونهای دوپامینرژیک نام دارند. روند دژنراتیو موجب کاهش قابل ملاحظه­ای در سنتز دوپامین و افت حاصل در غلظت آن در جسم سیاه و جسم مخطط (هسته دمدار و پوتامن) می‌گردد. کاهش دوپامین موجب افزایش نسبت استیل کولین/ دوپامین در سلولهای سیستم نایگرواستریاتال می­شود، زیرا غلظت استیل کولین در این بیماری تغییر نمی­کند. این عدم تعادل در اختلالات حرکتی موجود در بیماری پارکینسون نقش دارد (3). علاوه براین وجود فلزات سنگین در ایجاد پارکینسون مشخص گردیده است. مثلاً مرد72 ساله­ای که پس از مصرف قرصهای گیاهی ناشناخته­ای علائم پارکینسون را نشان داد مشخص گردید که غلظت منگنز سرم و سطح آلومینیوم بترتیب 2 و 5 برابر شده است (13). طی تحقیقی دیگر که روی میمونها انجام گرفت آنها را در معرض کلرید منگنز قرار دادند و مشاهده گردید که تعدادی از آنها علائم پارکینسون را از خود نشان دادند. منگنز در ابتدا گلوبوس پالیدوس و شبکه های جسم سیاه را مختل می­کند و به آرامی مسیر نایگرواستریاتال دوپامینرژیک را مختل می‌نماید. تجمع آهن و آلومینیوم احتمال دارد که با سمیت منگنز در ارتباط باشند (16). همچنین منگنز در معدنچیانی که در معرض غلظتهای بالای این فلز قرار داشته­اند، موجب بیماری پارکینسون شده است (3). هدف از این کار پژوهشی این بود که اثر کلرید آلومینیوم روی روند فعالیت حرکتی و تعادل موشهای مورد آزمایش بررسی گردد. طبق اثرات زیانبار آلومینیوم انتظار می­رفت تعادل و فعالیتهای موشها کاهش یابد. باتوجه به شواهد و مدارک فوق در این کار پژوهشی اثر تجویز خوراکی و مرکزی AlCl₃ روی فعالیت حرکتی و تعادل موشهای صحرایی نر بالغ با استفاده از دستگاه روتارود مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها  

در این کار تحقیقی حدود 35 سرموش صحرایی نر 3 ماهه نژاد NMRI از انستیتوی رازی حصارک کرج تهیه شد. از نظر وزنی همه موشها میانگین وزنی حدود 5±170 گرم داشتند. غذای حیوانات از کارخانه خوراک دام و طیور پارس تهران تهیه شده که بشکل کپسول فشرده در اختیار آنها قرار گرفت. موشها در شرایط 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی قرار گرفتند.

جهت تجویز خوراکی مقدار کلرید آلومینیوم بمیزان 600 میلی­گرم برکیلوگرم وزن بدن موش (1) را در cc25 آب مصرفی 24 ساعته برای هرموش) حل کرده بمدت 14 روز در اختیار موشهای مورد آزمایش قرار داده شد. محلول مورد نظر روزانه تهیه می­شد. برای تزریق داخل بطن- مغزی مقدار 8/1 گرم (11) کلرید آلومینیوم را در مقداری سرم فیزیولوژیک حل کرده و حجم محلول را به cc100رسانده و به ازاﺀهرکیلو گرم وزن بالا 5/. میکرولیتر استفاده شد که از طریق کانولی که در بطن چپ مغز موش تعبیه شده بود، به وسیله سرنگ هامیلتون بمیزان 5 میکرولیتر به هر موش تزریق گردید (11). در تجویز مرکزی AlCl₃ جهت کانول گذاری از دستگاه استریوتاکسی استفاده گردید.

برای این منظور با تزریق داخل عضلانی مقدار 78 میلی­گرم کتامین به ازاء هرکیلوگرم وزن بدن و 3 میلی­گرم رامپون به ازاء هرکیلوگرم وزن بدن (2) موش را بیهوش نموده، در دستگاه استریوتاکسی قرار داده می­شد. مختصات بطنهای جانبی طبق اطلس پاکسینوس و واتسون عبارتنداز: 7/0 تا 1/1 میلیمتر در جهت قدامی- خلفی، 6/1 تا 1/2 میلیمتر در جهت جانبی و 4/3 تا 5/3 میلیمتر بسمت داخل مغز (17). پس از تعیین نقطه مورد نظر قبل از آنکه کانول وارد آن گردد، دو سوراخ تقریباً در1 تا 2 میلیمتری اطراف آن ایجاد گردید و2 عدد پیچ عینک ضدعفونی شده را با پیچ گوشتی ظریفی در جمجمه فرو کرده که اینکار کمک به نگهداری و حفظ کانول در مدت آزمایش می­کند. سپس با در نظر گرفتن مختصات نقطه مورد نظر جهت ورود کانول، با استفاده از مته شماره 1 سوراخی سطحی روی جمجمه ایجاد می­گردد. سپس کانول با استفاده از دستگاه استریوتاکسیک در محل مورد نظر قرار داده می­شد. با استفاده از سیمان دندانپزشکی و محکم شدن کانول راهنما کمی پودر پنیسیلین روی ناحیه جراحی شده ریخته و سپس محل جراحی با استفاده از نخ بخیه استریل بخیه می­شود. موش را به قفس انفرادی منتقل کرده تا به هوش آید که حدوداً پس از 5-4 ساعت موشها به هوش می­آیند. یک هفته پس از جراحی و به اتمام رسیدن دورة بهبودی، AlCl₃ از طریق سرنگ هامیلتون بمیزان 5 میکرولیتر به هر موش تزریق گردید. زمان تزریق 20-15 ثانیه طول می­کشید. دستگاه مورد نیاز جهت بررسی اثرات تجویز خوراکی و مرکزی روی فعالیت حرکتی و تعادل دستگاه روتارود بود که اکنون به شرح مختصری در مورد آن پرداخته می شود.

دستگاه روتارود : روتارود دستگاهی است که جهت بررسی آزمایشهای رفتاری و حرکتی حیوانات بکار می­رود وبا استفاده از آن مقاومت حرکتی و حفظ تعادل حیوانات سنجیده می­شود (6 و 7 و 10 و 19). این دستگاه شامل یک گردونه است که از rpm 40-0 سرعت چرخیدن آن می­باشد. گردونه حدود cm 20 از زمین فاصله دارد و توسط تیغه­های مدوری به 4 قسمت مجزا تقسیم می­گردد که می­توان 4 موش را همزمان روی گردونه قرار داد. البته برای دقت عمل در انجام آزمایش در این کار پژوهشی در هر مرحله فقط یک موش مورد مطالعه قرار گرفت. دستگاه روتارود تسمه­ای دارد که با جابجا کردن آن می توان سرعت چرخیدن گردونه را تنظیم کرد.

در این بررسی سرعت چرخیدن rpm¹ 10 با شتاب rpm² 7 در نظر گرفته شد که تقریباً 11-10 دور در دقیقه بود. هنگامیکه موش روی گردونه قرار می­گرفت بمدت 60 ثانیه (ماکزیمم) گردونه شروع به چرخیدن می­کرد و مشاهده می­گردید که موش تا چه مدت قدرت حفظ تعادل و مقاومت حرکت روی گردونه را دارد. زمان مقاومت موش ثبت گردید و این عمل برای هر موش 3 مرتبه تکرار شد و میانگین بدست آمده در محاسبات آماری مورد استفاده قرار گرفت (15).

مراحل انجام آزمایشها و گروه بندی حیوانات : حیوانات مورد نظر متشکل از 35 سرموش صحرایی نربالغ 3 ماهه بودند که در 5 گروه 7 تایی تقسیم شده بودند.

1) گروه اول بمدت 2 هفته از آب معمولی تغذیه کرده بودند و هیچگونه آلومینیومی درآب آنها اضافه نشده بود، که بعنوان گروه کنترل تجویز خوراکی آلومینیوم درنظر گرفته شدند.

2) گروه دوم بمدت 2 هفته از آب آشامیدنی حاوی mg / kg600 AlCl₃ بطور روزانه تغذیه کردند که AlCl₃ با توجه به وزن موشها در cc25 آب مصرفی 24 ساعته موشها اضافه گردید.

3) گروه سوم پس از انجام عملیات جراحی وگذراندن دوره بهبودی بمدت1 هفته با غلظت mg/kg8/1AlCl ₃   در حجم 100 میلی لیتر سرم فیزیولوژی به ازاء هر موش 5 میکرولیتر از طریق کانول تعبیه شده تزریق گردید که این گروه بعنوان گروه آزمایش محسوب گردید.

4) گروه چهارم پس از دوره بهبودی بمدت1هفته روزانه بمیزان 5 میکرولیتر سرم فیزیولوژی از طریق کانول دریافت کردند که بعنوان گروه شاهد قرار داشتند.

5) گروه پنجم فقط عملیات بیهوشی روی آنها انجام گرفت که بعنوان گروه کنترل تجویزمرکزی آلومینیوم مورد بررسی قرار گرفتند و یک هفته بعد آزمونهای مورد نظر روی آنها انجام گرفت.

نتایج حاصل از تجویز خوراکی AlCl₃ : در این قسمت دو گروه موش قرار داشت که گروه اول با آب معمولی و گروه دوم کلرید آلومینیوم محلول در آب را بمدت دو هفته مصرف کردند.

طبق نتایج بدست آمده معلوم گردید که موشهائی که از آب معمولی استفاده کرده بودند از تعادل بهتری نسبت به گروه کنترل برخوردار بودند، و مدت زمان استقامت آنها در دستگاه روتارود بیشتر بود P< 0.05)) (شکل 1) . به عبارت دیگر گروهی که AlCl₃ در آب بشکل محلول استفاده کرده بودند، تعادل کمتری داشتند و در مدت زمان کمتری توانستند خود را بر روی گردونه دستگاه روتارود نگهدارند.

شکل 1-مقایسه فعالیت حرکتی با استفاده از دستگاه روتارود در گروه کنترل با گروهی که بمدت 2 هفته کلرید آلومینیوم محلول در آب مصرف کرده بودند.  (0.05>p)* و.(n=7) تجویز ٣AlCl خوراکی فعالیت حرکتی را بطور معنی داری کاهش می دهد.

نتایج حاصل از تجویز مرکزی AlCl₃ : در این قسمت سه گروه موش قرار داشت که گروه اول کلرید آلومینیوم را بصورت تزریق داخل بطن- مغزی دریافت کرده بودند و گروه دوم سالین را بصورت تزریق داخل بطن-مغزی دریافت کرده بودند و گروه سوم فقط عملیات بیهوشی روی آنها انجام شده بود.

شکل 2 - مقایسه فعالیت حرکتی با استفاده از دستگاه روتارود در دو گروهی که کلرید آلومینیوم و سالین را بصورت تزریق داخل بطن-مغزی دریافت کرده بودند با گروهی که فقط عملیات بیهوشی داشتند ( *p<0.05 ) و ( **p<0.01 ) و ( n=7 ) . گروهی که icv AlCl3 دریافت کرده بودند نسبت به دو گروه icv سالین و بیهوشی از تعادل کمتری برخوردار بودند.

شکل 3 ) مقایسه فعالیت حرکت با استفاده از دستگاه روتارود در دو گروه بیهوشی و icv سالین ( **p<0.01 ) و ( n=7 ) . گروهی که icv سالین دریافت کرده بودند در مقایسه با گروه بیهوشی تعادل بهتری را از خود نشان دادند.

شکل 4 - مقایسه فعالیت حرکتی با استفاده از دستگاه روتارود در دو گروه icv سالین و icv AlCl3 ( **p<0.01 ) و ( n=7 ) . گروهی که تحت icv AlCl3 قرار داشتند در مقایسه با icv سالین تعادل کمتری از خود نشان دادند.  

طبق نتایج حاصل مشخص گردید که موشهائیکه تزریق داخل بطن- مغزی سالین را داشته­اند از تعادل بالاتری نسبت به گروهی که کلرید آلومینیوم دریافت کرده­اند برخوردار بودند  P< 0.01)) (شکل 4). و مدت زمان بیشتری را بر روی گردونه دستگاه روتارود سپری کرده­اند. پس می­توان نتیجه گرفت که سالین در کاهش تعادل نقشی ندارد. موشهائیکه کلرید آلومینیوم دریافت کرده بودند روند رفتاری آنها بسیار کاهش یافته بود و از تعادل کمتری برخوردار بودند P< 0.05)) (شکل2). همچنین با مقایسه دو گروه بیهوشی و گروهی که سالین را به صورت تزریق داخل بطنی در یافت کرده بودند مشاهده گردید که عامل بیهوشی منجر به کاهش فعالیت حرکتی شده بود P< 0.01)) (شکل3). داروهای بیهوشی احتمالاً با مهار پیامهای عصبی آوران دریافت درد و کاهش فعالیت نخاع اثر خود را اعمال می کنند.

بحث

بیماریهای نورودژنراتیو وابسته به سن در انسان بعنوان یک مشکل اجتماعی و پزشکی می باشد. مشاهده گردیده که ظاهراً 3 حالت غیرمشابه از بیماریهای نورودژنراتیو در انسان به وفور رخ می­دهد از جمله: بیماری عصبی- حرکتی، بیماری پارکینسون و دمانس شبه آلزایمر (5 و9). مسمومیت با آلومینیوم بهمراه کمبود منیزیوم و کلسیم مدل مناسبی جهت بررسی آسیب شناسی بیماریهای نورودژنراتیو و رفتاری می­باشد (8). بهر­حال ارزیابی دمانس می بایست بعد از حدود یک سال جهت اطمینان از صحت تشخیص بیماری تکرار گردد­(20).

طبق نتایج حاصل از تجویز خوراکی، گروهی که از آب آشامیدنی حاوی کلرید آلومینیوم استفاده کرده بودند در مقایسه با گروه کنترل که آب معمولی مصرف نموده بودند تعادل کمتری داشتند و زمان کمتری را روی گردونه دستگاه روتارود سپری کردند. این نشان داد که کلرید آلومینیوم باعث کاهش تعادل در موشها گردید. مقایسه بین گروه شاهد که بشکل تزریق داخل بطن- مغزی سالین دریافت کرده بودند و گروه کنترل که فقط عملیات بیهوشی روی آنها انجام شده بود نشان داد که بین این دو گروه تفاوت معنی­داری وجود دارد. این نتیجه نشان داد که سالین در کاهش تعادل نقشی ندارد. با مقایسه گروه آزمایش که بشکل تزریق داخل بطن- مغزی کلرید آلومینیوم دریافت کرده بودند و گروه شاهد که به همان حجم سالین دریافت کرده بودند نشان داد که موشهایی که کلرید آلومینیوم دریافت کرده بودند از تعادل کمتری برخوردار بودند و اختلاف معنی­داری با گروه شاهد داشتند که باز نشان­دهنده نقش آلومینیوم در کاهش تعادل است. همه این نتایج اثر کلرید آلومینیوم را روی فعالیت حرکتی وتعادل موشها به خوبی نشان داد که مبین هدف ما از انجام این کار تحقیقاتی بود.

در گزارشی که اثر آلومینیوم و استرس را مورد ارزیابی قرار داده است نشان داده که هرچه مصرف خوراکی کلرید آلومینیوم در موشها بیشتر باشد اختلال حرکتی افزایش یافته و زمان سپری شده روی دستگاه روتارود کاهش می­یابد که مؤید نتایج بدست آمده دراین کار تحقیقی است. مشخص گردید که اگر درحین آزمایش علاوه بر تجویز کلرید آلومینیوم از عامل استرس­زا استفاده گردد، اغلب تغییرات فیزیولوژیکی و رفتاری در ارتباط با افزایش غلظت پلاسمایی کورتیکوسترون می­باشد. غلظت افزایش یافته کورتیکوسترون می­تواند اثرات رفتاری آلومینیوم القاء شده را افزایش دهد. این عمل با بالا بردن ضریب آسیب پذیری نورونها و نیز افزایش آلومینیوم ناشی از تجزیه استخوانها صورت می گیرد (15).

طبق نتایج بدست آمده همچنین گزارش شده است که موشهای باردار که از طریق تزریق داخل صفاقی کلرید آلومینیوم بمیزان 75 میلی­گرم برکیلوگرم در طی روزهای 15-6 بارداری بطور روزانه دریافت کردند پس از­30 روز که آزمون حرکتی با استفاده از روتارود بعمل آمد مشخص گردید که زمان سپری شده بر روی گردونه دستگاه روتارود کاهش یافته و موشها از تعادل کمتری برخوردار بودند (14) که با نتایج بدست آمده در این کار پژوهشی مطابقت دارد.

طبق نتایج بدست آمده از این کار تحقیقی مشخص گردید که اثر تجویز مرکزی کلرید آلومینیوم سریعتر از تجویز خوراکی آن می­باشد و احتمالاً ^٣+AL با رقابت کردن با ³⁺Fe می­تواند از سدخونی- مغزی عبور کرده و اثرات مخرب خود را اعمال کند (18). در طی­ تجویز خوراکی با عبور آلومینیوم در مسیر لوله گوارش و بعد از آن خون، امکان ترکیب شدن این فلز با سایر ترکیبات وجود دارد که برخی اثرات مخرب آلومینیوم را افزایش و برخی کاهش می دهند. در طی تجویز خوراکی طبق تحقیقاتی که صورت گرفته آلومینیوم از طریق غذا وارد خون و پس از آن با عبور از سدخونی و مغز وارد بافت مغزی می­شود که اغلب بطور مؤثر توسط فاکتورهای محیطی مثل جیوه یا مشتقات شیمیایی تضعیف می­گردد که این اثر امکان کاهش اثرات زیانبار آلومینیوم را بدنبال دارد (18). همچنین تجویز طولانی مدت ویتامین E آسیب اکسیداتیو در مغز را که بعلت ³⁺AL ایجاد شده است را مانع می­شود. همانطور که می­دانیم ویتامین E برسلولهای مغزی اثر محافظتی دارد وبه عنوان ماده­ای است که از ایجاد رادیکالهای آزاد در مغز جلوگیری می­کند و مانع زوال حافظه می­گردد (4).

در شرایط طبیعی تقریباً تمام آلومینیوم جذب شده از بدن دفع می­گردد و در طی تحقیق انجام شده شاید احتمالاً به نحوی مقداری از آلومینیوم جذب شده در بدن موشها از طریق سیستم روده­ای و کلیوی دفع گردیده و نسبت به تجویز مرکزی اثرات کمتری را نشان داده باشد.

آلومینیوم با عبور از سدخون و مغز وارد مغز می­گردد و در اغلب موارد پپتیدهای طبیعی موجود در مغز مثل بتااندورفین، عملاً با فلزات سنگین ترکیب شده و سمی می­گردند. داروهای بیهوشی هم احتمالاً با مهار پیامهای عصبی آوران، دریافت درد و کاهش فعالیت نخاع، اثرات خود را اعمال می­کنند. آنزیمهای سیستم عصبی با حضور آلومینیوم و دیگر فلزات سنگین مهار شده و در نتیجه همگی باعث کاهش انرژی سلولهای مغزی، خستگی و ناتوانی پیش رونده ای می شوند (17).