مقایسه بافت شناسی لوله های کلیوی مولدین ماهی سفید Rutilus frisii kutum در دو محیط لب شور (دریای خزر) و آب شیرین (رودخانه خشکرود)

زهرا قهرمان زاده¹، علی بانی^2*، جاوید ایمانپور نمین¹ و علی حلاجیان³

¹ صومعه سرا، دانشگاه گیلان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

² رشت، دانشگاه گیلان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

³ رشت، انستیتو تحقیقات بین المللی ماهیان خاویاری دکتر دادمان، بخش فیزیولوژی و بیوشیمی

تاریخ دریافت: 29/10/89             تاریخ پذیرش: 22/1/91 

چکیده

ساختار، اندازه و تعداد لوله های کلیوی مولدین ماهی سفید Rutilus frisii kutum در دو محیط لب شور (دریای خزر) و آب شیرین (رودخانه خشکرود) بررسی شد. تعداد 10 عدد ماهی سفید از سواحل بندر انزلی با شوری  ppt 49/8 ، درجه حرارت 4/12 درجه سانتی گراد و به همین تعداد نیز از رودخانه خشکرود با شوری ppt 18/0، درجه حرارت 18 درجه سانتی گراد جهت بررسی صید شدند. از سه قسمت کلیه (قدامی، میانی و خلفی) نمونه­های بافت برداشته شد. ویژگی کلیه ماهی سفید شامل شبکه گلومرولی، لوله­های دیستال، پروکسیمال و جمع کننده در دو محیط مقایسه شدند. تعداد لوله­های کلیوی ماهی سفید اختلاف معنی­داری بین دو محیط نداشتند (P>0.05). میانگین اندازه لوله­های دیستال، جمع کننده و شبکه گلومرولی در آب شیرین به طور معنی­داری بزرگتر از آب لب شور بود (P<0.05). میانگین اندازه لوله­های پروکسیمال در آب دریا نسبت به آب شیرین بیشتر بود اگر چه اختلاف معنی­داری مشاهده نشد (p>0.05).

واژه های کلیدی: ماهی سفید، لوله های کلیوی، شوری، دیستال، پروکسیمال

^* نویسنده مسئول، تلفن: 09113365710 ، پست الکترونیکی:  bani@guilan.ac.ir

مقدمه

شوری از فاکتورهای حیاتی است که زندگی، بقاء، متابولیسم و پراکنش ماهیان را در جریان روندهای رشد و نمو تحت تاثیر قرار می­دهد (1). ماندگاری یک گونه ماهی در شرایط خاص محیطی به میزان توانایی تطابق بدنی آن با شوری محیطی در مراحل مختلف زندگی وابسته است (22) .­جانداران برای بقای سلول های بدن، به تنظیم ترکیب اسمزی مایعات خارج سلولی(­خون، لنف و مایعات بین سلولی) نیازمندند. تنظیم اسمزی کنترل غلظت الکترولیت­ها و مواد آلی حل شده در مایعات بدن و حفظ و نگهداری تعادل آب و نمک ها می باشد (17).  ماهیان استخوانی به خوبی  قادر به حفظ فشار اسمزی و یونی بین مایعات بدن و محیط خارجی خود می­باشند. آبشش، کلیه و روده مهمترین اندام­های تنظیم کننده وضعیت اسمزی می باشند که باعث شیب اسمزی و یونی می­شوند (14).  آبشش­ها نقش مهمی در تنظیم اسمزی ماهیان دارند. سلول های کلراید آبشش، مکان اصلی جذب یون در ماهیان آب شیرین  و ترشح یون در ماهیان دریایی  می باشد (12 و 15) . علاوه بر آبشش، کلیه اندام مهم دیگر تنظیم کننده اسمزی می باشد که نقش فعالی در خروج یون های دو ظرفیتی و حذف آب اضافی به ترتیب در محیط های Hyperosmotic و Hypoosmotic دارد.

عضو کلیه در ماهیان استخوانی دارای تنوع وسیعی از نظر مورفولوژی می باشد که منعکس کننده تفاوت نیاز و ظرفیت آنها در دفع آب و نگهداری نمک در محیط­های مختلف می­باشد (26). تغییر در مورفولوژی کلیه یکی از استراتژی­های تنظیم اسمزی در ماهیان یوری هالین می باشد. عملکرد، مورفولوژی، اندازه و تعداد لوله های کلیوی، وابسته به شوری محیط می باشد که با تغییر شوری تغییر می کند. کلیه نقش مهمی در تنظیم اسمزی ماهیان استخوانی دریازی و آب شیرین زی بازی می کند، اگرچه نقش کلیه در شرایط آب شیرین و آب شور کاملاً متفاوت می باشد (3) . ماهیان استخوانی آب شیرین نسبت به محیط Hyperosmotic می باشند که در نتیجه آن با نفوذ آب به درون و خروج نمک از بدن مواجه هستند. در این شرایط NaCl از طریق جذب فعال از آبشش ها جایگزین می­شود (12) و آب اضافی از کلیه دفع می شود (20) . به منظور حفظ تعادل آب و نمک، بیشتر ماهیان استخوانی، نفرون های کلیوی دارند که شامل شبکه گلومرولی، لوله­های پروکسیمال، لوله های دیستال و مجاری جمع کننده می­باشند. شبکه گلومرولی و لوله­های دیستال مسئول دفع آب می باشند (5). بر خلاف ماهیان استخوانی آب شیرین، ماهیان دریایی با انتشار آب و جذب نمک مواجه هستند. در این شرایط نقش شبکه های گلومرولی و لوله های دیستال که دفع آب می باشد کمرنگ می شود. میزان فیلتراسیون گلومرولی (GFR) (Glumerular filtration rate) در ماهیان استخوانی آب شیرین بالا می باشد و تنها نسبت کمی از آب فیلتر شده در لوله های کلیوی جذب می شود (7). برعکس میزان فیلتراسیون گلومرولی در ماهیان استخوانی دریایی بسیار پایین تر می باشد(8). با توجه به نقش فعال کلیه در تولید ادرار رقیق در آب شیرین تعداد و اندازه لوله های کلیوی نسبت به آب دریا متفاوت می باشد (4).

ماهی سفید Rutilus frisii kutum متعلق به خانواده کپور ماهیان (Cyprinidea) و بومی دریای خزر می باشد، این گونه یوری هالین بوده و در فصل تولید مثل، جهت تخمریزی وارد رودخانه­های حاشیه دریای خزر(چلوند، لمیر، شفارود­، شلمانرود، سفیدرود، خشکرود، شیرود و بابلسر ) می­شود. این ماهی قادر به تحمل دامنه وسیعی از شوری می باشد، از اینرو مدل مناسبی جهت بررسی سیستم تنظیم اسمزی و اندام­های تنظیم کننده اسمزی می باشد. هدف از این مطالعه بررسی و مقایسه ساختار، اندازه و تعداد لوله­های کلیوی مولدین  ماهی سفید Rutilus frisii kutum خلاف ماهیان استخوانی آب شیرین، ماهیان دریایی با انتشار آب و جذب نمک مواجه هستند. در لوله های دیستال و مجاری جمع کننده می باشن در دو محیط آب لب شور دریای خزر و آب شیرین (رودخانه خشکرود) می باشد. 

مواد و روشها 

تعداد 10 عدد ماهی سفید با طول کلcm  76/5 ± 55/46 (متوسط طول ± SD ) در آذر ماه سال 1388 با استفاده از تور پره ساحلی در انزلی، گیلان با خصوصیات جغرافیایی 037 ^̊ 27 ^̕48.06 ^˝N, 049 ^̊ 34^̕ 17.40 ^˝E، با شوری ppt9/8 و درجه حرارت C˚ 4/12 صید شد. علاوه بر این در فروردین 1389 نیز تعداد 10 عدد ماهی سفید آماده تخمریزی با طول کل   cm52/4 ± 5/39 در رودخانه خشکرود در گیلان با خصوصیات جغرافیایی 037 ^̊03 ^̕13.44^˝ N, 050 ^̊26 ^̕26.65^˝ E،  با شوری ppt 18/0 و درجه حرارت ˚C 18 با فاصله حدود 500 متر از مصب رودخانه صید شد. 

بافت شناسی کلیه: بلافاصله پس از صید ماهیان و خالی نمودن امعاء و احشاء، از سه قسمت کلیه (قدامی، میانی و خلفی) آن ها به طور جداگانه نمونه بافت گرفته شد. نمونه های بافت­ها در فرمالین 4% فیکس شدند و جهت انجام عملیات بافت شناسی به آزمایشگاه انتقال داده شدند. پس از آبگیری و پارافینه کردن نمونه های بافت و قالبگیری،  برش های عرضی از بافت کلیه با ضخامت شش میکرون از بافت ها تهیه شد. سپس با روش هماتوکسیلین-ائوزین رنگ آمیزی شدند. به این ترتیب دو اسلاید بافت شناسی برای مطاله میکروسکوپی از هر بافت تهیه شد. در هر اسلاید 10 میدان بافتی از قسمت های مختلف و با بزرگنمایی های متفاوت عکس برداری شد. بررسی و اندازه­گیری های سلول­های مورد نظر با نرم افزار Biocom انجام پذیرفت. برای بررسی فراوانی لوله های دیستال، پروکسیمال­، جمع کننده و شبکه گلومرولی در دو محیط آب شیرین و آب شور سلول های مورد نظر در هر مقطع بافتی به صورت چشمی در هر 10 مقطع از هر اسلاید بافت شناسی شمارش شدند و میانگین آن ها محاسبه شد. برای اندازه­گیری سلول های کلیوی چندین سلول را به صورت تصادفی در هر مقطع بافت شناسی انتخاب نموده و به کمک نرم افزار Biocom مساحت آن ها با واحد میکرومتر مربع بدست آمد.

تجزیه و تحلیل آماری داده ها: آنالیز داده­های مربوط به اندازه لوله­های کلیوی با استفاده از آزمون One-way ANOVA انجام شد. از آزمون  chi-square برای مقایسه تعداد سلول های مورد نظر در دو محیط دریا و آب شیرین استفاده شد. داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS 13  مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند و به صورت میانگین ± انحراف معیار نشان داده شدند.  

نتایج

ساختار کلیه: کلیه ماهی سفید Rutilus frisii kutum اندامی باریک، طویل و به رنگ قرمز تیره بو د که در ناحیه پشتی دیواره بدن، درست در زیر ستون مهره­ها کشیده شده است. کلیه این ماهی از قسمت قدامی، میانی و خلفی تشکیل شده است. کلیه قدامی محل تجمع بافت خونساز می باشد که تا کلیه میانی و خلفی کشیده شده بود (شکل 1) اما توزیع آن در این قسمت­ها کمتر است. لوله های کلیوی در تمام قسمت های کلیه دیده شد اما تراکم آن ها در قسمت خلفی بیشتر بود.

لوله خمیده دیستال: ارتفاع لوله های دیستال کلیه ماهی سفید در هر دو محیط دریا و آب شیرین زیاد نبود و از اپیتلیوم ساده تشکیل شده بود. برخی از لوله های دیستال دارای شکل کشیده و طویل بودند اما سایر آن ها شکل کروی داشتند. هسته سلول های پوششی به شکل بیضی یا کروی بود (شکل 1 و 2). اختلاف معنی داری بین اندازه لوله های دیستال در دو محیط دریا و رودخانه مشاهده شد .(F=12.22, df=1, P<0.001) میانگین اندازه لوله های دیستال در مولدین صید شده در دریا (32/5206± 28/ 40474میکرومتر مربع) کوچکتر از مولدین صید شده در رودخانه (19/3340 ± 68/62092 میکرومتر مربع) بود (نمودار1). اختلاف معنی­داری در تعداد لوله های دیستال بین دو محیط مشاهده نشد (P>0.05). میانگین تعداد لوله­های دیستال در دریا و رودخانه به ترتیب 12/2 و 11/3 در هر مقطع بافت شناسی (با بزرگنمایی x20) بود. در بخش های مختلف کلیه (قدامی، میانی و خلفی) مولدین ماهی سفید دریایی و آب شیرین اختلاف معنی­داری بین اندازه و تعداد لوله­های دیستال مشاهده نشد (P>0.05). 

لوله جمع کننده: لوله­های جمع کننده مولدین ماهی سفید در دریا و آب شیرین دارای اشکال منظمی بودند. لوله­های جمع کننده از سلول­های اپیتلیال ستونی بلند تشکیل شده که از سلول های پوششی سایر لوله های کلیوی متمایز بودند. هسته سلول های لوله­های جمع کننده عمدتاً کروی و در قسمت مرکزی سلول قرار داشتند (شکل 1 و2). اندازه لوله های جمع کننده کلیه متاًثر از شوری محیط بود. به طوریکه میانگین اندازه آن در آب شیرین بزرگتر از آب دریا بود (F=25.51, df=1, P< 0.001. در آب دریا میانگین اندازه لوله های جمع کننده 06/1278± 194/15590 میکرومتر مربع و در آب شیرین 20/1347 ±72/24970 میکرومتر مربع بود (نمودار 1).

شکل1-  برش عرضی بافت کلیه ماهی سفید صید شده در دریا: لوله جمع کننده ادراری(ct) ، لوله خمیده نزدیک یا پروکسیمال (p)،  شبکه گلومرولی (g)، لوله خمیده دور یا دیستال (d) ، بافت خونساز (t) ( H&E, 20x)

شکل2-  برش عرضی بافت کلیه ماهی سفید صید شده درآب شیرین:  لوله جمع کننده ادراری(ct)، لوله خمیده دور یا دیستال (d) ، D-  لوله خمیده نزدیک یا پروکسیمال (p)،  شبکه گلومرولی (g)، (H&E, 20x)

لوله های جمع کننده در سه قسمت کلیه (قدامی، میانی و خلفی) از نظر تعداد اختلاف معنی­داری را نشان ندادند. در دریا میانگین تعداد  لوله­های سه قسمت کلیه­­14/1 و در رودخانه 33/1 در هر مقطع بافت شناسی (با بزرگنمایی X 20) بود. 

لوله خمیده پروکسیمال:  در هر دو محیط، حفره داخلی لوله های پروکسیمال کلیه مولدین ماهی سفید دارای پرزهای توسعه یافته بود. هسته سلول های لوله های پروکسیمال عمدتاً کروی و در قسمت پایینی سلول قرار داشت (شکل 1 و 2). اختلاف معنی­داری در اندازه لوله های پروکسیمال مشاهده نشد (F=1.0, df=1, P>0.05). ولی لوله­های پروکسیمال کلیه مولدین قبل از مهاجرت به رودخانه و در دریا دارای اندازه بزرگتری نسبت به رودخانه بود، در آب دریا میانگین اندازه لوله پروکسیمال 66/781± 55/22388 و در رودخانه 44/899 ± 54/20033 میکرومتر مربع بود (نمودار2).  

نمودار 1-  میانگین اندازه لوله های دیستال و  جمع کننده کلیه مولدین ماهی سفید در دو محیط دریا و آب شیرین (n=10 تعداد ماهی در هر منطقه)

نمودار 2-  میانگین اندازه لوله پروکسیمال کلیه مولدین ماهی سفید در دو محیط دریا و آب شیرین (n=10)

نمودار 3 - میانگین اندازه شبکه گلومرولی کلیه مولدین ماهی سفید در دو محیط دریا و آب (n=10)

میانگین تعداد لوله های پروکسیمال ماهی سفید در دریا و آب شیرین دارای اختلاف معنی­داری نبود (P>0.05)، به طوری که میانگین تعداد این لوله­ها در دریا و رودخانه در هر مقطع بافت شناسی (با بزرگنمایی X20) به ترتیب 32/14 و 33/13 بود. اندازه و تعداد  لوله های پروکسیمال در بخش های مختلف کلیه مولدین ماهی سفید در دو محیط دریا اختلاف معنی­داری را نشان نداد .(P>0.05) 

شبکه گلومرومرولی: کلیه مولدین ماهی سفید در آب شیرین دارای شبکه گلومرولی بزرگتری نسبت به آب دریا بودند(F=7.30, df=1, P<0.05) . میانگین اندازه شبکه گلومرولی (شکل های 1 و2) در آب شیرین 37/1418 ± 45/41760 و در دریا 37/1418 ± 17/35383  میکرومترمربع بود (نمودار3). تعداد شبکه گلومرولی در دریا 93/1 و در آب شیرین 33/2 بود که تقریباً مشابه یکدیگر بود (P>0.05). اگرچه میانگین اندازه فضای بومن در دو محیط دارای اختلاف معنی­داری نبود، با این وجود میانگین فضای بومن در رودخانه (­ 64/46میکرومتر مربع) کمی بزرگتر از دریا (24/41 میکرومتر مربع) بود.

بحث

لوله­های کلیوی مولدین ماهی سفید بعد از مهاجرت از دریای خزر به رودخانه در فصل تولید مثل تغییراتی را با توجه به تغییر شوری محیط نشان دادند. تغییر در مورفولوژی کلیه یکی از استراتژی­های تنظیم اسمزی در ماهیان یوری هالین می باشد. بنابراین مطالعه و بررسی نشان داد که عملکرد و مورفولوژی لوله­های کلیه وابسته به شوری محیط می باشد و با تغییر شوری تغییر می کند.  

اولین مرحله تنظیم اسمزی فیلتراسیون پلاسما به وسیله شبکه گلومرولی می باشد (2). در آب شیرین (رودخانه خشکرود) نسبت به آب دریای خزر اندازه شبکه گلومرولی مولدین ماهی سفید 11% افزایش نشان داد. ساختار شبکه گلومرولی در گونه های O. mykiss (7)، Mugil cephalus (19)، Etroplus maculates (23)، Silver sea bream (24) ،Huso huso (16) بررسی شده است. نتایج حاصل از این مطالعات نشان داد که در ماهیان آب شیرین تعداد و اندازه شبکه گلومرولی بزرگتر از ماهیان آب دریا بود. در آب شیرین قطر شبکه گلومرولی مولدین ماهی سفید بیشتر بود که این افزایش با بالا رفتن سطح فیلترسیون در محیط هیپواسمتیک مرتبط است. از نظر عملکردی مشاهده تغییرات شبکه گلومرولی در محیط هیپواسمتیک ممکن است وابسته به افزایش میزان فیلتراسیون گلومرولی و در نتیجه تولید ادرار زیاد و رقیق باشد. یکی از اختلافات اساسی بین کلیه ماهیان استخوانی آب شیرین و دریایی، نقش فیلتراسیون گلومرولی در تشکیل ادرار است. در آب شیرین میزان فیلتراسیون گلومرولی به منظور تولید ادرار رقیق و هیپواسمتیک بالا می باشد و مقدار ناچیزی از آب فیلتر شده، در لوله های کلیوی جذب می شود (7). به دلیل باز جذب بالای آب و ترشح لوله­ای یون های کلسیم، منیزیم، سولفات و فسفات (21) ادرار در ماهیان استخوانی دریایی در مقایسه با ماهیان آب شیرین کاهش می­یابد و ادرار تولید شده دارای غلظت بالایی می شود. در ماهیان استخوانی یوری هالین تغییر اندازه شبکه گلومرولی فیلتر کننده، مهمترین مکانیسم برای تغییر میزان فیلتراسیون گلومرولی کلیه ماهی می­باشد (24) و تغییر فیلتراسیون گلومرولی مولدین ماهی سفید پس از مهاجرت به آب شیرین به دلیل تغییر اندازه شبکه گلومرولی می باشد (8).

لوله های دیستال کلیه مولدین ماهی سفید در دو محیط دریا و رودخانه متفاوت بود و بعد از مهاجرت مولدین ماهی سفید به رودخانه جهت تخمریزی اندازه لوله های دیستال افزایش یافت. همچنین مولدین ماهی سفید در آب شیرین لوله های جمع کننده بزرگتر و متراکم تری نسبت به آب دریای خزر داشتند. کوچکتر بودن لوله های جمع کننده در آب دریا می تواند در ارتباط با تشکیل ادرار در محیط Hyperosmotic باشد (24). لوله های جمع کننده کلیه مولدین ماهی سفید در آب شیرین افزایش اندازه داشتند که موجب تسریع در جریان فیلتراسیون گلومرولی برای سازگاری هیپواسمتیک می شود. در مطالعه­ای که توسط ونگ و وو (24) انجام شد تعداد، اندازه و ضخامت لوله های جمع کننده بعد از انتقال سیم دریایی از آب شور با شوری های مختلف (6، 12، 33 و 50 ppt) به آب شیرین افزایش یافت.

در آب شیرین، اولین و اصلی ترین فعالیت  کلیه  دفع  آب

اضافی از بدن و در عین حال باز جذب یون های فیلتر شده است (5). لوله های دیستال و جمع کننده در ماهیان یوری هالین استخوانی، محل بازجذب فعال یون های Na⁺ و Cl^- هستند که فرآیند جذب این دو یون به فعالیت آنزیم Na⁺,K⁺-ATPase وابسته است (18). در ماهیان استخوانی آب شیرین نزدیک به 95% از یون های Na⁺ و Cl^- فیلتر شده در بخش دیستال و جمع کننده لوله های کلیوی، بازجذب می­­شود که نتیجه آن تولید ادرار رقیق است (3) . در مطالعه حاضر اندازه لوله­های دیستال مولدین ماهی سفید در آب شیرین بزرگتر از آب دریا بود که دلیل آن می تواند افزایش بازجذب یون­ها و تولید ادرار رقیق در محیط هیپواسموتیک باشد. اندازه لوله­های پروکسیمال کلیه در آب شیرین نسبت به آب دریای خزر تا اندازه ای کوچکتر بود. کریایوشکینا و همکارانش در سال (1996) نشان دادند که قطر لوله­های پروکسیمال کلیه فیل ماهی با افزایش شوری محیط، افزایش می یابد. بزرگتر بودن جزیی لوله­های پروکسیمال کلیه ماهی سفید در دریا به این دلیل بوده که لوله­های پروکسیمال ماهیان دریایی و یوری هالین ترشح یون های مختلف را بر عهده دارند (9 و 11). ترشح یون های دو ظرفیتی و همچنین یون های Na⁺ و Cl^- در طول لوله­های پروکسیمال انجام می شود. لوله پروکسیمال محل اصلی ترشح یون­های دو ظرفیتی در آب شور است (4). با این حال شواهدی مبنی بر ترشح لوله های پروکسیمال در آب شیرین وجود دارد (6 و0). نتایج حاصل از این مطالعه پیشنهاد می­کند که کاهش احتمالی فیلتراسیون گلومرولی به دلیل کاهش اندازه شبکه گلومرولی در ماهی سفید به وسیله تغییرات لوله­های کلیوی جبران می شود (16).  

در مطالعه حاضر بعد از قرار گرفتن ماهی سفید در محیط هیپواسمتیک تعداد لوله های کلیوی تغییر نکرد اما تغییر در اندازه آن ها مشاهده شد. در مطالعه­ای که توسط ونگ و وو (2006) روی سیم دریایی انجام شد، در آب شیرین و شوری ppt 6 اختلاف معنی­داری بین تعداد شبکه گلومرولی و لوله­های جمع کننده وجود نداشت در صورتی که اندازه آن­ها در شوری ppt 6 بیشتر بود. این در حالی است که در شوری­های بالاتر 12، 33 و 50 ppt تعداد شبکه گلومرولی و لوله جمع کننده نیز به طور معنی­داری بیشتر از آب شیرین بود. در مطالعه حاضر به دلیل پایین بودن نسبی اختلاف شوری آب لب شور دریای خزر و آب شیرین (ppt 3/8( سازگاری ماهی سفید به آب شیرین، بیشتر از طریق تغییر در اندازه لوله­های کلیوی صورت گرفته است(24). به هر حال برگشت پذیری تغییرات حاصل شده در کلیه ماهی سفید پس از برگشت به آب شور، موضوعی است که در آزمایشی قابل بررسی است. لوله­های کلیوی در ماهی سفید بعد از مهاجرت به آب شیرین جهت سازگاری با محیط جدید تغییر می کند. این تعییرات در واقع مکانیزم تحمل ماهی سفید در مواجه با شرایط هیپواسمتیک است (24).

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از آقایان مهندس رضوان ا.. کاظمی مسئول بخش فیزیولوژی انستیتو بین المللی ماهیان خاویاری دکتر دادمان، مهندس سهراب دژندیان، آقای نوردی، قنبریان، خانم مهندس یلدا هوشیار و سایر همکاران که در این تحقیق ما را یاری نمودند تشکر و قدردانی می گردد.