نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
دانشگاه تهران
چکیده
پکتین ترکیبی پلی ساکاریدی پیچیده است که علاوه بر دارا بودن فواید غذایی، دارای اثرات ضد سرطانی نیز است. نیتریک اکساید (NO) مولکول سیگنالیگ فعال در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیک است که در سلولهای توموری میتواند نقش آنتی آپوپتوتیک یا پروآپوپتوتیک داشته باشد. در این مطالعه، اثر AP (پکتین سیب) و MCP (پکتین تغییر یافته مرکبات) بر میزان ترشح NO و القای آپوپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی (LNCaP) مطالعه شده است. برای این منظور، سلول های LNCaP با دوزهای متفاوت AP و MCP در زمان های 6، 24 و 48 ساعت تیمار شدند و میزان آزاد شدن NO و مهار تکثیر سلولی توسط این مواد بررسی گردید. در ابتدا تیمار سلولهای LNCaP با SNP به عنوان یک دهنده NO، نشان داد که NO در سلولهای LNCaP نقش مهاری بر تکثیر سلول ها دارد. نتایج نشان میدهد که انکوباسیون 6 ساعت با دوزهای مختلف AP و MCP تغییری در سنتز و ترشح NO و میزان تکثیر سلولی ایجاد نمیکند. تیمار 24 و 48 ساعت موجب افزایش معنی دار ترشح NO و مهار تکثیر سلول ها در مقایسه با گروه کنترل گردید. بررسی چرخه سلولی در این سلول ها نشان داد که با افزایش غلظت پکتین تعداد سلولهایی که در مرحله Sub-G1 از چرخه سلولی هستند افزایش می یابد. این امر می-تواند نشان دهنده هدایت سلولها به سمت آپوپتوز باشد. این نتایج به همراه افزایش ترشح NO نشان میدهد که مشتقات پکتینی استفاده شده در این تحقیق میتوانند از مسیر رها سازی NO سبب القا آپوپتوز در سلولهای LNCaP گردند.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
Effect of Pectin Substances on NO Release and Apoptosis Induction in Human Prostate Cancer cells LnCap
چکیده [English]
Pectin is a complex polysaccharide compound with food and anticancer properties. NO as a signaling molecule. It plays role in various physiological process. It may have pro or anti apoptotic role in cancer cells. In this research the effect of apple pectin (AP) and modified citrus pectin (MCP) on NO releasing and apoptosis induction of human prostate cancer cell, LnCap, is under investigated. The cells were treated with different concentration of AP and MCP for 6, 24 and 48h. The amount of NO and proliferatin inhibition were studied. At first SNP treatment indicated that NO has an inhibitory role in LnCap cells. The results showed that long term incubation of cells with AP and MCP caused significant changes in NO release and proliferation rate. Under this condition cell cycle arrested in Sub-G1 phase though apoptosis was occurred. Therefore, AP and MCP could induce apoptosis in LnCap cell via NO release.
کلیدواژهها [English]
اثر مواد پکتینی بر القا رهاسازی نیتریک اکساید و مهار تکثیر سلولی در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی LNCaP
فاطمه منصوری، حوری سپهری* و لادن دلفی
تهران، دانشگاه تهران، پردیس علوم، دانشکده زیستشناسی، گروه علوم جانوری
تاریخ دریافت: 28/1/94 تاریخ پذیرش: 1/8/94
چکیده
پکتین یک ترکیب پلیساکاریدی پیچیده است که علاوه بر دارا بودن فواید غذایی، دارای اثرات ضد سرطانی نیز است. نیتریک اکساید (NO) یک مولکول فعال پیامرسان در بسیاری از فرآیندهای فیزیولوژیکی است که در سلولهای توموری میتواند نقش آنتیآپوپتوتیک یا پروآپوپتوتیک داشته باشد. در این مطالعه اثر AP (پکتین سیب) و MCP (پکتین تغییریافته مرکبات) بر میزان ترشح NO و القای آپوپتوز در دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی (LNCaP) مطالعه شده است. برای این منظور سلولهای LNCaP با دوزهای متفاوت AP و MCP در زمانهای 6، 24 و 48 ساعت تیمار شدند و سپس میزان آزاد شدن NO و مهار تکثیر سلولی توسط این مواد بررسی گردید. در ابتدا تیمار سلولهای LNCaP با SNP بهعنوان یک دهنده NO، نشان داد که NO در سلولهای LNCaP نقش مهاری بر تکثیر سلولها دارد. نتایج نشان میدهد که انکوباسیون 6 ساعتی با دوزهای مختلف AP و MCP تغییری در سنتز و ترشح NO و میزان تکثیر سلولی ایجاد نمیکند درحالیکه تیمار 24 و 48 ساعته موجب افزایش معنیدار ترشح NO و مهار تکثیر سلولها در مقایسه با گروه کنترل میگردد. بررسی چرخه سلولی در این سلولها نشان داد که با افزایش غلظت پکتین تعداد سلولهایی که در مرحله Sub-G1 از چرخه سلولی هستند افزایش مییابد. این امر میتواند نشاندهنده هدایت سلولها به سمت آپوپتوز باشد. این نتایج به همراه افزایش ترشح NO نشان میدهد که مشتقات پکتینی استفادهشده در این تحقیق میتوانند از مسیر رهاسازی NO سبب القا آپوپتوز در سلولهای LNCaP گردند.
واژههای کلیدی: پکتین، نیتریک اکساید، آپوپتوز، سلولهای LNCaP
* نویسنده مسئول، تلفن: 02161112626 ، پست الکترونیکی: hsepehri@khayam.ut.ac.ir
مقدمه
نتیریک اکساید (NO) یک پیامبر فیزیولوژیک لیپوفیل با قابلیت انتشار بالا و نیمهعمر کوتاه است که بسیاری از پاسخهای فیزیولوژیک نظیر کشیدگی عروق (Vascular tone)، تنفس سلولی، مهاجرت، ارتباطات سیناپسی، رگزایی، ایمنی و آپوپتوز را تنظیم میکند (10،8و19). NO بهوسیله آنزیمی به نام نیتریک اکساید سنتاز (NOS) از ال-آرژینین سنتز میشود. سه ایزوفرم مختلف از NOS به نامهای eNOS (اپیتلیومی)، nNOS (نورونی) وiNOS (القایی) شناخته شده است که فعالیت eNOS و nNOS بهشدت وابسته به غلظت کلسیم داخل سلولی است، در حالیکه iNOS در مقادیر طبیعی کلسیم نیز فعال میشود (3، 5 و26). NO در فرآیندهای سرطانزایی نقش تنظیمی مهمی دارد اما شناسایی نقش دوگانه NO در پیشرفت و یا سرکوب سرطان دشوار است (11و33). اثر NO بر وقایع پیامرسانی سلول بهشدت تحت تأثیر غلظت، نوع محیط و مدتزمان در معرض قرارگیری آن میباشد (3 و 9). بهطور کلی مقادیر پایین NO ضد آپوپتوزی بوده و رشد تومور را ترویج میبخشند، درمقابل مقادیر بالای NO در طولانی مدت از رشد تومور جلوگیری میکنند (9و8). عمدتاً NO طی واکنشی به نام S نیتروزیلاسیون (Nitrosylation) یا نیتراسیون (nitration) با سیستئین گروه تیول ترکیبشده و تولید نیتروزوتیولهای پایدار میکند. بسیاری از پروتئینها بهواسطه داشتن سیستئین با این واکنش قابل تنظیم هستند. NO بسیاری از اثرات خود را از این طریق ایجاد میکند (10). پکتین یک پلیمر طبیعی تشکیلدهنده دیواره سلولی در اغلب گیاهان است که حدود 70% آن از گالاکتورونیک اسید تشکیل شده است. پکتین بهطور وسیعی در صنعت غذایی بهعنوان قوام دهنده و تثبیتکننده مورد استفاده قرار میگیرد (20، 22 و 27). منابع اصلی استخراج پکتین پوست مرکبات، تفاله سیب و چغندرقند میباشد (2). اگرچه پکتین توسط مسیر فوقانی دستگاه گوارش هضم نمیشود اما فواید زیادی بر سلامت انسان دارد (18). پکتین دارای اثرات کاهنده کلسترول است و نقش مهمی در پیشگیری از بیماریهای قلبی، فشارخون و دیابت دارد. شواهد قابلتوجهی نیز در خصوص نقش پکتین در جلوگیری از سرطان و متاستاز وجود دارد (4، 7 و 28). پکتینها میتوانند با گالکتین (Galectin)(پروتئین متصل شونده به کربوهیدرات) سطح سلولهای سرطانی باند شده و در چسبندگی سلول-سلول و سلول-ماتریکس و درنتیجه متاستاز اختلال ایجاد کنند. پکتین نهتنها باعث مهار متاستاز میشود بلکه آپوپتوز را نیز در سلولهای سرطانی القا میکند (19،20 و 27). یکی از مکانیزمهای عمده مقاومت دارویی مهار مسیرهای آپوپتوتیک است که موجب پیشرفت تومورها میشود. لذا هدف بسیاری از درمانهای رایج برای سرطان القای آپوپتوز در آنها است (11و9). سرطان پروستات یکی از رایجترین سرطانهای شناخته شده است که متأسفانه درمانهای محدودی برای آن وجود دارد (6). هدف از این پژوهش بررسی اثرات ترکیبات پکتینی بر رشد سلولهای سرطان پروستات انسانی LNCaP و تولید نیتریک اکساید تحت تأثیر این مواد در سلولهای مذکور میباشد.
مواد و روشها
کشت سلول: دودمان سلولی سرطان پروستات انسانی LNCaP، از بانک سلولی ایران (NCBI) تهیه شد و در محیط RPMI-1640 (Gibco-USA) حاوی 10% سرم جنین گاو (Gibco-USA) (FBS) در شرایط بهینه (دمای 37درجه سانتیگراد، رطوبت 95% و CO2 5%) کشت داده شد. بهمنظور جلوگیری از آلودگی IU/ml 100 پنیسیلین و µg/ml 100 استرپتومایسین (Gibco-USA) به محیط کشت اضافه گردید. استوک MCP از Econugenic-USA، AP از Sigma-Switzerland و SNP از Merck- Germany تهیه گردید.
مورفولوژی و درصد بقا: سلولهای LNCaP با تراکم 104 سلول در هر چاهک پلیت 96 تایی کشت داده شد. سلولها پس از 24 ساعت با تعویض محیط در غلظتهای mg/ml 5 و 3، 5/1، 1، 5/0 از MCP و AP و نیز غلظتهای mM 10و 1، 5/0، 1/0 از SNP به مدت 6، 24 و 48 تیمار شدند. مورفولوژی سلولها با میکروسکوپ فازمعکوس (CETI- Belgium) و درصد بقا با استفاده از روش MTT در طولموج nm 570 موردبررسی قرارگرفت.
سنجش نیتریک اکساید: بهمنظور بررسی اثر مشتقات پکتینی و SNP بر ترشح نیتریک اکساید از روش غیرمستقیم سنجش NO بر پایه واکنش گریس (Griess) استفاده شد. تعداد 105 سلول در پلیت 24 تایی با غلظتهای مختلف AP، MCP و SNP به مدت 6، 24 و 48 تیمار شد. پس از تیمار µl 50 از محیط رویی هر چاهک به ترتیب و بافاصله زمانی 10 دقیقه با µl 50 سولفانیل آمید و NED (Merck- Germany) شیک و جذب در طولموج nm 490 با دستگاه پلیت ریدر (Bio Tek- UK) خوانده شد.
چرخه سلول: سلولها پس از کشت و تیمار با غلظتهای مختلف MCP و AP، به مدت یک ساعت در اتانول 70% و دمای 4 درجه سانتیگراد فیکس شدند. سپس رنگ PI اضافه گردید و چرخه سلول با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری(Beckman- Germany) و نرمافزار Flowjo بررسی شد.
DNA laddering: سلولها با غلظتهای مختلف MCP و AP تیمار شدند و سپس DNA با استفاده از کیت خریداریشده از شرکت سیناژن- ایران (Cinna pureDNA) استخراج گردید. در نهایت DNA بدست آمده بر روی ژل آگارز الکتروفورز شد. عکسبرداری از ژل با دستگاه ژل داک (uvi doc- UK) انجام شد.
آنالیز آماری: با استفاده نرمافزار SPSS version 16 و تست پارامتریک ANOVA یکطرفه و دوطرفه انجامشده است. 0.05>P بهعنوان اختلاف معنیدار محاسبه و نتایج بهصورت SEM ± میانگین (3= n) نشان دادهشده است.
نتایج
مورفولوژی سلولها: سلولهای LNCaP، سلولهای اپیتلیالی چسبنده میباشند که بهصورت نرمال کشیده و زاویهدار هستند و سلولهای در حال تقسیم نیز بین آنها دیده میشود (شکل1).
شکل1- مورفولوژی سلولهای LNCaP در حالت طبیعی بدون تیمار، سلولها کشیده و به کف چسبیده هستند. علامت پیکان یک سلول در حال تقسیم را نشان میدهد(25X) .
سلولها پس از 24 ساعت با غلظتهای پایین مواد پکتینی تغییر محسوسی را متحمل نشدند در حالیکه تیمار 24 ساعت با غلظت mg/ml5 مواد پکتینی سبب ایجاد تغییرات قابلمشاهدهای شامل گرانوله شدن سلول و کاهش حجم در مقایسه با حالت طبیعی گردید (شکل2bوc) و (شکل3 b و c).
اثر مشتقات پکتینی و SNP بر درصد بقا: MTT یک سوبسترای زردرنگ است که میتواند وارد سلولهای زنده شود و در صورت وجود میتوکندری فعال در سلول به شکل کریستالهای آبی به نام فورمازان درون سلول ظاهر شود. این کریستالها در حلال(DMSO) حلشده و جذب آن قابلاندازهگیری است. رابطهای مستقیم بین میزان جذب و تعداد سلولهای زنده وجود دارد. نتایج تست MTT نشان داد که تیمار 6 ساعت سلولهای LNCaP با مواد پکتینی و نیز SNP اثر معنیداری بر کاهش درصد بقای این سلولها نسبت به گروه کنترل ندارد. در حالیکه انکوباسیون 24 و 48 ساعت این سلولها با مواد پکتینی و نیز SNP با افزایش دوز موجب کاهش معنیدار بقای سلولها نسبت به گروه کنترل میشود (شکلهای 4، 5 و 6). لازم به ذکر است با استفاده از تست Anova دوطرفه اختلاف معنیداری بین ساعت 24 و 48 مشاهده نگردید.
شکل 2- مورفولوژی سلولهای LNCaP تیمار شده با دوز بیاثر پکتین: a) گروه کنترل b) AP (mg/ml1) c)MCP (mg/ml1) دوز بیاثر سبب تغییر محسوسی در مورفولوژی سلولها نسبت به گروه کنترل نمیشود(25X) .
شکل3- مقایسه مورفولوژی سلولهای تیمار شده با دوز مؤثر (mg/ml 5) : a) کنترل b) AP c) MCP همانطور که در تصویر نشان دادهشده است سلولها تحت اثر غلظتهای بالای مواد پکتینی چروکیده میشوند و حالت طبیعی خود را از دست میدهند. در تیمار با MCP گرانوله شدن سلولها نیز قابلرؤیت است (25X).
سنجش نیتریک اکساید با واکنش گریس: ازآنجاکه NO یک گاز ناپایدار است بهسرعت به متابولیتهای خود یعنی نیتریت و نیترات تجزیه میشود. در این روش نیتریت نخست با سولفانیلآمید واکنش داده و یک نمک ناپایدار دیازونیوم راتشکیل میدهد. سپس این واسطه با محلول دوم واکنش NED واکنش میدهد و ترکیبات پایدار آزو را تولید میکند. شدت رنگ صورتی حاصل بهمنظور سنجش مقدار نیتریت با دستگاه پلیت ریدر قابلاندازهگیری است. رابطه مستقیمی بین مقدار جذب و میزان ترشح نیتریک اکساید وجود دارد. مقدار ترشح نیتریک اکساید از طریق فرمول زیر محاسبه میشود.
شکل4- درصد بقای سلولهای LNCaP پس از تیمار با غلظتهای مختلف SNP در زمان 24و 48 با استفاده از تست MTT. مقادیر ارائهشده معادلS.E.M mean 15آ±"> میباشد. (3n= و0.05>P * = ). همانطور که مشاهده میشود تیمار 24 ساعت با غلظتهای mg/ml 1 و 5/0، 1/0 موجب کاهش معنیدار بقای سلولها نسبت به گروه کنترل میشود. نتایج در تیمار 48 ساعت نیز به همان شکل میباشد.
شکل5- درصد بقای سلولهای LNCaP پس از تیمار با غلظتهای مختلف MCP در زمان 24و 48 با استفاده از تست MTT. مقادیر ارائهشده معادلS.E.M mean 15آ±"> میباشد. (3n= و0.05>P *=). تیمار 24 ساعت فقط در غلظت mg/ml5 موجب کاهش معنیدار بقای سلولها نسبت به گروه کنترل میشود در حالیکه تیمار 48 ساعت موجب کاهش معنیدار بقای سلولها در سه غلظت mg/ml 5، 3، 5/1 میگردد.
SNP یک دهنده NO است و در این پژوهش بهعنوان کنترل مثبت مورداستفاده قرارگرفت. هدف از استفاده از یک کنترل مثبت (SNP) حصول اطمینان از مهار تکثیر سلولهای LNCaP بهوسیله NO آزادشده میباشد. تیمار 24 ساعت با SNP در غلظتهای mM 1 و 5/0 موجب افزایش معنیدار ترشح NO نسبت به گروه کنترل گردید.
شکل6- درصد بقای سلولهای LNCaP پس از تیمار با غلظتهای مختلف AP در زمان 24و 48 با استفاده از تست MTT. مقادیر ارائهشده معادلS.E.M mean 15آ±"> میباشد. (3n= و0.05>P * =). تیمار 24 و 48 ساعت سلولها در غلظتهای mg/ml 5، 3، 5/1 اسیدپکتیک موجب کاهش معنیدار بقای سلولها نسبت به گروه کنترل میگردد.
این در حالیاست که تیمار 48 ساعت سلولها با SNP افزایش معنیداری نسبت به تیمار 24 ساعت نشان نداد (شکل7). تیمار 24 ساعت سلولهای LNCaP با AP و MCP در غلظتهای mg/ml 5 و 3، 5/1، 1 موجب افزایش معنیدار ترشح NO نسبت به گروه کنترل در این سلولها شد (شکلهای 8 و 9). لازم به ذکر است که تیمار AP و MCP در تیمار 48 ساعت افزایش معنیداری در ترشح NO نسبت به ساعت 24 ایجاد نکردند.
شکل7-اثر غلظتهای متفاوت SNP بر ترشح نیتریک اکساید در سلولهای LNCaP پس از 24 ساعت. غلظتهایmM 1، 5/0 باعث افزایش معنیدار ترشح نیتریک اکساید در سلولهای تحت تیمار نسبت به گروه کنترل میشوند. مقادیر ارائهشده معادل mean±S.E.M میباشند. (0.001>P = ***،0.01>P = **،0.05>P = *و3 n=)
شکل8- اثر غلظتهای متفاوت AP بر ترشح نیتریک اکساید در سلولهای LNCaP پس از 24 ساعت. غلظتهای mg/ml 5 و 3، 5/1، 1 باعث افزایش معنیدار ترشح نیتریک اکساید در سلولهای تحت تیمار نسبت به گروه کنترل میشوند. مقادیر ارائهشده معادل mean±S.E.M میباشند (0.001>P = ***،0.01>P = **،0.05>P = *و3 n=)
نمودار 9- اثر غلظتهای متفاوت MCP بر ترشح نیتریک اکساید در سلولهای LNCaP پس از 24 ساعت. غلظتهای mg/ml 5و3 باعث افزایش معنیدار ترشح نیتریک اکساید در سلولهای تحت تیمار نسبت به گروه کنترل میشوند. مقادیر ارائهشده معادل mean±S.E.M میباشند. (0.001>P = ***،0.01>P = **،0.05>P = *و3 n=)
چرخه سلولی: در مراحل پایانی آبشار آپوپتوتیک، DNA کروموزومی توسط آنزیم اندونوکلئاز به قطعات نوکلئوزومی تجزیه میگردد. درنتیجه شمار زیادی از قطعات DNA که اندازه آنها در حدود bp 180 است در داخل سلول انباشته میشوند. اگر این سلولها با اتانول فیکس و مجدداً هیدراته شوند قطعات DNA با وزن مولکولی پایینتر از دیواره سلول نشت میکنند. درنتیجه محتوای DNA سلولهای آپوپتوزی از محتوای DNA سلولهای طبیعی کمتر بوده و این سلولها با پیک Sub-G1 در هیستوگرام DNA قابلمشاهده هستند (25). لذا تعداد سلولهای موجود در فاز Sub-G1 میتواند شاخصی برای احتمال وقوع آپوپتوز باشد. تیمار 24 ساعت سلولهای LNCaP با AP بهصورت وابسته به دوز سبب افزایش تعداد سلولهای در ناحیه Sub-G1 در مقایسه با گروه کنترل گردید. تیمار سلولها با MCP نیز بهصورت وابسته به دوز سبب افزایش تعداد سلولها در فاز Sub-G1گردید. درصد سلولهای موجود در فاز Sub-G1 در تیمار 24 و 48 ساعت با AP و MCP در جدول 1 نشان داده شده است. اگرچه تیمار 48 ساعت سلولها با مواد پکتینی درصد سلولهای موجود در فاز Sub-G1 را میافزاید اما این افزایش در مقایسه با ساعت 24 معنیدار نمیباشد.
جدول1- اثر AP و MCP بر پیشرفت چرخه سلولی در سلولهای LNCaP با روش فلوسایتومتری
شکل10- هیستوگرام چرخه سلولی برای سلولهای LNCaP در حالت کنترل
شکل 11- هیستوگرام چرخه سلولی سلولهای LNCaP پس از تیمار با, MCP AP
نردبان DNA : یکی از ویژگیهای کلاسیک آپوپتوز شکستن DNA ژنومی به قطعات کوچکتر bp 200-180 است. نردبان DNA یک روش کیفی برای ارزیابی مرگ سلول با استفاده از شناسایی این قطعات میباشد. در این روش سلولهای آپوپتوتیک یک نردبان مجزا تشکیل میدهند در حالیکه سلولهای نکروتیک تشکیل اسمیر میدهند (یا اصلاً DNA شأن قطعهقطعه نمیشود). DNA سلولهای سالم نیز بهصورت یک باند با وزن مولکولی زیاد در بالای ژل باقی میماند (12). همانطور که در تصویر مشخص است در غلظتهای mg/ml 5، 3، 5/1 از AP و MCP، DNA خردشده است در حالیکه DNA نمونه کنترل بهصورت یک باند در بالای ژل قرارگرفته است (شکل 12).
بحث
با توجه به روند افزایشی بروز سرطان در اندامهای مختلف بدن نیاز به درمانهای مؤثر با حداقل عوارض جانبی ضروری به نظر میرسد. در این رابطه برخی از مولکولهای زیستی غیرسمی داری خاصیت ضد توموری بوده و قادر به کاستن دوز مصرفی داروهای شیمیایی هستند (34). پکتین یکی از عمدهترین ترکیبات دیواره سلولی و احتمالأ پیچیدهترین ماکرومولکول طبیعت است که دارای اثرات ضد سرطانی میباشد (1و31). متأسفانه سلولهای انسان قادر به تولید آنزیم تجزیهکننده پکتین نیستند لذا استفاده از برگههای اصلاح شده آنها گسترش یافته است (24). MCP پکتین تغییریافته مرکبات با pH است که در آب راحتتر حلشده و قابلیت جذب بالاتری در بدن دارد (32 و 33). مطالعات درون تنی وبرون تنی نشان دادهاند که MCP بهطور مؤثری بر ضدسرطانهایی نظیر پروستات، کولون، سینه، ملانوما، (Multiple Myeloma) و همانژیوسارکوم (Hemangiosacrum) عمل میکند (17). احتمالاً MCP اثرات خود را از طریق مهار گالکتینها و بهویژه گالکتین3 (Gal3) ایجاد میکند.
شکل 12- DNA استخراجشده از سلولهایLNCaP تیمار شده با غلظتهای مختلف AP و MCP. وجود اسمیر در تمامی غلظتهای AP و MCP و بهخصوص در غلظتها بالاتر مشاهده گردید.
Gal3 متنوعترین عضو از خانواده لکتینهای باند شونده به گالاکتوز است که در طیف گستردهای از عملکردها نظیر تکثیر سلولی، آپوپتوز، رگزایی، پیشرفت تومور و متاستاز دخیل است (13و14). اوکامی و همکاران نشان دادند که پکتین سیب میتواند تعداد تومورهای کولون در موشهای تحت تأثیر آزوکسی متان را کاهش دهد در حالیکه پکتین مرکبات چنین اثری را نشان نمیدهد (23). در سال 2010 نیز لی و همکاران اثر پکتین تغییریافته سیب (MAP) را بر سه نوع دودمان سلولی سرطان کولون موردبررسی قراردادند و دریافتند که MAP اثرات مهاری بر رشد دارد و آپوپتوز را نیز در این سلولها القا میکند، همچنین عملکرد مهمی در جلوگیری از متاستاز کبدی میباشد (13، 27 و 32). نقش NO در اتیولوژی و پیشرفت سرطان بسیار پیچیده است. NO تحت شرایط ویژه میتواند ژنوتوکسیک باشد، درعینحال مطالعات متعددی بر نقش سرکوبکننده NO در فنوتیپ بسیاری از سرطانها تأکید دارد. اثرات تحریکی و مهاری NO بر پیشرفت سرطان وابسته به فاکتورهای متنوعی است. NO در جنبههای مختلف متاستاز نیز تأثیرگذار است این در حالی است که 90% مرگومیر ناشی از سرطان به دلیل متاستاز میباشد (8).
هدف از این پژوهش
1- بررسی نقش مهاری یا تحریکی NO بر بقای سلولهای LNCaP
2- تولید NO تحت تأثیر MCP, AP در سلولهای LNCaP
3- بررسی نقش مشتقات پکتینی در مهار سلولهای LNCaP
4- ارتباط احتمالی مهار تکثیر و تولید NO در این سلولها
تیمار سلولهای LNCaP با غلظتهای مختلف SNP بهعنوان یک دهنده NO موجب کاهش معنیدار بقای سلولها در تمام دوزهای مورداستفاده گردید. بنابراین میتوان نتیجه گرفت که NO در سلولهای سرطان پروستات نقش پروآپوپتوتیک داشته و بر بقای سلولها اثر مهاری دارد. درصد بقای سلولها در حضور مواد پکتینی با استفاده از تست MTT نیز موردبررسی قرارگرفت و مشاهده شد که MCP و AP هر دو موجب کاهش معنیدار درصد بقای سلولها نسبت به حالت کنترل میگردند. با تعیین اثر مهاری ترکیبات پکتینی بر بقای سلولهای LNCaP، بار دیگر سلولها بهمنظور سنجش مقدار NO آزادشده با MCP و AP تیمار شدند. این بار تیمار 24 و 48 ساعت هر دو ترکیب پکتینی افزایش معنیدار تولید NO را موجب شد. بهمنظور تأیید اثر کاهشی مواد پکتینی بر بقای سلولهای LNCaP، میزان تخریب DNA سلولهای تیمار شده با استفاده از روش DNA laddering و نیز تغییرات چرخه سلولی با استفاده از تکنیک فلوسایتومتری موردبررسی گرفت. خرد شدن DNA در تمامی سلولهای تیمار شده با غلظتهای موردنظر MCP و AP مشاهده گردید که این خرد شدن هم مشخصه سلولهای آپوپتوتیک و هم نکروتیک است. نتایج حاصل از بررسی چرخه سلولی نیز نشان داد که درصد Sub-G1 و درنتیجه وقوع آپوپتوز در سلولهای LNCaP تحت تیمار، بهصورت وابسته به دوز افزایشیافته است. این مشاهده میتواند مؤید وقوع آپوپتوز در این سلولها باشد. بهطور کلی در این تحقیق مشاهده شد که مواد پکتینی بر بقای سلولهای LNCaP اثر کاهشی داشته و بسیار محتمل است که این اثر از طریق القای آپوپتوز باشد، چراکه رنگآمیزی با پروپیدیوم آیوداید (PI) و انجام تست نکروز و نیز رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید و آکریدین اورنج، حاکی از سطح بسیار پایین سلولهای نکروتیک در تیمار با مواد پکتینی است. اگرچه گزارشهایی مبنی بر عدم بیان گالکتین 3 در سلولهای LNCaP وجود دارد (29و30)، اما گزارشات نشان دادهاند که سایر انواع گالکتینها و بهویژه گالکتین 1 نیز بهاندازه گالکتین3 در پیشرفت سرطان دخیلاند و این گالکتین به میزان زیادی در سلولهای LNCaP بیان میشود. لازم به ذکر است که گالکتین 1 به دلیل رفتار پیش برنده آپوپتوز یک هدف درمانی بالقوه برای درمان سرطان است (16 و 21). به نظر میرسد که مسیر اثرات پکتین در این سلولها از طریق مسیری مستقل از گالکتین3 میباشد. از طرف دیگر با توجه به افزایش ترشح NO در حضور AP و MCP میتوان احتمال آپوپتوز در این سلولها، حداقل در بخشی از طریق تولید NO باشد زیرا در مقایسه با SNP که کنترل مثبت بوده است، تأیید این مطلب را میتوان مشاهده کرد. در توضیح این موضوع شاید بتوان اثر NO را با کلسیم مرتبط دانست. NO میتواند از طریق نیتروزیلاسیون، رسپتورهای رایانودینی و NMDA را تحت تأثیر قرار بدهد (10 و 15). با افزایش کلسیم سیتوزولی، بار کلسیم در میتوکندری نیز افزایش خواهد یافت. افزایش کلسیم میتوکندری نیز بهنوبه خود موجب نفوذپذیری غشای آن و آزادسازی فاکتورهای آپوپتوتیک و در نهایت آپوپتوز میشود (16). اما قطعاً بهمنظور ردیابی مسیرهای انتقال پیام آزمایشهای مولکولی دقیقتر و بیشتری لازم است.