مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

تاثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) بر کیفیت منی قوچ عربی طی ذخیره آن در 5 درجه سانتی گراد

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان

2 دانش آموخته کارشناسی ارشد گروه علوم دامی، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان

چکیده

در طی ذخیره‌سازی منی، آسیب‌های ناشی از اکسیداسیون از علل مهم کاهش کیفیت و قدرت باروری اسپرم‌ها می-باشد. هدف از مطالعه‌ حاضر، بررسی تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) به عنوان یک آنتی‌اکسیدان بر کیفیت منی قوچ عربی طی ذخیره آن به حالت مایع تحت دمایC °5 بود. اسپرم‏گیری از 8 رأس قوچ عربی خوزستان به طور هفتگی برای مدت 8 هفته انجام و منی آن‌ها بلافاصله با هم مخلوط شد. نمونه منی مخلوط و رقیق شده سپس به 5 قسمت تقسیم و هر کدام یکی از سطوح 0، 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد آلبومین سرم گاو را دریافت کردند. در زمان‏های 1، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از نگهداری منی در C°5، فراسنجه‏های کیفی منی بررسی شدند. در زمان 1 ساعت، سطوح BSA فقط باعث کاهش میزان ناهنجاری‌های مورفولوژیکی اسپرم‌ها در مقایسه با شاهد شدند (05/0>P). 24 ساعت پس از ذخیره منی، تمام مقادیر BSA موجب بهبود اغلب فراسنجه‌های کیفی اسپرم شدند (05/0>P). طی 48 و 72 ساعت از ذخیره منی، سطوح 5/0 تا 5/1 درصد، عملکرد بهتری در بهبود فراسنجه‌های کیفی اسپرم داشتند (05/0>P). در زمان 96 ساعت، سطوح 5/0 و 1 درصد بهترین تاثیر در حفظ تحرک و زنده‌مانی و نیز کاهش ناهنجاری‌های اسپرم داشتند (05/0>P). میزان pH منی در تمام زمان‌ها تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفت (05/0>P). بطور کلی، با افزایش زمان نگهداری منی قوچ عربی، سطوح پایین BSA (کمتر از 2 درصد و ترجیحا 5/0 و 1 درصد) باعث بهبود معنی‌دار فراسنجه‌های کیفی اسپرم بدون تأثیر بر pH منی شدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of different levels of bovine serum albumin (BSA) on semen quality of Arabi ram during storage in 5°C

نویسندگان [English]

  • saleh Tabatabaee 1
  • Roghayeh Zeidi 2
  • Morteza Mamooee 1
  • Khalil Mirzadeh 1

1 Animal Science Dept., Faculty of Animal and Food Sciences, Khuzestan Agricultural and Natural Resources University, Ahvaz, I. R. of Iran

2 Animal Science Dept., Faculty of Animal and Food Sciences, Khuzestan Agricultural and Natural Resources University, Ahvaz, I. R. of Iran

چکیده [English]

During the semen storage, oxidative damages are the major causes of decrease in sperm quality and its fertility potential. The aim of this study was to evaluate the effect of different levels of bovine serum albumin (BSA) as an antioxidant on semen characteristics of Arabi ram in various times of semen storage in liquid condition under 5°C. Semen samples were collected weekly from 8 Arabi rams for 8 weeks and pooled. After dilution, the semen sample was divided into 5 parts which received the different levels of BSA (0, 0.5, 1, 1.5 or 2 percent). In each part, semen quality characteristics were evaluated at different storage times (1, 24, 48, 72 or 96 h). In 1h of storage, BSA levels only decreased the morphological defects of spermatozoa than control (P<0.05). After 24h storage, all levels of BSA, improved the most of sperm quality parameters (P<0.05). During 48 and 72h of semen storage, 0.5 and 1percent of BSA had the better performance (P<0.05). At the final storage time or 96h, 0.5 and 1 percent of BSA had the best performance in maintenance of motility and viability and decrease the morphological defect rates of spermatozoa (P<0.05). The pH of semen in all storage times was not affected by treatments (P>0.05). Overall, with increasing the storage times of Arabi ram semen, lower levels of BSA (below than 2 percent and preferably 0.5 and 1 percent) significantly improved the sperm quality parameters without effect on pH of semen.

کلیدواژه‌ها [English]

  • BSA
  • Quality
  • Ram
  • Semen storage
  • sperm

تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی(BSA) بر کیفیت منی قوچ عربی طی ذخیره­­ آن در 5 درجه­ سانتی­گراد

صالح طباطبائی وکیلی*، رقیه زیدی کمره، مرتضی مموئی و خلیل میرزاده

اهواز، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، دانشکده علوم دامی و صنایع غذایی، گروه علوم دامی 

تاریخ دریافت: 11/5/95                تاریخ پذیرش: 10/4/96 

چکیده

در طی ذخیره­سازی منی، آسیب­های ناشی از اکسیداسیون از علل مهم کاهش کیفیت و قدرت باروری اسپرم­ها می­باشد. هدف از مطالعه­ حاضر، بررسی تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) به‌عنوان یک آنتی­اکسیدان بر کیفیت منی قوچ عربی طی ذخیره آن به حالت مایع تحت دمایC°5 بود. اسپرم‏گیری از 8 رأس قوچ عربی خوزستان به‌طور هفتگی برای مدت 8 هفته انجام و منی آن­ها بلافاصله باهم مخلوط شد. نمونه منی مخلوط و رقیق‌شده سپس به 5 قسمت تقسیم و هرکدام یکی از سطوح 0، 5/0، 1، 5/1 و 2درصد آلبومین سرم گاو را دریافت کردند. در زمان‏های 1، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از نگهداری منی در C°5، فراسنجه‏های کیفی منی بررسی شدند. در زمان 1 ساعت، سطوحBSA فقط باعث کاهش میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم­ها در مقایسه با شاهد شدند (05/0>P). 24 ساعت پس از ذخیره منی، تمام مقادیر BSA موجب بهبود اغلب فراسنجه­های کیفی اسپرم شدند (05/0>P). طی 48 و 72 ساعت از ذخیره منی، سطوح 5/0 تا 5/1 درصد، عملکرد بهتری در بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم داشتند (05/0>P). در زمان 96 ساعت، سطوح 5/0 و 1 درصد بهترین تأثیر در حفظ تحرک و زنده­مانی و نیز کاهش ناهنجاری­های اسپرم داشتند (05/0>P). میزان pH منی در تمام زمان­ها تحت تأثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفت (05/0>P). بطور کلی، با افزایش زمان نگهداری منی قوچ عربی، سطوح پایین BSA (کمتر از 2 درصد و ترجیحاً 5/0 و 1 درصد) باعث بهبود معنی­دار فراسنجه­های کیفی اسپرم بدون تأثیر بر pH منی شدند.

واژه­های کلیدی: اسپرم، آلبومین سرم گاو(BSA)، کیفیت، قوچ، نگهداری منی

* نویسنده مسئول، تلفن:  06136522438، پست الکترونیکی: tabatabaei@ramin.ac.ir

مقدمه

 

نگهداری اسپرم در دماهای پایین، تولید انواع اکسیژن­های واکنش­پذیر را افزایش می­دهد و مشخص‌شده که این ترکیبات اثرات مخربی بر ساختار سلول اسپرم بر جای می­گذارند. بنابراین در این شرایط استفاده از مواد آنتی­اکسیدانی می­تواند در بهبود خصوصیات اسپرم مؤثر باشد (30). تقریباً تمام سلول­ها دارای مواد و آنزیم­هایی هستند که می­توانند اثرات سمی انواع اکسیژن­های واکنش­پذیر را خنثی کنند. اما میزان توانایی آنتی­اکسیدان­های اسپرم در مقایسه با دیگر سلول­ها پایین­تر است و این سلول­ها نسبت به فشارهای اکسیداتیو آسیب­پذیرتر هستند (24). اضافه کردن آنتی­اکسیدان به نمونه­های منی قوچ، سبب افزایش قدرت زنده­مانی اسپرم­ها شده است (22 و 26).

آلبومین­ سرم­ گاوی پروتئینی است که در سرم خون گاوها یافت می­شود. این پروتئین با دارا بودن خاصیت آنتی­اکسیدانی می­تواند میزان تحرک و درصد اسپرم­های زنده­ی قوچ را در رقیق­کننده­های حاوی این پروتئین افزایش دهد. آلبومین به‌صورت یک مولکول درشت می­تواند به غشاء پلاسمایی اسپرم وارد شده و علاوه برافزایش پایداری غشاء به‌عنوان یک آنتی­اکسیدان مانع پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی گردد (17). آلبومین به‌عنوان یک محافظت کننده­ اسپرم­ها در حالت انجماد عمل می­نماید (8). یکی از مهمترین خصوصیات آلبومین سرم گاوی این است که موجب حذف­ یا مهار رادیکال­های آزاد تولید­شده توسط واکنش اکسیژنی و واکنش­های اکسیداتیوی می­شود و در افزایش استحکام غشای سلول­های اسپرم از پرکسیداسیون لیپیدی و شوک حرارتی در طول نگهداری منی تحت شرایط سرمایی نقش دارد (16).

عنصر روی بر عملکرد و ساختار غشای پلاسمایی اسپرم تأثیرگذار است. روی، کوفاکتوری برای آنزیم­های مختلف بخصوص آنزیم­های مؤثر در سنتز پروتئین می­باشد. این عنصر با تأثیر بر فسفولیپازها، موجب تنظیم ثبات و پایداری غشاهای بیولوژیکی می­شود. با خروج عنصر روی از سطح سلول اسپرم، غشای پلاسمایی ناپایدار شده و اسپرم مستعد ظرفیت­دار شدن و واکنش آکروزومی خواهد شد (32). آلبومین سرم گاوی در ظرفیت­دارشدن اسپرم از طریق خارج­ کردن عنصر روی از سطح اسپرم و تغییر ترکیب لیپید غشای پلاسمایی اسپرم نقش دارد (25). بنابراین آلبومین در قدرت باروری جنس نر از طریق ظرفیت‏دار کردن اسپرم و آماده­سازی آن برای لقاح نیز مهم می­باشد. آلبومین به‌عنوان پروتئین کوچک موجود در مایع منی و با عمل جاروب­گری خود، یون­های فلزی عامل پیشرفت و گسترش واکنش­های پراکسیداسیون سلولی را جذب و حذف می­نماید (12). لیزوزوم که از اسپرم‏های مرده آزاد می‏شود، خود در تخریب غشای پلاسمایی اسپرم‏های دیگر نقش دارد. آنزیم‏های پروتئولیتیک و تجمع اسیدلاکتیک درنتیجه متابولیسم اسپرم‏ها در طی نگهداری منی، اثرات نامطلوبی بر سلامتی غشای اسپرم دارند. زمانی­که pH منی خیلی اسیدی شود، مابقی اسپرم‏ها نیز تحرک خود را ازدست‌داده و درصد اسپرم‏های مرده افزایش می‏یابد. بنابراین، افزودن آلبومین به مایع منی می‏تواند در حفظ و زنده­مانی اسپرم‏ها مؤثر باشد (14). با توجه به این موارد، هدف از انجام پژوهش حاضر، بررسی تأثیر افزودن سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی به منی قوچ عربی بر کیفیت اسپرم و pH منی طی زمان­های مختلف نگهداری آن به حالت مایع در دمایC °5 بود.

مواد و روشها

پژوهش حاضر از اواسط مهرماه تا اواخر آذرماه سال 1394 هجری شمسی، مصادف با فصل تولیدمثلی پاییز گوسفند عربی، در ایستگاه دامپروری دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان واقع در 36 کیلومتری شمال­شرقی اهواز انجام شد. برای این منظور، از 8 رأس قوچ عربی بالغ با متوسط سن حدود 5/2 ساله و تحت برنامه تغذیه­ای و مدیریتی یکسان در قالب طرح کاملاً تصادفی استفاده شد. اسپرم­گیری به روش تحریک الکتریکی (الکترواجاکولاتور) به‌طور هفتگی برای مدت 8 هفته انجام شد. منی جمع­آوری شده از قوچ­ها در هر دوره، به‌منظور جلوگیری از اثرات فردی بلافاصله باهم مخلوط و به نسبت 1 به 10 در رقیق‌کننده پایه تریس رقیق‌سازی شد (جدول 1). نمونه­های انزال مخلوط و رقیق‌شده به 5 قسمت تقسیم و هرکدام سطح مختلف آلبومین سرم گاوی (صفر یا شاهد، 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد) را دریافت کردند. در زمان­های مختلف نگهداری منی رقیق­شده حاوی تیمارهای آزمایشی (1، 24، 48، 72 و 96 ساعت) بصورت مایع تحت دمای
C °5، فراسنجه‏های کیفی منی بررسی شدند.

برای ارزیابی تحرک پیشرونده اسپرم­ها، پنج میکرولیتر از منی رقیق‌شده روی لام گرم قرارداده شده و پس از لامل­گذاری، با استفاده از میکروسکوپ نوری، با بزرگنمایی X400 در چند میدان دید درصد تحرک پیشرونده ارزیابی‌شده و در انتها میانگین حاصل به‌عنوان درصد تحرک پیش­رونده ثبت شد (7). برای ارزیابی میزان اسپرم­های زنده و مرده از رنگ­آمیزی ائوزین- نیگروزین استفاده گردید. ترکیبات آن شامل رنگ ائوزین (67/1 گرم در لیتر)، رنگ نیگروزین (100 گرم در لیتر) و سیترات سدیم (29 گرم در لیتر) می­باشد.

 

جدول 1- ترکیب رقیق‌کننده تریس و زرده تخم‌مرغ جهت نگهداری منی قوچ عربی در شرایط مایع (21)

   اجزای رقیق‌کننده

         مقدار اجزاء

تریس (هیدروکسی متیل آمینومتان) (گرم)

634/3

فروکتوز (گرم)

5/0

اسیدسیتریک (منوهیدرات) (گرم)

99/1

زرده تخم‌مرغ (میلی‌لیتر)

14

آب مقطر (میلی‌لیتر)

100

 

 

ابتدا منی رقیق‌شده‌ی تیمارها بارنگ ائوزین- نیگروزین آمیخته (نسبت 1 به 1) شد و پس از 30 ثانیه، روی لام توسط یک لام دیگر گسترش تهیه گردید و با جریان هوای گرم خشک شد. پس از خشک­ شدن گسترش، لام­ها توسط بزرگنمایی X1000 میکروسکوپ نوری و با استفاده از روغن ایمرسیون مورد ارزیابی قرارگرفتند. درصد اسپرم­های زنده و مرده در چندین میدان از لام (با شمردن حداقل 200 اسپرم در هر اسلاید ) تعیین شد. اسپرم­های مرده به علت تغییر در ساختمان غشا، رنگ ائوزین را به خود جذب کرده و به رنگ صورتی دیده شدند، اما اسپرم­های زنده رنگ را به خود جذب نکرده و سفیدرنگ ماندند (11). برای بررسی درصد اسپرم­های ناهنجار، نمونه­ کوچکی از منی درروی لام بارنگ ائوزین- نیگروزین رنگ­آمیزی شد. هنگام تهیه­ گسترش دقت شد تا آسیب­های فیزیکی به اسپرم­های سالم وارد نشود که در این صورت، درصد اسپرم­های ناهنجار افزایش خواهد یافت. پس از رنگ­آمیزی، درصد اسپرم­های ناهنجار با استفاده از روغن ایمرسیون و شمارش حداقل 200 اسپرم در هر لام تحت بزرگ­نمایی X1000 میکروسکوپ تعیین گردید (6).

برای بررسی سلامت غشای پلاسمایی اسپرم یا آزمون HOST (Hypo osmotic swelling test) از محلول هیپواسموتیک استفاده شد. واکنش اسپرم­ها به محیط هیپواسمول به‌صورت تورم دم است. در این حالت اسپرم­هایی که غشای پلاسمایی سالمی دارند به محلول واکنش نشان می‌دهند، ولی اسپرم‌های ناسالم بدون واکنش باقی می‌مانند. درواقع پس‌ازاین آزمایش اسپرم­های با دم گره‌خورده به‌عنوان اسپرم­های با پاسخ مثبت (غشای پلاسمایی سالم) و اسپرم­هایی که دم آن­ها صاف است به‌عنوان اسپرم با پاسخ منفی (غشای پلاسمایی معیوب) تلقی می­شوند. مقدار 10 میکرولیتر از نمونه­ منی با 100 میکرولیتر از محیط هیپواسموتیک حاوی فروکتوز (9 گرم در لیتر) و سیترات سدیم (9/4 گرم در لیتر) مخلوط گردید، سپس 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. پس از گذشت این زمان و با تهیه­ حداقل 3 قطره از نمونه انکوبه شده با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد. بررسی میکروسکوپی با استفاده از یک صفحه گرم در دمای 37 درجه سانتی­گراد و با بزرگ نمایی X400 صورت گرفت. در هر گروه تیماری حداقل 200 اسپرم شمارش و درصد اسپرم‌های دارای غشای یکپارچه محاسبه شد (11). برای بررسی میزان pH منی طی زمان­های مختلف پس از نگهداری منی در هرکدام از تیمارهای آزمایشی از pH سنج دیجیتالی قلمی با دقت بالا استفاده شد.

نتایج به دست­ آمده از پژوهش حاضر، با استفاده از برنامه نرم­افزار آماری SPSS (ویرایش 16) مورد آنالیز قرار گرفت. جهت بررسی کیفیت اسپرم و میزان  pHمنی در هر زمان بین تیمارها از تحلیل واریانس یک­طرفه (one way  ANOVA) برای مدل 1 و آزمون مقایسه­ای چند دامنه­ دانکن در سطح 5 درصد استفاده شد. تعداد تکرار برای هر تیمار، هشت واحد آزمایش در نظر گرفته شد.

(1)    YIj = µ + Ti +Ɛij 

نتایج و بحث

نتایج  تأثیر  افزودن  سطوح  مختلف  آلبومین  سرم  گاوی

(BSA) به منی قوچ عربی بر فراسنجه­های کیفی اسپرم­ها و pH منی در زمان­های 1، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از نگهداری منی به حالت مایع در C°5 به ترتیب ارائه می­شود.

یک ساعت پس از نگهداری منی، درصد تحرک پیشرونده، زنده­مانی و سلامت غشای اسپرم و نیز pH منی تحت تأثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفتند (05/0P) (جدول 2).

24 ساعت پس از ذخیره منی، میزان تحرک پیشرونده و زنده­مانی اسپرم در شاهد به‌طور معنی­داری کمتر از تمام سطوح BSA بودند (05/0>P). همچنین، بیشترین میزان ناهنجاری اسپرم در گروه شاهد مشاهده شد (05/0>P). تیمارهای 5/1 و 2 درصد BSA در زمان 24 ساعت، دارای میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم بیشتری نسبت به شاهد بودند (05/0>P). در این زمان تیمارهای آزمایشی تأثیر معنی­داری برpH  منی نداشتند (05/0

در زمان 48 ساعت از ذخیره منی، تحرک پیشرونده­ اسپرم در شاهد به‌طور معنی­داری کمتر از سطوح 5/0، 1 و 5/1 درصد BSA بود (05/0>P). همچنین، میزان زنده­مانی اسپرم در شاهد کمتر از تمام سطوح آلبومین بود (05/0>P). در این زمان، بیشترین میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم در شاهد مشاهده شد (05/0>P). همچنین گروه­های شاهد و 2 درصد BSA میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم کمتری در مقایسه با تیمارهای آزمایشی دیگر داشتند (05/0>P). در این زمان، تفاوت معنی­داری در pH منی بین تیمارها مشاهده نشد (05/0

 

 

جدول 2- تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و اسیدیته منی قوچ عربی (یک ساعت پس از نگهداری منی در C°5)

سطوح BSA (%)

تحرک پیشرونده  (%)

 زنده‏مانی (%)

ناهنجاری مورفولوژیکی (%)

سلامت غشای پلاسمایی (%)

pH

5/0

16/3 ± 00/90

71/1 ± 50/92

56/0 ± 33/5b

22/1 ± 00/82

14/0 ± 73/6

1

08/4 ±00/90

88/0 ± 67/93

17/0 ± 17/5b

44/1 ± 50/82

17/0 ± 72/6

5/1

18/3 ± 33/90

87/0 ± 17/93

26/0 ± 00/5b

70/1 ± 00/82

14/0 ± 70/6

2

00/3 ± 17/89

67/1 ± 67/91

45/0 ± 00/5b

80/0 ± 20/82

12/0 ± 68/6

صفر (شاهد)

16/3 ± 00/85

12/1 ± 50/87

52/0 ± 00/7a

55/2 ± 00/77

14/0 ± 70/6
               

a-b: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

جدول 3- تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و اسیدیته منی قوچ عربی (24 ساعت پس از نگهداری منی در C°5)

سطوح BSA

     (%)

تحرک پیشرونده

        (%)

زنده‏مانی

(%)

ناهنجاری مورفولوژیکی (%)

سلامت غشای پلاسمایی (%)

pH

5/0

71/3 ± 00/83a

01/2 ± 83/85a

43/0 ± 50/7b

00/2 ± 00/72ab

19/0 ± 75/6

1

00/3 ± 00/83a

83/1 ± 00/85a

42/0 ± 33/7b

12/3 ± 60/72ab

19/0 ± 82/6

5/1

a16/3 ± 00/85

39/2 ± 83/85a

48/0 ± 17/7b

32/2 ± 40/74a

17/0 ± 77/6

2

a33/3 ± 67/81

01/2 ± 17/84a

61/0 ± 67/7b

96/1 ± 40/74a

19/0 ± 83/6

صفر (شاهد)

b49/1 ± 25/69

39/2 ± 83/75b

68/0 ± 00/11a

69/1 ± 60/65b

14/0 ± 56/6

a-b : تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

 

72 ساعت پس از نگهداری منی، میزان تحرک پیشرونده اسپرم­ها و زنده­مانی آنها در تمام تیمارهای آزمایشی به‌غیراز 2 درصد BSA، به‌طور معنی­داری بیشتر از شاهد بودند (05/0>P). بیشترین میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم در 72 ساعت پس از اسپرم­گیری، مربوط به شاهد بود (05/0>P). میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم و pH منی تفاوت معنی­داری در بین تیمارهای آزمایشی و شاهد نداشتند (05/0>P) (جدول 5).

در آخرین زمان یعنی 96 ساعت پس از نگهداری منی، سطوح BSA باعث بهبود معنی­دار میزان تحرک پیشرونده­ اسپرم در مقایسه با شاهد شدند (05/0>P). در این زمان، میزان زنده­مانی اسپرم در گروه شاهد به‌طور معنی­داری کمتر از سطوح 5/0 و 1 درصد BSA بود (05/0>P).

 

 

جدول 4- تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و اسیدیته منی قوچ عربی (48 ساعت پس از نگهداری منی در C°5)

سطوح BSA

      (%)

تحرک پیشرونده

(%)

زنده‏مانی

(%)

ناهنجاری مورفولوژیکی

(%)

سلامت غشای پلاسمایی

(%)

pH

5/0

70/1 ± 00/74a

73/2 ± 67/74a

88/0 ± 66/11b

00/3 ± 00/67a

12/0 ± 55/6

1

63/1 ± 00/73a

01/2 ± 17/74a

83/0 ± 83/11b

21/3 ± 10/67a

14/0 ± 50/6

5/1

a71/2 ± 17/74

83/1 ± 83/74a

48/0 ± 84/11b

73/2 ± 40/66a

13/0 ± 58/6

2

b36/4 ± 17/69

80/3 ± 67/71a

66/0 ± 67/11b

49/3 ± 60/54b

19/0 ± 62/6

صفر (شاهد)

33/3 ± 33/58 b

42/3 ± 00/60b

08/1 ± 16/15a

87/1 ± 11/56b

19/0 ± 52/6

a-b: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

 

جدول 5- تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و اسیدیته منی قوچ عربی (72 ساعت پس از نگهداری منی در C°5)

سطوح BSA

     (%)

تحرک پیشرونده

(%)

زنده‏مانی

(%)

ناهنجاری مورفولوژیکی

(%)

سلامت غشای پلاسمایی

(%)

pH

 

5/0

a16/3 ± 00/55

a47/2 ± 33/58

b33/1± 17/16

18/4 ± 00/60

13/0 ± 42/6

1

33/3 ± 33/58a

a10/2 ± 35/58

b05/1± 67/16

85/4± 00/61

14/0 ± 43/6

5/1

a65/4 ± 00/60

a59/4 ± 67/61

b38/1 ± 33/16

32/3 ± 15/61

12/0 ± 35/6

2

b83/1 ± 00/43

ab79/2 ± 67/51

b93/0 ± 00/16

74/3 ± 00/57

18/0 ± 45/6

صفر (شاهد)

b52/3 ± 83/35

b43/4 ± 50/42

a06/1 ± 00/22

24/5 ± 22/50

15/0 ± 68/6

a-b: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

 
               

 

میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم در زمان 96 ساعت پس از اسپرم­گیری در شاهد به‌طور معنی­داری بیشتر از سطوح 5/0و 1 درصد بود (05/0>P). میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم و pH منی طی این زمان تحت تأثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفتند (05/0

آلبومین در مطالعات مختلف به‌عنوان یک آنتی­اکسیدان که سازوکارهای آن هنوز شناخته نشده است، مورد بررسی قرارگرفته و ثابت‌شده است که می­تواند مانع از پراکسیداسیون لیپیدهای غشای اسپرم گردد. در بوقلمون، افزودن آلبومین سرم گاوی به منی باعث افزایش تحرک اسپرم شد (5).

 

جدول 6- تأثیر سطوح مختلف آلبومین سرم گاوی (BSA) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و اسیدیته منی قوچ عربی (96 ساعت پس از نگهداری منی در C°5)

سطوح BSA

      (%)

تحرک پیشرونده

(%)

  زنده‏مانی

(%)

ناهنجاری مورفولوژیکی

(%)

 سلامت غشای پلاسمای

 (%)

pH 

5/0

44/6 ± 00/42a

79/5 ± 00/44a

03/1± 40/20bc

85/4 ± 00/51

13/0 ± 50/6

1

74/3 ± 11/42a

06/4 ± 20/43a

71/0± 00/19c

34/4± 60/50

13/0 ± 56/6

5/1

a10/5 ± 00/41

45/2 ± 10/42ab

30/1 ± 00/23ab

67/3 ± 20/52

14/0 ± 40/6

2

a87/1 ± 10/41

55/2 ± 20/42ab

79/1 ± 20/23ab

22/3 ± 00/53

12/0 ± 62/6

صفر (شاهد)

b45/2 ± 77/26

54/3 ± 00/30b

49/1 ± 75/25a

70/5 ± 60/41

10/0 ± 50/6

a-c: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

 

 

همچنین، اضافه­کردن آلبومین سرم گاوی به منی گاو و قوچ در مرحله قبل انجماد با کاهش میزان آسیب وارده به اسپرم­ها طی روند انجماد منجر به بالا بودن میزان حرکت پیشرونده اسپرم­ها در مقایسه با گروه شاهد شد (28 و 17). در گزارشی دیگر، استفاده از 3 میلی­گرم در میلی­لیتر آلبومین سرم گاوی در بافر یون فسفات پتاسیم، باعث بهبود تحرک پیشرونده اسپرم اپیدیدیمی خرگوش شد که دلیل آن را به نقش بازدارندگی پراکسیداسیون لیپیدها توسط آلبومین سرم گاوی نسبت دادند (4). اسپرم­های جدا شده از اپیدیدیم خرگوش وقتی در معرض آلبومین سرم گاو قرارگرفتند، میزان تحرک آن­ها نسبت به گروه شاهد بیشتر بود (13). مطالعه دیگر نشان داد که محیط­های حاوی آلبومین سرم گاوی موجب بهبود میزان تحرک پیشرونده اسپرم­های اسب شد (15). افزودن آلبومین سرم گاو به مایع منی گاو علاوه بر حفظ زنده­مانی اسپرم­ها، کاهش میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم را باعث شد (14). در انسان، ارتباط مثبت معنی­داری بین درصد اسپرم­های با مورفولوژی طبیعی و غلظت آلبومین پلاسمای منی یافت شد. اما چنین ارتباطی بین میزان آلبومین پلاسمای منی و تحرک اسپرم مشاهده نشد (10).

در تحقیقی، رقیق­کننده دارای آلبومین سرم گاو تأثیری بر درصد اسپرم­های متحرک و ناهنجاری آکروزومی طی 48 ساعت از ذخیره منی خرگوش به حالت مایع نداشت. اما، اثر معنی­داری بر حفظ سلامتی غشای پلاسمایی اسپرم در این مدت داشت (23). این درحالی است که طبق پژوهش حاضر، سطوح مختلف BSA نسبت به شاهد تأثیر معنی­داری بر فراسنجه­های کیفی اسپرم شامل تحرک، زنده‌مانی، سلامت غشای پلاسمایی و ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم داشتند. طی پژوهشی که در آن اثر آلبومین سرم گاو بر کیفیت اسپرم خوک در طی ذخیره­سازی به حالت مایع در C°17 بررسی شد، غلظت­های 3، 4 و 5 گرم در لیتر این پروتئین موجب بهبود میزان تحرک، زنده­مانی و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم شدند (31) که مشابه بامطالعه حاضر بخصوص در سطوح پایین­تر آلبومین سرم گاو و در زمان­های مختلف نگهداری منی قوچ عربی به حالت مایع در C°5 بود. آلبومین سرم گاوی سبب بهبود تحرک پیشرونده، سلامت غشاء و آکروزوم اسپرم گاومیش نیز شده است (21).

با بررسی اثر آلبومین سرم گاوی بر میزان تحرک، زنده­مانی و یکپارچگی غشای پلاسمایی اسپرم گاومیش، مشاهده شد که طی صفر ،2 و 4 ساعت پس از نگهداری منی به حالت سرما، میزان تحرک اسپرم تحت تأثیر قرار نگرفت، اما میزان زنده­مانی و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم بهبود یافت (3). در مطالعه حاضر، در زمان 1 ساعت پس از نگهداری منی، فراسنجه­های تحرک و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم تحت تأثیر تیمارهای آزمایشی BSA قرارنگرفتند. ولی با افزایش مدت‌زمان نگهداری، بخصوص سطوح کمتر از 2 درصد آلبومین سرم گاو، موجب بهبود فراسنجه­های تحرک و زنده­مانی اسپرم قوچ عربی شدند. موافق با تحقیق حاضر، در پژوهشی تأثیر آلبومین سرم گاوی بر میزان تحرک و باروری اسپرم خروس بومی قبل و بعد از نگهداری 24 ساعته در دمای°C 4 موردبررسی قرارگرفت. نتایج نشان داد که آلبومین سرم گاو باعث حفظ تحرک اسپرم پس از 24 ساعت از ذخیره­ منی خروس تحت دمای °C 4 شد (1).

آلبومین سرم گاوی در مایعات دستگاه تناسلی شناسایی‌شده و به حفظ تحرک اسپرم و سلامتی آکروزوم در روند سرد نمودن منی کمک می­کند (29). در تحقیقی، تأثیر آلبومین سرم گاوی بر اسپرم گاو نر پس از 24 ساعت از کشت آزمایشگاهی بررسی و مشاهده شد که تحرک اسپرم در غلظت 20 درصد آلبومین بالاترین بود (27). با بررسی اثر آلبومین سرم گاو بر اسپرم گاومیش، غلظت 05/0درصد آلبومین تحرک اسپرم بهتری را نسبت به غلظت 1 درصد آن موجب شد (21). همچنین، آلبومین سرم گاو موجب بهبود تحرک اسپرم بوقلمون بعد از ذخیره‌سازی 24 ساعت در دمایC °17 شد (5). تأثیرات سودمند آنتی­اکسیدان­ها توانایی آن­ها برای کاهش رادیکال­های آزادی است که توسط فرایندهای متابولیسمی تولید می­شوند. آنتی­اکسیدان­ها ازجمله آلبومین سرم گاو دفاع مؤثری علیه رادیکال پروکسیل هستند و می­توانند از آسیب اکسیداتیو به DNA اسپرم جلوگیری کرده و توانایی اسپرم را به شوک سرمایی تنظیم و سرانجام بقای اسپرم در برابر سرما را افزایش دهند (19). در پژوهشی دیگر، پروتئین­های پلاسما سبب حفظ تحرک اسپرم گاو و قوچ شد (20). همچنین پروتئین­های پلاسما سبب بهبود زنده­مانی اسپرم خوک در شرایط شوک سرمایی شدند (18). آلبومین سرم گاو اثر مثبتی بر میزان تحرک و زنده­مانی اسپرم گاو نر نگهداری شده تحت شرایط سرما نیز داشته است (9).

با بررسی اثرات آلبومین سرم گاوی و سرم جنین گوساله بر کیفیت اسپرم خرگوش، مشاهده گردید که این تیمارها اثر قابل‌توجهی در حفظ سلامت غشای پلاسمایی اسپرم بین دوره 48 و 72 ساعت ذخیره­سازی نسبت به شاهد داشتند (23). این در حالی است که 72 ساعت پس از ذخیره منی قوچ عربی به حالت مایع در مطالعه­ی حاضر، میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم تفاوت معنی­داری با شاهد نداشت. ولی موافق با پژوهش فوق، 48 ساعت پس از نگهداری منی قوچ عربی میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم در تیمارهای 5/0، 1 و 5/1 درصد آلبومین به‌طور معنی­داری بیشتر از شاهد بود. وقتی BSA به منی اضافه می‏شود، غشای سلولی اسپرم‏ها را پوشانده و از خاصیت چسبندگی فیزیکی اسپرم­ها به محیط اطراف جلوگیری می‏شود، درنتیجه با کاهش اصطکاک بین اسپرم و محیط (ازجمله لام) سرعت حرکت پیشرونده اسپرم‏ها افزایش پیدا می‏کند. همچنین پوشیده شدن غشای پلاسمایی سراسپرم توسط BSA، اثرعوامل مضر محیطی روی سر اسپرم را مهار کرده و قدرت زنده‏مانی اسپرم در محیط آزمایشگاه افزایش پیدا می‏کند (15). در مقابل، نظریه مخالفی در شرایط آزمایشگاهی مبنی بر اینکه آلبومین سرم گاوی با تغییر در ترکیب لیپیدهای غشای سلولی، به‌ویژه با کاهش نسبت کلسترول به فسفولیپید در غشای پلاسمایی اسپرم منجر به نفوذپذیری یون‌های کلسیم به درون غشای پلاسمایی اسپرم شده و درنتیجه موجب آغاز واکنش آکروزومی زودهنگام و مرگ اسپرم می­گردد نیز وجود دارد (28).

بطور کلی براساس نتایج تحقیق حاضر، با افزایش مدت‌زمان ذخیره منی قوچ عربی به حالت مایع در C°5، سطوح کمتر از 2 درصد آلبومین سرم گاوی (BSA)، بخصوص 5/0 و 1 درصد آن باعث بهبود معنی­دار فراسنجه­های کیفی اسپرم بدون تأثیر بر pH منی شدند. دلیل احتمالی غیرموثر بودن بالاترین سطح BSA به‌عنوان یک آنتی­اکسیدان در این مطالعه را می­توان اینگونه توضیح داد که پراکسید هیدروژن بر فراسنجه­های اسپرم ازجمله افزایش تحرک آن دخالت دارد. بنابراین، مقدار بسیار کم اکسیژن­های واکنش­پذیر به‌عنوان واسطه­ای برای کنترل عملکرد طبیعی اسپرم لازم است (2).  

1. طباطبایی، ص.، و ممویی، م.، 1395. تأثیر آلبومین سرم گاوی (BSA) بر فراسنجه­های جنبایی اسپرم و باروری خروس بومی، تولیدات دامی، دوره 18، شماره 2، صفحات 408-397.
 
2. Aitken, R. J., 1995. Free radicals, lipid peroxidation and sperm function. Reproduction, Fertility and Development, 7, PP: 659-668.
3. Akhter, S. h., Allah Rakha, B., Iqbal, R., and Ansari, M. S., 2014. Effect of bovine serum albumin on motility, plasmalemma, viability and chromatin integrity of buffalo bull spermatozoa, Pakistan Journal of Zoology, 46(1), PP: 115-120.
4. Alvarez, J. G., and Storey, B. T., 1989. Role of glutathione peroxidase in protecting mammalian spermatozoa from loss of motility caused by spontaneous lipid peroxidation, Gamete Research, 23, PP: 77-90.
5. Bakst, M. R., and Cecil, H. C., 1992. Effect of bovine serum albumin on motility and fecundity of turkey spermatozoa before and after storage, Journal of Reproduction and fertility, 94, PP: 287-293.
6. Blom, E., 1983. Pathological conditions in the genital organs and in the semen as ground for rejection of breeding bulls for import or export to and from Denmark, Nordisk Veterinary Medicine, 45, PP: 105- 130.
7. Bucak, M. N. S., Sariozkan, P. B., Tuncer, P., Ulutas, A., and Akcadag, H. I., 2009. Effect of antioxidants on microscopic semen parameters, lipid peroxidation, and antioxidant activities in Angora goat semen following cryopreservation, Small Ruminant Research, 81, PP: 90-95.
8. Crabo, B. G., Brown, K. I., and Graham, E. F., 1972. Effect of some buffers on storage and freezing of boar spermatozoa, Journal of Animal Science, 35, PP: 377-382.
9. El-Kon, I., 2011. Testing usability of bovine serum albumin (BSA) for preservation of Egyptian buffalo semen, American Eurasian Journal of Agricultural and Environmental sciences, 11(4), PP: 495-502.
10. Elzanaty, S., Erenpreiss, J., and Becker, C., 2007. Seminal plasma albumin: origin and relation to the male reproductive parameters. Andrologia, 39(2), PP: 60-65.‏
11. Evans, G., and Maxwell, W. M. C., 1987. Handling and examination semen, In: Maxwell WMC, editor. Salamon’s artificial insemination of sheep and goat, Sydney: Butterworths. PP: 93-106.
12. Halliwell, B., and Gutteridge, J. M. C., 1989. Lipid peroxidation: a radical chain reaction. In: Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, PP: 188-276.‏
13. Harrison, R. A., Dott, H. M., and Foster, G. C., 1982. Bovine serum albumin, sperm motility, and the dilution effect, Journal of Experimental Zoology, 222(1), PP: 81-88.
14. Jones, J. M., and Bavister, B. D., 2000. Acidification of intracellular pH in bovine spermatozoa suppresses motility and extends viable life. Journal of Andrology, 21(5), PP: 616-624.
15. Klem, M. E., Kreider, J. L., Pruitt, J. B., and Potter, G. D., 1986. Motility and fertility of equine spermatozoa extended in bovine serum albumin and sucrose. Theriogenology, 26(5), PP: 569-576.‏
16. Kreider, J. L., Tindall, W. C., and Potter, G. D., 1985. Inclusion of bovine serum albumin in semen extenders to enhance maintenance of stallion sperm viability, Theriogenology, 23, PP: 399-408.
17. Matsuoka, T., Imai, H., Kohno, H., and Fukui, Y., 2006. Effects of bovine serum albumin and trehalose in semen diluents for improvement of frozen-thawed ram spermatozoa, Journal of Reproduction and Development, 52, PP: 675-683.
18. Maxwell, W. M., Welch, G. R., and Johnson, L. A., 1996. Viability and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma, Reproduction, Fertility and Development, 8(8), PP: 1165-1178.
19. Naijian, H. R., Kohram, H., Shahneh, A. Z., and Sharafi, M., 2013. Effects of various concentrations of BSA on microscopic and oxidative parameters of Mahabadi goat semen following the freeze–thaw process, Small Ruminant Research, 113(2), PP: 371-375.
20. Peris, I. S., Bilodeau, J. F., Dufour, M., and Bailey, J., 2007. Impact of cryopreservation and reactive oxygen species on DNA integrity, lipid peroxidation, and functional parameters in ram semen, Molecular Reproduction and Development, 74, PP: 878-892.
21. Rahman, Z. U., Anwar, M., Andarbi, S. M. H., Mehmood, A., Ali, L., and Ahmad, H., 2015. Effect of bovine serum albumin in extender on post-thow quality and in vivo fertility of buffalo bull semen, Buffalo Bulletin, 34(4), PP: 417-421.
22. Salamon, S., and Maxwell, W. M. C., 2000. Storage of ram semen, Animal Reproduction Science, 62(1), PP: 77-111.
23. Sarıözkan, S., Türk, G., Cantürk, F., Yay, A., Eken, A., and Akçay, A., 2013. The effect of bovine serum albumin and fetal calf serum on sperm quality, DNA fragmentation and lipid peroxidation of the liquid stored rabbit semen, Cryobiology, 67(1), PP: 1-6.
24. Sreejith, J. N., Brar, A. S., Ahuja, C. S., and Sangha, S. P. S., 2006. A comparative study onlipid peroxidation activities of antioxidant enzymes and viability of cattle and buffalo bull spermatozoaduring storage at refrigeration temperature, Animal Reproduction Science, 96, PP: 21-29.
25. Stewart-Savage, J., 1993. Effect of bovine serum albumin concentration and source on sperm capacitation in the golden hamster, Biology of Reproduction, 49(1), PP: 74-81.‏
26. Stojanov, T., Rhodes, S. L., Maxwell, W. M. C., and Evans, G., 1994. The effect of antioxidants on the fertilising capacity of chilled-stored ram spermatozoa, Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series, 13, 7p.
27. Tvrdá, E., Kňažická, Z., Massányi, P., Stawarz, R., Formicki, G., and Lukáč, N., 2010. Bovin serum albumin as a potential protein supplement for in viro cultivation of spermatozoa. Mendel Net, PP: 264-269.
28. Uysal, O., and Bucak, M. N., 2007. Effects of oxidized glutathione, bovine serum albumin, cysteine and lycopene on the quality of frozen-thawed ram semen, Acta Veterinaria Burno. 76, PP: 383-390.
29. Yamashiro, H., Wang, H., Yamashita, Y., Kumamoto, K., and Terada, T., 2006. Enhanced freezability of goat spermatozoa collected into tubes containing extender supplemented with bovine serum albumin (BSA), Journal of Reproduction and Development, 52(3), PP: 407-414.
30. Yousef, M. I., Abdallah, G. A., and Kamel, K. I., 2003. Effect of ascorbic acid and Vitamin E supplementation on semen quality and biochemical parameters of male rabbits, Animal Reproduction science, 76(1), PP: 99-111.‏
31. Zhang, Y. Z., Zhou, B., Zhang, X. P., Huang, P., Li, C. H., and Liu, Y., 2009. Interaction of malachite green with bovine serum albumin: determination of the binding mechanism and binding site by spectroscopic methods, Journal of Hazardous Materials, 163(2), PP: 1345-1352.
32. Zhao, J., Dong, X., Hu, X., Long, Z., Wang, L., Liu, Q., Sun, B., Wang, Q., Wu, Q., and Li, L., 2016. Zinc levels in seminal plasma and their correlation with male infertility: A systematic review and meta-analysis, Scientific Reports, 6, PP: 1-10.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 30، شماره 4
بهمن 1396
صفحه 436-445
  • تاریخ دریافت: 11 مرداد 1395
  • تاریخ بازنگری: 25 آذر 1395
  • تاریخ پذیرش: 10 تیر 1396