نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی گروه علوم دامی

2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه علوم طیور

3 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

چکیده

هدف از این پژوهش مطالعه اثر مقادیر مختلف تره‌هالوز و سیستئین بر کیفیت اسپرم گاو بعد از انجماد-یخ‌گشایی بود. در این مطالعه، نمونه‌های منی از سه رأس گاو نر جمع‌آوری و پس مخلوط شدن به شش بخش مساوی تقسیم شده و هر بخش با یکی از رقیق کننده‌های زیر رقیق و منجمد شد. 1- فاقد سیستئین و تره‌هالوز (T0C0)، 2- دارای 5 میلی‌مول سیستئین و فاقد تره‌هالوز (T0C5)، 3- دارای 10 میلی‌مول سیستئین و فاقد تره‌هالوز (T0C10)، 4- فاقد سیستئین و دارای 100 میلی‌مول تره‌هالوز (T100C0)، 5- دارای 5 میلی‌مول سیستئین و 100 میلی‌مول تره‌هالوز (T100C5) و 6- دارای 10 میلی‌مول سیستئین و 100 میلی‌مول تره‌هالوز (T100C10). پس از یخ‌گشایی، جنبایی، وضعیت آپوپتوزیس، زنده‌مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و آکروزوم مورد ارزیابی قرار گرفت. داده‌های بدست آمده در قالب آزمایش فاکتوریل 2×3 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. نتایج این آزمایش نشان می‌دهد که سیستئین اثری بر فراسنجه‌های حرکتی، وضعیت آپوپتوزیس، یکپارپگی غشای آکروزومی و زنده‌مانی اسپرم گاو پس از یخ‌گشایی نداشته (P≥0.05) و در همه فراسنجه‌های فوق در گروه فاقد تره‌هالوز به طور معنی‌داری بهتر از گروه دارای تره‌هالوز بود (P≤0.05). همچنین، بررسی اثرات متقابل تره‌هالوز و سیستئین در این آزمایش نشان می‌دهد که تیمار T0C10 بیشترین زنده‌مانی (P≤0.05) و کمترین میزان اسپرم‌های آپوپتوز شده را داشت. براساس این نتایج می‌توان نتیجه گرفت که سیستئین اثری بر اسپرم گاو نداشته و تره‌هالوز اثر منفی بر کیفیت اسپرم گاو دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of trehalose and cysteine on bull sperm quality after freezing

نویسندگان [English]

  • Mahdi Zhandi 1
  • Elahe Nejati-Amiri 1
  • Ardeshir Nejati-Javaremi 1
  • Mohsen Sharafi 2
  • Afshin Seifi-Jamadi 1
  • Hossein Vaseghi Dodaran 3

1 Department of Animal Science, College of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran

2 Department of Poultry Science, Faculty of Agriculture, Tarbiat Modarres University, Tehran, I.R. of Iran

3 Department of Animal science, Faculty of Agriculture, University of Tabriz

چکیده [English]

The purpose of this study was to investigate the effect of different doses of trehalose and cysteine on bull frozen-thawed sperm quality. In this study, semen samples were collected from three healthy mature Holstein bulls by an artificial vagina. After primary evaluations, the samples were pooled to eliminate individual effects. Then, semen samples were divided into six equal parts and each part was extended and frozen with one of the following extenders. 1) without cysteine and trehalose (T0C0), 2) Five mM cysteine without trehalose (T0C5), 3) Ten mM cysteine without trehalose (T0C10), 4) A hundred mM trehalose without cysteine (T100C0), 5) Five mM cysteine with 100 mM trehalose (T100C5), 6) Ten mM cysteine with 100 mM trehalose (T100C10). Motility parameters, acrosome and membrane integrity and phosphatidylserine translocation assay were evaluated after thawing. All data were analyzed using a 2×3 factorial trail following data collection. The results of this study showed that cysteine had no effect on motion characteristics, apoptotic status, acrosome integrity and viability (P≥0.05). Also motion parameters, viability, acrosome and membrane integrity, in group without trehalose was higher than group containing that (P≤0.05). Regarding to interactive effects, the T0C10 group had higher amount of viability (P≤0.05) and lower necrotic sperms compared to rest of the groups. Based on the results, it can be concluded that cysteine had no remarkable effect and addition of Trehalose could negatively affects post-thawed bull sperm quality.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antioxidants
  • Bull semen
  • Cryopreservation
  • Semen Freezing

اثر تره­هالوز و سیستئین بر کیفیت اسپرم گاو بعد از انجماد

مهدی ژندی1*، الهه نجاتی امیری1، اردشیر نجاتی جوارمی1، محسن شرفی2، افشین سیفی­جمادی1، حسین واثقی دودران3

1 کرج، دانشگاه تهران، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی

2 تهران، دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده کشاورزی، گروه علوم طیور

3 تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده کشاورزی، گروه علوم دامی

تاریخ دریافت: 10/5/96                تاریخ پذیرش: 13/9/96

چکیده

هدف ازاین پژوهش مطالعه اثر مقادیر مختلف تره­هالوز و سیستئین بر کیفیت اسپرم گاو بعد از انجماد-یخ­گشایی بود. در این مطالعه، نمونه­های منی از سه رأس گاو نر جمع‌آوری و پس مخلوط شدن به شش بخش مساوی تقسیم‌شده و هربخش بایکی از رقیق‌کننده‌های زیر رقیق و منجمد شد. 1- فاقد سیستئین و تره­هالوز (T0C0)، 2- دارای 5 میلی­مول سیستئین و فاقد تره­هالوز (T0C5)، 3- دارای 10 میلی­مول سیستئین و فاقد تره­هالوز (T0C10)، 4- فاقد سیستئین و دارای 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C0)، 5- دارای 5 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C5) و 6- دارای 10 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C10). پس­از یخ­گشایی، جنبایی، وضعیت آپوپتوزیس، زنده­مانی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و آکروزوم مورد ارزیابی قرارگرفت. داده­های بدست آمده در قالب آزمایش فاکتوریل2×3 مورد تجزیه‌وتحلیل قرارگرفتند. نتایج این آزمایش نشان می‌دهد که سیستئین اثری بر فراسنجه‌های حرکتی، وضعیت آپوپتوزیس، یکپارچگی غشای آکروزومی و زنده‌مانی اسپرم گاو پس­از یخ­گشایی نداشته (0.05P≥) و در همه فراسنجه­های فوق در گروه فاقد تره­هالوز به‌طور معنی‌داری بهتر از گروه دارای تره­هالوز بود (0.05P≤). همچنین، بررسی اثرات متقابل تره­هالوز و سیستئین در این آزمایش نشان می­دهد که تیمار T0C10 بیشترین زنده‌مانی (0.05P≤) و کمترین میزان اسپرم­های آپوپتوز شده را داشت. براساس این نتایج می­توان نتیجه گرفت که سیستئین اثری بر اسپرم گاو نداشته و تره­هالوز اثر منفی بر کیفیت اسپرم گاو دارد.

واژه­های کلیدی: انجماد اسپرم، محافظت انجمادی، آنتی‌اکسیدان، منی گاو

* نویسنده مسئول، تلفن:  02632248082 ،  پست الکترونیکی: mzhandi@ut.ac.ir

مقدمه

 

بی­گمان تلقیح مصنوعی یکی­از موفق­ترین فناوری­های تولیدمثلی در صنعت گاو شیری است که به‌عنوان یک ابزار ارزشمند در برنامه­های ژنتیکی به شمار می­رود (16). موفقیت در یک برنامه تلقیح مصنوعی به مدیریت صحیح جمع­آوری، انجماد و یخ­گشایی بهینه منی و ذخیره­سازی مناسب آن بستگی دارد (2). گزارش­های بسیاری وجود دارد که نشان می­دهند، فرایند انجماد–یخ­گشایی منجر به تولید گونه­های فعال اکسیژن (ROS) می­شود که در تحرک، استحکام غشا و باروری اسپرم اختلال ایجاد می­کند و باعث واکنش زودهنگام آکروزومی، از دست دادن محتویات سلولی، کاهش جنبایی و باروری اسپرم می­شود (7). تنش اکسیداتیو درنتیجه عدم تعادل بین تولید رادیکال­های آزاد و آنتی­اکسیدان­ها رخ می­دهد و می­تواند منجر به تخریب، بدشکل شدن و احتمالاً ناباروری اسپرم شود. گزارش‌شده است که از یک‌سو تولید رادیکال­های آزاد به­وسیله اسپرم، یک فرایند طبیعی فیزیولوژیک است و نقش بسیار مهمی را در فرایند فیزیولوژیکی اسپرم همانند ظرفیت­دار شدن و واکنش آکروزومی ایفا می­کند. اما از طرف دیگر، مقادیر بالای ROS عامل اصلی اختلال در عملکرد اسپرم است (6 و 12). علاوه برآن، گونه­های فعال اکسیژن توسط اسپرم­های مرده، اکسیژن محیطی و یا اتمسفری تولید می­شوند و باعث کاهش جنبایی (احتمالاً به­وسیله از دست دادن ATP داخل سلولی که منجر به آسیب آکسونمال می‌شود)، کاهش یکپارچگی غشا و درنهایت کاهش باروری می­شوند (6 و 8).

غشای پلاسمایی یکی­از اجزای کلیدی سلول می­باشد که باید در حین انجماد به‌منظور زنده­ماندن سلول به شکل مناسبی از آسیب­های ایجادشده حفظ شود (1). وجود مقدار زیاد اسیدهای چرب غیراشباع در غشا موجب مستعد شدن اسپرم به واکنش پراکسیداسیون لیپیدی در حضور رادیکال­های آزاد می­شود (28). پژوهش‌های مختلف نشان داده­اند که محافظت از غشای اسپرم در مقابل واکنش اکسیداتیو، توسط آنتی­اکسیدان­ها صورت می­گیرد. درواقع آنتی­اکسیدان­ها با کاهش تشکیل، حذف و پاک­سازی و غیرفعال­سازی رادیکال­های آزاد، شرایط سلولی را به‌گونه‌ای تغییر می­دهند که جنبایی و کیفیت اسپرم حفظ شود. بسیاری از ترکیبات نظیر برخی از عصاره­های گیاهی، برخی مواد شیمیایی صنعتی و برخی از اسیدهای آمینه می­توانند به‌عنوان آنتی­اکسیدان فعالیت کرده و رادیکال­های آزاد را در محیط خنثی کنند (26). یکی­از اسیدآمینه­هایی که در پژوهش­های مختلف نقش آنتی­اکسیدانی آن تأییدشده است، سیستئین است (6). سیستئین اسیدآمینه‌ای با وزن مولکولی پایین است که دارای گروه تیول می­باشد. گروه­های تیول مانع از تشکیل پراکسید هیدروژن در اسپرم می­شوند. همچنین، تیول پیش­ماده بیوسنتز گلوتاتیون درون­سلولی است و سطح آن را افزایش می­دهد. از سوی دیگر، سیستئین می­تواند از فعالیت متابولیت­های سمی اکسیژن که باعث پراکسیداسیون لیپیدی غشای پلاسمایی اسپرم می­شوند، جلوگیری کند (34).

یکی دیگر از عوامل اصلی تخریب سلول اسپرم طی فرایند انجماد، تشکیل کریستال­های یخ در داخل سلول است که درنهایت منجر به کاهش زنده­مانی اسپرم می­شود. یکی از راه­های جلوگیری از تشکیل کریستال­های یخ، استفاده از قندها در رقیق­کننده است (1و 3). قندها ترکیباتی هستند که در مطالعات مختلف، نقش سرما محافظی آن­ها اثبات‌ شده است (16). افزون براین، قندها، نقش­های دیگری از قبیل فراهم کردن انرژی برای اسپرم (10) و حفظ فشار اسمزی رقیق‌کننده را نیز (1 و 29) ایفا می­کنند. دراین‌بین و براساس گزارش­های مختلف، به نظر می­رسد که دی­ساکارید تره­هالوز اثر بهتری نسبت به سایر قندها بر اسپرم داشته باشد (1، 25و 36). برخی از پژوهش­گران گزارش کرده­اند که تره­هالوز یک محیط هایپرتونیک ایجاد می­کند و با ایجاد فشار اسمزی باعث دهیدراسیون اسمزی سلول قبل از انجماد می­شود. این اثر، یخ­زدگی داخل سلولی را کاهش و باعث کاهش تعداد سلول­های آسیب‌دیده به­وسیله کریستال­های یخ می­شود (30). در پژوهشی دیگر، گزارش‌شده است که فرایند انجماد – یخ‌گشایی، ظرفیت­دار شدن اسپرم را تحریک و باعث کاهش باروری آن می‌شود. تره­هالوز پتانسیل کاهش ظرفیت­دار شدن را دارد و یکپارچگی آکروزوم را حفظ می­کند (31). در خصوص اثر متقابل تره­هالوز و سیستئین، گزارش‌شده است که اثر افزودن همزمان تره­هالوز و سیستئین باعث بهبود فراسنجه‌های کیفی اسپرم قوچ طی سردسازی شده است (13). علاوه بر آن بدر و همکاران (2014) گزارش کردند که ترکیب تره­هالوز (5 میلی­مول)، سیستئین (100 میلی­مول) و هایپوتائورین (20 میلی­مول) باعث بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم گاومیش پس از یخ­گشایی می­شود (5). بنابراین، باتوجه به این فرضیه که احتمالاً ترکیب تره­هالوز و سیستئین بااثر هم‌افزایی ایجادشده، سبب بهبود ویژگی­های اسپرم گاو پس از یخ‌گشایی می‌شوند، هدف این پژوهش مطالعه اثر افزودن همزمان سطوح مختلف سیستئین به‌عنوان یک آنتی‌اکسیدان و تره­هالوز به‌عنوان منبع قندی در رقیق­کننده بر فراسنجه‌های کیفی اسپرم گاو بود.

مواد‌ و روشها

جمع­آوری منی: دراین پژوهش از منی سه راس گاو نر هلشتاین با میانگین سنی 5/2-2 سال استفاده شد. گاوهای نر در مرکز تولید و انجماد اسپرم در فیروزکوه (شرکت زرژن) نگه­داری می­شدند. جمع­آوری منی با استفاده از واژن مصنوعی از گاوهای نر آموزش‌دیده، به مدت سه هفته و به‌صورت دو بار در هفته (درمجموع 6 تکرار) انجام شد.

محیط انجماد: درپژوهش حاضر از رقیق­کننده تجاری اپتیدیل (IMV، فرانسه) استفاده گردید. طبق راهنمای موجود برای رقیق‌کننده اپتیدیل، میزان 500 میلی­لیتر مایع رقیق­کننده در داخل 750 میلی­لیتر آب دوبار تقطیر ریخته شده و سپس به مدت 5 دقیقه روی شیکر (IMV، فرانسه) با دمای 50 درجه سانتی­گراد هم زده شد. پس‌ازآن، رقیق­کننده پایه داخل حمام آب 37 درجه سانتی­گراد قرارداده شد. تیمارهای آزمایش به‌صورت ترکیب دو سطح از تره­هالوز (شامل سطوح صفر و 100 میلی­مول) و سه سطح سیستئین (شامل سطوح صفر، 5 و 10 میلی­مول) در قالب طرح فاکتوریل 3×2 [6 تیمار شامل: 1- رقیق­کننده فاقد سیستئین و تره­هالوز (T0C0)، 2- رقیق­کننده دارای 5 میلی­مول سیستئین  و فاقد تره­هالوز (T0C5)، 3- رقیق­کننده دارای 10میلی­مول سیستئین و فاقد تره­هالوز (T0C10)، 4- رقیق­کننده فاقد سیستئین و دارای 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C0)، 5- رقیق­کننده دارای 5 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C5) و 6- رقیق­کننده دارای 10 میلی­مول سیستئین و 100 میلی­مول تره­هالوز (T100C10)] آماده شدند.

فرآوری و انجماد منی: پس­از جمع­آوری منی، نمونه­ها به‌طور هم­زمان در حمام خشک 37 درجه سانتی­گراد قرارگرفتند و بررسی­های ابتدایی نظیر ارزیابی جنبایی به روش چشمی و به‌وسیله میکروسکوپ نوری و تعیین غلظت به‌وسیله لام هموسایتومتر روی آن­ها انجام شد. نمونه­هایی با غلظت بیشتر از 109 × 2 اسپرم در میلی­لیتر، جنبایی پیش­رونده بیش­تر از 75 درصد در هر انزال به‌عنوان منی بهینه در نظر گرفته ­شد (14). پس از اطمینان از بهینه بودن کیفیت نمونه­ها، برای از میان برداشتن اثرات فردی، نمونه­ها با یکدیگر آمیخته شدند و به شش قسمت مساوی (به تعداد تیمارهای آزمایش) تقسیم شدند. رقیق­سازی تیمارها تا رسیدن به غلظت پایانی اسپرم به میزان 106 × 100 اسپرم در هر میلی­لیتر انجام شد. پس‌ازاین مرحله، لوله­های آزمایش به مدت 10 دقیقه در حمام آب 37 درجه سانتی­گراد قرار داده‌شده و سپس به مدت 150 دقیقه داخل کابینت سرد (IMV، فرانسه) در 4 درجه سانتی‌گراد قرارداده شدند. پس از گذشت این زمان، نمونه­های داخل کابینت سرد به درون پایوت­های 25/0 میلی­لیتری (IMV، فرانسه) کشیده شدند. در گامه بعد، پایوت­های پرشده برای انجماد در داخل دستگاه قابل‌برنامه‌ریزی انجماد اسپرم (IMV، فرانسه) گذاشته شدند. سپس دما تا رسیدن به 10- درجه سانتی­گراد با سرعت منفی 3 درجـه در هـردقیقه کاهش یافت تا از رسیدن هرگونه شوک دمایی در این مرحله حساس جلوگیری شود و پس‌ازاین دما که مرحله کریستال شدن شروع می­شود دما با سرعت منفی 40 درجـه سـانتی­گراد در هر دقیقه به 110- درجه سانتی­گراد رسید. سپس دما با سرعت منفی 20 درجه سانتی‌گراد در هر دقیقه به 140- درجه سانتی­گراد رسید. پس از رسیدن دما به 140- درجه سانتی­گراد، نمونه­ها به‌سرعت برداشته شدند و بی‌درنگ در درون لیوان­های پر از ازت قرارگرفته و درنهایت در تانک ازت برای مدت یک ماه ذخیره شدند.

ارزیابی اسپرم پس از یخ­گشایی:

جنبایی: در این پژوهش، یخ­گشایی در دمای 37 درجه سانتی­گراد و به مدت 30 ثانیه صورت گرفته و فراسنجه­های جنبایی با میکروسکوپ نوری– فاز کنتراست و با استفاده از نرم­افزار CASA (Sperm Class analyzer (SCA), Version 5.1; Microptic, Barcelona, Spain) ارزیابی شد. فراسنجه­های جنبایی شامل جنبایی پیشرونده (PM)، سرعت واقعی اسپرم درمسیر طی شده ( VCL)، سرعت اسپرم در خط مستقیم (VSL)، میانگین سرعت در مسیر مستقیم (VAP)، معیار خطی بودن حرکت اسپرم (LIN)، معیار مستقیم بودن حرکت اسپرم (STR)، متوسط زاویه چرخش (WOB)، حداکثر دامنه حرکات جانبی (ALH) و متوسط زاویه چرخش (MAD)، فرکانس حرکات جانبی (BCF) بودند.

فعالیت غشاء اسپرم: دراین پژوهش، برای تعیین فعالیت غشای اسپرم از آزمون HOS استفاده شد. باتوجه به این­که اسمولاریتی محیط این آزمون، 100 میلی­اسمول در کیلوگرم و اسمولاریته­ی موردنیاز برای اسپرم گاو 525 – 425 میلی­اسمول در کیلوگرم است. بنابراین، اسپرم با قرارگرفتن در یک محیط با اسمولاریتی پایین به‌سرعت واکنش می­دهد و انتهای دم آن‌ها گره می­خورد. بدیهی است که تنها اسپرم­های زنده و دارای غشای فعال (سالم) توانایی دارند به­این محیط واکنش دهند. برای ساخت محیط HOS، 9/0 گرم فروکتوز و 49/0 گرم سدیم سیترات در 100 میلی‌لیتر آب مقطر حل شد (20). سی میکرولیتر از منی یخ­گشایی شده به 300 میکرولیتر از محیط هایپواسموتیک HOS افزوده شد. سپس 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی­گراد انکوبه شد. پس از گذشت این زمان، از نمونه­ها اسلاید تهیه‌شده و تعداد 200 اسپرم از هر اسلاید شمارش شد و درصد اسپرم­های بادم گره‌خورده و متورم (دارای غشای فعال) محاسبه شد.

یکپارچگی آکروزوم: برای اندازه­گیری یکپارچگی آکروزم از روشی که توسط تس و همکاران (2009) توضیح داده‌شده بود باکمی تغییرات استفاده شد (32). در این روش، 500 میکرولیتر از اسپرم یخ­گشایی شده
(106×1 اسپرم/میلی­لیتر) در میکروتیوپی ریخته و با سرعتی معادل g 600 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی بیرون ریخته شده و پلت اسپرم در 50 میکرولیتر اتانول 96 درصد حل شد. پس از مخلوط شدن کامل اسپرم با اتانول، محلول بدست آمده به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگه­داری شد. سپس، 20 میکرولیتر از محلول روی یک لام قرار داده‌شده و به شکل یک‌لایه نازک پخش شد تا اتانول نمونه کاملاً تبخیر گردد. پس‌ازاین مرحله، 20 میکرولیتر رنگ PSA (Pisum sativum agglutinin) روی نمونه ریخته شده و به مدت 10 تا 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه­داری شد. اسلاید بدست آمده با استفاده از آب مقطر (15 بار) شستشو شده و پس از خشک شدن و آغشته شدن با گلیسرول، لامل گذاری شد. سپس، 200 اسپرم در هر اسلاید با میکروسکوپ فلورسنت (Olympus, BX51, Japan) ارزیابی شد. اسپرم­هایی با سر، سبز به‌عنوان آکروزوم سالم و اسپرم دارای یک کمربند سبز در قسمت استوایی یا بدون رنگ فلورسنت سبز به‌عنوان اسپرم­های با آکروزم تخریب‌شده در نظر گرفته شدند (شکل 1) (9).

 

شکل 1- اسپرم­های رنگ­آمیزی شده بارنگ PSA برای سنجش یکپارچگی آکروزوم.

ارزیابی   وضعیت   آپوپتوزیس  ( جابجایی   فسفاتیدیل

سرین): برای سنجش جابجایی فسفاتیدیل سرین اسپرم از کیت آنکسین-V (Immune Quality Products (IQP), Groningen, The Netherlands)  و براساس دستورالعمل ارائه‌شده توسط شرکت سازنده استفاده شد. آنکسین-V یک پروب وابسته به کلسیم است که می­تواند بیرون آمدن فسفاتیدیل سرین را در غشای اسپرم مشخص نماید. در مرحله نخست، اسپرم در یک بافر کلسیم شستشو داده شده و با غلظت یک‌میلیون اسپرم در هر میلی­لیتر محلول تنظیم شد. سپس، 10 میکرولیتر آنکسین-V متصل به پروب FITC به 100 میکرولیتر از محلول اسپرم اضافه‌شده و به مدت 20 دقیقه روی یخ انکوبه شد. پس‌ازآن، 10 میکرولیتر رنگ پروپیدیوم آیوداید (PI) به محلول اضافه‌شده و محلول بدست آمده مجدداً به مدت 10 دقیقه روی یخ انکوبه شد. سپس، برای هر نمونه 10000 رخداد به­وسیله دستگاه فلوسایتومتر (Becton Dickinson, San Khosoz, CA, USA) ثبت شد. اسپرم­ها به چهار گروه زیر تقسیم شدند: اسپرم­های آپوپوتوز نشده ( آنکسین منفی و  PIمنفی)، اسپرم­هایی که اوایل مرحله آپوپتوز بودند (آنکسین مثبت و PI منفی)، اسپرم­هایی که در اواخر مرحله آپوپتوز بودند (آنکسین منفی و PI مثبت) و اسپرم­های نکروز شده (آنکسین مثبت و PI مثبت) (35).

آنالیز آماری: این آزمایش در قالب طرح آماری فاکتوریل 3 × 2 با شش تکرار انجام شد. داده­ها به‌صورت میانگین حداقل مربعات ± انحراف معیار میانگین (Lsmean ± SEM) نشان داده‌شده‌اند. داده­ها با نرم­افزار آماری SAS 9.1 (24) و به رویه­ی Mixed با استفاده از مدل آماری زیر تجزیه ‌و تحلیل شدند. برای مقایسه میانگین­های بدست آمده از آزمون توکی استفاده شد.

Yijkl=μ+Ci+Tj+Rk+CTij+eijkl

 Yijkl: مشاهدات، μ: میانگین جامعه، Ci: اثر سیستئین (i=1, 2, 3)، :Tj  اثر ترهالوز (j=1, 2)، Rk: اثر تکرار (j=1, 2, …, 6)، TCij: برهمکنش تره­هالوز و سیستئین، eilk: اثرات باقیمانده.

نتایج

نتایج حاصل از این آزمایش نشان می­دهد که سیستئین اثری بر فراسنجه­های حرکتی اسپرم گاو پس­از یخ‌گشایی ندارد (0.05P≥). همچنین، میزان جنبایی پیش­رونده، سایر فراسنجه­های حرکتی، یکپارچگی غشای پلاسمایی و یکپارچگی آکروزوم و زنده­مانی گروه T0 بیشتر از گروه T100 بودند (0.01P≤). نتایج گزارش‌شده حاکی از آن است که اثر متقابل تره­هالوز و سیستئین بر فراسنجه­های جنبایی، یکپارچگی غشای پلاسمایی یکپارچگی آکروزوم و زنده­مانی ازنظر آماری معنی­دار نبودند (جدول 1 و 2).

 

جدول 1- اثر سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر فراسنجه­های جنبایی، یکپارچگی آکروزم و غشای پلاسمایی اسپرم گاو پس از یخ­گشایی.

فراسنجه

تره­هالوز (T) (میلی­مول)

سیستئین (C) (میلی­مول)

P value

صفر

100

SEM

صفر

5

10

SEM

تره­هالوز (T)

سیستئین (C)

T×C

جنبایی پیش­رونده (%)

15/58a

82/13b

18/2

17/35

59/34

19/38

68/2

**

ns

ns

(μm/s) VAP

24/45a

94/17b

39/1

89/30

38/32

51/31

69/1

**

ns

ns

(μm/s) VSL

77/35a

23/12b

29/1

86/23

46/24

69/23

59/1

**

ns

ns

(μm/s) VCL

34/66a

92/31b

74/1

47/15

56/50

67/49

13/2

**

ns

ns

(μm) ALH

89/2a

46/2b

07/0

54/2

79/2

69/2

09/0

**

ns

ns

(%) LIN

85/53a

19/38b

74/1

38/47

26/45

41/45

13/2

**

ns

ns

(%) STR

83/78a

33/67b

49/1

86/73

20/72

18/73

83/1

**

ns

ns

(Hz) BCF

53/11a

41/7b

26/0

61/9

25/9

54/9

31/0

**

ns

ns

a و b: میانگین­های دارای حروف غیرمشابه نشان­دهنده­ی وجود تفاوت معنی­دار می­باشد (**: P ≤ 0.01، ns: عدم وجود تفاوت معنی­دار)

 

جدول 2- اثر سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر یکپارچگی  و فعالیت غشای پلاسمایی و یکپارچگی غشای آکروزومی اسپرم گاو پس از یخ‌گشایی.

فراسنجه(%)

تره­هالوز (T) (میلی­مول)

سیستئین (C) (میلی­مول)

P value

صفر

100

SEM

صفر

5

10

SEM

تره­هالوز (T)

سیستئین (C)

T×C

یکپارچگی غشای پلاسمایی (%)

a44/58

b77/42

92/3

00/57

00/54

83/40

80/4

**

ns

ns

فعالیت غشای پلاسمایی (%)

a50/53

a22/32

37/2

50/39

83/45

25/43

90/2

**

ns

ns

یکپارچگی غشای آکروزومی (%)

a33/50

b58/57

38/2

00/60

87/51

00/50

92/2

*

ns

ns

a و b: میانگین­های دارای حروف غیرمشابه نشان­دهنده­ی وجود تفاوت معنی­دار می­باشد (**: P ≤ 0.01، *: P ≤ 0.05، ns: عدم وجود تفاوت معنی­دار)

 

نتایج ارائه‌شده در جدول 3 نشان می­دهد که سطوح مختلف سیستئین هیچ اثری بر میزان اسپرم­های زنده (آپوپتوز نشده) نداشته است (0.05P≥). همچنین، افزودن تره­هالوز باعث کاهش میزان اسپرم­های زنده و افزایش میزان اسپرم‌ها در مرحله نهایی آپوتوزیس نسبت به گروه فاقد تره­هالوز شده است (0.05P≤).

 

جدول 3- اثر سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر وضعیت آپوپتوز اسپرم گاو پس از فرآیند یخ­گشایی.

فراسنجه(%)

تره­هالوز (T) (میلی­مول)

سیستئین (C) (میلی­مول)

P value

صفر

100

SEM

صفر

5

10

SEM

تره­هالوز (T)

سیستئین (C)

T×C

اسپرم زنده

a82/62

b03/48

24/1

69/55

03/55

55/55

52/1

**

ns

**

اسپرم در مرحله اولیه آپوپتوز

67/4

83/5

63/1

57/4

83/6

34/4

99/1

ns

ns

ns

اسپرم مرحله در نهایی آپوپتوز

a61/3

b07/9

74/1

36/4

32/10

35/4

14/2

*

ns

*

اسپرم­ نکروز شده

80/28

41/37

00/3

36/35

80/27

75/35

68/3

ns

ns

ns

 a و b: میانگین­های دارای حروف غیرمشابه نشان­دهنده­ی وجود تفاوت معنی­دار می­باشد (**: P ≤ 0.01، *: P ≤ 0.05، ns: عدم وجود تفاوت معنی­دار)

 

نتایج گزارش‌شده در نمودارهای 1 و 2 اثرات متقابل سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین در مورد اسپرم­های زنده و اسپرم­های در مرحله نهایی آپوپتوزیس را نشان می­دهد. تیماری که حاوی 10 میلی­مول سیستئین و بدون تره­هالوز بود (T0C10) بیشترین زنده­مانی (0.05P≤) و کمترین میزان اسپرم­های آپوپتوز شده را نشان داده است. براساس این نتایج، نامطلوب­ترین ترکیب، گروه تیماری حاوی 100 میلی­مول تره­هالوز و 10 میلی­مول سیستئین (T100C10) بوده است (0.05P≥ ).

 

نمودار 1- اثر متقابل سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر میزان زنده­مانی اسپرم­ها. T0C0: رقیق‌کننده بدون ترهالوز و بدون سیستئین، T0C5:رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 5 میلی­مول سیستئین، T0C10: رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 10 میلی­مول سیستئین، T100C0:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و بدون سیستئین، T100C5:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 5 میلی­مول سیستئین و T100C10:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 10 میلی­مول سیستئین.

 

نمودار 2- اثر متقابل سطوح مختلف تره­هالوز و سیستئین بر میزان اسپرم­هایی که در مرحله نهایی آپوپتوز هستند. T0C0: رقیق‌کننده بدون ترهالوز و بدون سیستئین، T0C5:رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 5 میلی­مول سیستئین، T0C10: رقیق­کننده بدون ترهالوز و حاوی 10 میلی­مول سیستئین، T100C0:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و بدون سیستئین، T100C5:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 5 میلی­مول سیستئین و T100C10:رقیق­کننده حاوی 100 میلی­مول ترهالوز و 10 میلی­مول سیستئین.

 

 

بحث

نتایج مطالعه حاضر نشان داد که افزودن 100 میلی­مول تره­هالوز به رقیق‌کننده باعث کاهش شدید فراسنجه­های حرکتی، زنده­مانی و یکپارچگی غشای پلاسمایی اسپرم‌ می­شود. این نتایج برخلاف نتایج نجفی و همکاران (2013) در ارتباط بااثر این دی­ساکارید بر ویژگی­های اسپرم قوچ بود. آن­ها گزارش کردند که افزودن 100 میلی­مول تره­هالوز به همراه 5 درصد گلیسرول باعث افزایش معنی­دار جنبایی کل و پیش­رونده و زنده­مانی اسپرم­ها می­شود (21). همچنین، در مطالعه­ای دیگر، پژوهشگران میزان بهینه تره­هالوز در محافظت از اسپرم قوچ را 50 میلی­مول برآورد کردند (8). در مقابل، نتایج پژوهش حاضر با مطالعه‌ی اسکوایرز و همکاران (2004)که اثر سرما محافظ­های مختلف را در بهبود ویژگی­های اسپرم اسب بررسی کردند، مطابقت داشت. آن­ها گزارش کردند که تره­هالوز نتوانست تفاوت معنی­داری در جنبایی کل و پیش­رونده و زنده­مانی اسپرم اسب، نسبت به گلوکز و رافینوز ایجاد نماید (29). همچنین مدودو و همکاران (2010) گزارش کردند که تره­هالوز هیچ اثر مثبتی بر زنده­مانی، یکپارچگی DNA و سطح ATP اسپرم­های یخ­گشایی شده خروس و کبک بربری نداشت (17). به نظر می­رسد نتایج متفاوت در پژوهش­های مختلف به دلیل تأثیرگذاری متفاوت تره‌هالوز در گونه­ها و شرایط مختلف آزمایشی باشد، به‌گونه‌ای که حتی در دو مطالعه متفاوت که روی قوچ صورت گرفته است پژوهشگران دوزهای متفاوتی از تره­هالوز را به‌عنوان دوز مؤثر گزارش کرده­اند (8 و 21).

تنش اکسیداتیو فرایندی تحت تأثیر رادیکال­های آزاد است که مهم­ترین دلیل کاهش باروری اسپرم است. طی فرایند انجماد- یخ‌گشایی مهم­ترین عواملی که با افزایش میزان رادیکال­های آزاد در اسپرم باعث القای مرگ برنامه‌ریزی‌شده (آپوپتوز) و کاهش جنبایی و به دنبال آن کاهش باروری در گاو (27)، گوسفند و بز (19) و اسب (26) می­شوند عبارتند از: شوک سرمایی ناشی از تشکیل کریستال­های یخ، ترکیبات رقیق­کننده، نرخ سردسازی و تنش اسمزی. در این راستا و بر اساس مطالعات صورت گرفته اولین و شناخته‌شده‌ترین راهکار برای مقابله با اثرات منفی رادیکال­های آزاد، استفاده از آنتی‌اکسیدان­ها در رقیق­کننده است. سیستئین اسیدآمینه‌ای حاوی گوگرد (گروه تیول) است که اثر آنتی­اکسیدانی آن در اسپرم گاو (23)، خروس (22) و قوچ (8) بررسی و به اثبات رسیده است. سیستئین می­تواند با حذف رادیکال­های آزاد میزان آسیب وارده به سلول اسپرم توسط این رادیکال­ها را کاهش دهد. سازوکار اصلی این فرایند در گزارش مگنس و همکاران (1980) آورده شده است. ان استیل- ال-سیستئین به‌عنوان پیش­ساز بیوسنتز سیستئین و گلوتاتیون داخل سلولی است که این ترکیبات نقش اساسی در متابولیسم گلوتاتیون دارند. از طرف دیگر، گلوتاتیون نیز نقش اساسی در فعالیت سوپر اکسید دیسمیوتاز دارد که ترکیب اخیر اصلی­ترین عامل پاکسازی رادیکال­های آزاد در اسپرم است (18). در این راستا در پژوهشی، اویسال و همکاران (2007) گزارش کردند که افزودن سیستئین به رقیق­کننده اسپرم قوچ باعث افزایش میزان زنده­مانی آن­ها شده است (33). در مطالعه­ای دیگر، پارتیکا و همکاران (2013) گزارش کردند که افزودن سیستئین به رقیق‌کننده اسپرم خروس باعث بهبود جنبایی کل و پیش‌رونده و زنده­مانی شده است (22). همچنین، فوناهاشی و همکاران (2005) گزارش کردند که افزودن 5 میلی­مول سیستئین به رقیق‌کننده باعث بهبود میزان زنده­مانی اسپرم خوک می‌شود. اما برخلاف این مطالعات، نتایج پژوهش حاضر نشان داد که افزودن سیستئین در حضور و یا عدم حضور تره­هالوز تأثیری بر میزان فراسنجه­های جنبایی و زنده­مانی اسپرم گاو نداشت (11). همچنین، در پژوهش حاضر مطالعه اثرات متقابل سیستئین و تره­هالوز بر فراسنجه­های اسپرم­ نشان می­دهد که ترکیب تیماری که حاوی 10 میلی­مول سیستئین و بدون تره­هالوز بود (T0C10) بیشترین زنده­مانی و کمترین میزان اسپرم­های آپوپتوز شده را داشته است. براساس نتایج بدست آمده از این پژوهش به نظر می­رسد افزایش سطوح تره­هالوز و سیستئین (T100C10) اثر هم­افزایی نداشته و نسبت به همه­ی تیمارهای دیگر بدترین پاسخ را نشان دادند. در این راستا، آتساهین و همکاران (2008) گزارش کردند که افزایش دوز تره­هالوز از 25 به 75 میلی­مول باعث کاهش جنبایی اسپرم بز شده در حالیه میزان مالون­دی­آلدهاید (MDA) کاهش‌یافته است. کاهش میزان MDA با افزایش توانایی آنتی­اکسیدانی اسپرم­های تیمار شده همراه بود. همچنین، آن­ها اشاره کردند که افزایش دوزهای سیستئین از صفر به 15 میلی­مول باعث بهبود جنبایی و توانایی آنتی‌‌اکسیدانی اسپرم­های می­شود (4). باتوجه به این یافته­ها، به نظر می­رسد افزایش میزان تره­هالوز صرف­نظر از ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی که دارد، باعث بروز اثرات سمی در اسپرم شده و جنبایی و زنده­مانی آن­ها را تحت تأثیر قرار می­دهد. برخلاف این نتایج، بدر و همکاران (2014) گزارش کردند که ترکیب تره­هالوز (5 میلی­مول)، سیستئین (100 میلی­مول) و هایپوتائورین (20 میلی­مول) باعث بهبود جنبایی، زنده­مانی، یکپارچگی آکروزومی و ظرفیت آنتی­اکسیدانی اسپرم گاومیش پس از یخ‌گشایی می­شود (5). بنابراین، به نظر می­رسد برای اثبات برهمکنش دقیق تره­هالوز و سیستئین بر ویژگی­های اسپرم و باتوجه به نتایج کاملاً متفاوت در پژوهش­های مختلف، مطالعات بیشتری در این زمینه نیاز است.

نتیجه ­گیری کلی

بر اساس نتایج این پژوهش افزودن سیستئین و تره­هالوز به رقیق­کننده اسپرم گاو تأثیر مثبتی بر فراسنجه­های کیفی اسپرم پس از فرایند انجماد یخ­گشایی ندارد. همچنین، مشخص شد که افزودن 100 میلی­مول تره­هالوز می­تواند اثر منفی بر جنبایی و زنده­مانی اسپرم گاو دارد. باتوجه به نتایج ضدونقیض در پژوهش­های گذشته به نظر می­رسد برای روشن شدن همه زوایا، به مطالعات تکمیلی و بیشتر نیاز ­باشد.

1-      Aboagla, E. M. E., and Terada, T., 2003. Trehalose-enhanced fluidity of the goat sperm membrane and its protection during freezing. Biology of Reproduction. 69, PP: 1245-1250.

2-      Ahmad, E., and Aksoy, M., 2012. Trehalose as a cryoprotective agent for the sperm cells: A Mini Review. Animal Health, Production and Hygiene. 1, PP: 123-129.

3-      Aisen, E., Alvarez, H., Venturino, A., and Garde, J., 2000. Effect of trehalose and EDTA on cryoprotective action of ram semen diluents. Theriogenology. 53, PP: 1053-1061.

4-      Atessahin, A., Bucak, M. N., Tuncer, P. B., and Kızıl, M., 2008. Effects of anti-oxidant additives on microscopic and oxidative parameters of Angora goat semen following the freeze–thawing process. Small Ruminant Research. 77, PP: 38-44.

5-      Badr, M., Azab, A., and Rawash, Z., 2014. Effect of trehalose, cysteine and hypotaurine on buffalo bull sperm freezability, ultrastructure changes and fertilizing potentials. Assiut Veterinary Medicine Journal. 60, PP: 38-45.

6-      Bansal, A. K., and Bilaspuri, G., 2010. Impacts of oxidative stress and antioxidants on semen functions. Veterinary Medicine International. 2011, PP: 1-8.

7-      Beconi, M., Francia, C., Mora, N., and Affranchino, M., 1993. Effect of natural antioxidants on frozen bovine semen preservation. Theriogenology. 40, PP: 841-851.

8-      Bucak, M. N., Ateşşahin, A., Varışlı, Ö., Yüce, A., Tekin, N., and Akçay, A., 2007. The influence of trehalose, taurine, cysteamine and hyaluronan on ram semen: microscopic and oxidative stress parameters after freeze–thawing process. Theriogenology. 67, PP: 1060-1067.

9-      Emamverdi, M., Zhandi, M., Zare Shahneh, A., Sharafi, M., and Akbari‐Sharif, A., 2013. Optimization of Ram Semen Cryopreservation Using a Chemically Defined Soybean Lecithin‐Based Extender. Reproduction in Domestic Animals. 48(6), PP: 899-904.

10-   Fukuhara, R., and Nishikawa, Y., 1973. Effects of pH, sperm concentration, washing and substrate concentration on respiration and motility of goat spermatozoa. Japanies Journal of Zootechnology Science. 44, PP: 266-270.

11-   Funahashi, H., and Sano, T., 2005. Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10 C. Theriogenology. 63, PP: 1605-1616.

12-   Gonçalves, F., Barretto, L., Arruda, R., Perri, S., and Mingoti, G., 2010. Effect of antioxidants during bovine in vitro fertilization procedures on spermatozoa and embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 45, PP: 129-135.

13-   Gungor, S., Ozturk, C., and Omur, A., 2017. Positive effects of trehalose and cysteine on ram sperm parameters. Veterinarni Medicina. 62, PP: 245-252.

14-   Hu, J. H., Zan, L. S., Zhao, X. L., Li, Q. W., Jiang, Z. L., Li, Y. K., and Li, X., 2010. Effects of trehalose supplementation on semen quality and oxidative stress variables in frozen-thawed bovine semen. Journal of Animal Science. 88, PP: 1657-1662.

15-   Leboeuf, B., Restall, B., and Salamon, S., 2000. Production and storage of goat semen for artificial insemination. Animal Reproduction Science. 62, PP: 113-141.

16-   Liu, Z., Foote, R. H., and Brockett, C. C., 1998. Survival of bull sperm frozen at different rates in media varying in osmolarity. Cryobiology. 37, PP: 219-230.

17-   Madeddu, M., Berlinguer, F., Pasciu, V., Succu, S., Satta, V., Leoni, G. G., Zinellu, A., Muzzeddu, M., Carru, C., and Naitana, S., 2010. Differences in semen freezability and intracellular ATP content between the rooster (Gallus gallus domesticus) and the Barbary partridge (Alectoris barbara). Theriogenology. 74, PP: 1010-1018.

18-   Magnes, L., and Li, T., 1980. Isolation and properties of superoxide dismutase from bovine spermatozoa. Biology of Reproduction. 22, PP: 965-969.

19-   Naijian, H. R., Kohram, H., Shahneh, A. Z., Sharafi, M., and Bucak, M. N., 2013. Effects of different concentrations of BHT on microscopic and oxidative parameters of Mahabadi goat semen following the freeze–thaw process. Cryobiology. 66, PP: 151-155.

20-   Naing, S., Wahid, H., Mohd Azam, K., Rosnina, Y., Zuki, A., Kazhal, S., Bukar, M., Thein, M., Kyaw, T., and San, M., 2010. Effect of sugars on characteristics of Boer goat semen after cryopreservation. Animal Reproduction Science. 122, PP: 23-28.

21-   Najafi, A., Zhandi, M., Towhidi, A., Sharafi, M., Sharif, A. A., Motlagh, M. K., and Martinez-Pastor, F., 2013. Trehalose and glycerol have a dose-dependent synergistic effect on the post-thawing quality of ram semen cryopreserved in a soybean lecithin-based extender. Cryobiology. 66, PP: 275-282.

22-   Partyka, A., Niżański, W., Bajzert, J., Łukaszewicz, E., and Ochota, M., 2013. The effect of cysteine and superoxide dismutase on the quality of post-thawed chicken sperm. Cryobiology. 67, PP: 132-136.

23-   Sarıözkan, S., Bucak, M. N., Tuncer, P. B., Ulutaş, P. A., and Bilgen, A., 2009. The influence of cysteine and taurine on microscopic–oxidative stress parameters and fertilizing ability of bull semen following cryopreservation. Cryobiology. 58, PP: 134-138.

24-   SAS Institute (2002). 'SAS proprietary software release 9.0' (SAS Inst. Inc.: Cary, NC(.

25-   Schulz, M., Risopatrón, J., Matus, G., Pineda, E., Rojas, C., Isachenko, V., Isachenko, E., and Sánchez, R., 2017. Trehalose sustains a higher post‐thaw sperm motility than sucrose in vitrified human sperm. Andrologia. 2016, PP: 1-3.

26-   Seifi-Jamadi, A., Kohram, H., Zareh-Shahne, A., Dehghanizadeh, P., and Ahmad, E., 2016. Effect of various concentrations of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene on freezing capacity of Turkman stallion sperm. Animal Reproduction Science. 170, PP: 108-113.

27-   Shah, N., Singh, V., Yadav, H. P., Verma, M., Chauhan, D. S., Saxena, A., Yadav, S., and Swain, D. K., 2017. Effect of reduced glutathione supplementation in semen extender on tyrosine phosphorylation and apoptosis like changes in frozen thawed Hariana bull spermatozoa. Animal Reproduction Science. 182, PP: 111-122.

28-   Sikka, S. C., Rajasekaran, M., and Hellstrom, W. J., 1995. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility. Journal of Andrology. 16, PP: 464-468.

29-   Squires, E. L., Keith, S. L., and Graham, J. K., 2004. Evaluation of alternative cryoprotectants for preserving stallion spermatozoa. Theriogenology. 62, PP: 1056-1065.

30-   Storey, B. T., Noiles, E. E., and Thompson, K. A., 1998. Comparison of glycerol, other polyols, trehalose, and raffinose to provide a defined cryoprotectant medium for mouse sperm cryopreservation. Cryobiology. 37, PP: 46-58.

31-   Thomas, A., Meyers, S., and Ball, B., 2006. Capacitation-like changes in equine spermatozoa following cryopreservation. Theriogenology. 65, PP: 1531-1550.

32-   Thys, M., Nauwynck, H., Maes, D., Hoogewijs, M., Vercauteren, D., Rijsselaere, T., Favoreel, H., and Van Soom, A., 2009. Expression and putative function of fibronectin and its receptor (integrin α5β1) in male and female gametes during bovine fertilization in vitro. Reproduction. 138, PP: 471-482.

33-   Uysal, O., and Bucak, M., 2007. Effects of oxidized glutathione, bovine serum albumin, cysteine and lycopene on the quality of frozen-thawed ram semen. Acta Veterinaria Brunensis. 76, PP: 383-390.

34-   Uysal, O., Bucak, M., Yavas, I., and Varisli, O., 2007. Effect of various antioxidants on the quality of frozen–thawed bull semen. Journal of Animal and Veterinary Advances. 6, PP: 1362-1366.

35-   Zanganeh, Z., Zhandi, M., Zare-Shahneh, A., Najafi, A., Mahdi Nabi, M., Mohammadi- and Sangcheshmeh, A., 2013. Does rosemary aqueous extract improve buck semen cryopreservation? Small Ruminant Research. 114, PP: 120-125.

36-   Zhu, Z., Fan, X., Pan, Y., Lu, Y., and Zeng, W., 2017. Trehalose improves rabbit sperm quality during cryopreservation. Cryobiology. 75, PP: 45-51.