مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

کشت بافت باله دمی تاسماهی ایرانی Acipenser persicus

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس کشت بافت،موسسه تحقیقات بین المللی تاسماهیان دریای خزر

2 رییس موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور

3 کارشناس / موسسه تحقیقات بیمن المللی تاسماهیان دریای خزر

4 مدیرکل طرح، بودجه و آمار / سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی

5 کارشناس/ موسسه تحقیقات بین المللی تاسماهیان دریای خزر

6 رئیس گروه بیوتکنولوژی دام و آبزیان /مرکز ملی مهندسی ژنتیک و فن آوری زیستی

7 کارشناس بخش بیوتکنولوژی/ موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور

چکیده

در این تحقیق رده های اولیه سلولی از طریق کشت تکه های باله دمی تاسماهی ایرانی Acipenser persicus تهیه شد. حاشیه باله دمی یک عدد ماهی 2 ساله دارای طول 23 سانتیمتر و وزن 133 گرم به اندازه تقریباً 2 سانتیمتر بریده شد، سه بار با محلول PBS حاوی آنتی بیوتیک ها شستشو داده شد و سپس به تکه های تقریباً 1 میلی متر بریده شد و در محیط کشت L-15 حاوی آنتی بیوتیک ها و 20 درصد سرم جنین گاو تحت دمای 22 درجه سانتیگراد کشت داده شد. پس از تشکیل مقدار کافی لایه سلولی بر روی کف فلاسک کشت،
سلول ها با محلول PBS حاوی آنتی بیوتیک ها شستشو شدند و از طریق تیمار با Trypsin-EDTA (25/0 درصد) و تکان دادن فلاسک از کف فلاسک جدا شدند. پس از شستشوی سلول ها با محلول PBS حاوی آنتی بیوتیک ها آنها در 5 میلی لیتر محیط کشت L-15 حاوی 20 درصد سرم جنین گاو، آنتی بیوتیک ها تحت دمای 22درجه سانتیگراد کشت داده شدند (ساب کالچر اول). پس از تشکیل مقدارکافی لایه سلولی، مشابه همین مراحل برای ساب کالچر دوم انجام شد. در بین سلول های حاصل از کشت اولیه تکه های بافت، سلول های
شبه فیبروبلاست و شبه اپی تلیال مشاهده شد ولی پس از انجام ساب کالچر اول تعداد سلول های شبه فیبروبلاست بیشتر بود. در این تحقیق تولید دو رده سلولی در نتیجه کشت اولیه و دو کشت مجدد (ساب کالچر) بررسی شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Caudal fin tissue culture of Persian sturgeon Acipenser persicus

نویسندگان [English]

  • Mohammad Reza Nowruzfashkhami 1
  • Mohammad Pourkazemi 2
  • Mohammad Hassanzadeh Saber 3
  • Mahmoud Bahmani 4
  • Shahrouz Baradrannoveiri 5
  • Morteza Daliri 6
  • Ahmad ghoroghi 7

1 Tissue culture expert

2 Director/ Iranian Fisheries Research Organization (I.F.R.O)

3 Expert/International Sturgeon Research Institute

4 Director General of Planning, Budget and Statistics/Agricultural Research, Education and Extension Organization )

5 Expert/ International Sturgeon Research Institute

6 ِDirector of Department of animal and marine biotechnology, National institute of genetic Engineering and Biotechnology

7 Expert of Biotechnology Department/Iranian Fisheries Research Organization (I.F.R.O)

چکیده [English]

Primary cell lines were established from the culture of explants of caudal fin of Persian sturgeon,
Acipenser persicus. The margin of the caudal fin from a two year old specimen (23 cm in length, and
133 g in weight) was aseptically cut (2 cm), washed three times with PBS containing antibiotics and
then minced into 1 mm explants and cultured in L-15 medium complemented with antibiotics and FBS
(20% ) at 22 °C. After confluent monolayer formation on the bottom of the flask, the cells were washed
with PBS containing antibiotics and dislodged by trypsin-EDTA solution (0.25%) and shaking the
flask. After washing the cells with PBS containing the antibiotics, they were cultured in 5 ml of L-15
medium, FBS (20%), antibiotics at 22 °C (first subculture). After a confluent monolayer formation, a
similar procedure was followed for the second subculture.The emerging cells from explants exhibited
fibroblast-like and epithelial-like cells in primary culture but the fibroblast-like cells were seen to
predominate after the first subculture. In the present study the establishment of cell lines from the
original culture at two passages was investigated.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Persian sturgeon
  • Acipenser persicus
  • tissue culture
  • Caudal fin

کشت بافت باله دمی تاسماهی ایرانیAcipenser persicus

محمدرضا نوروزفشخامی1*، محمد پورکاظمی2، محمدحسن زاده صابر1، شهروز برادران نویری1، محمود بهمنی1، مرتضی دلیری3 و احمد غروقی2 

1 رشت، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، موسسه تحقیقات بین‌المللی تاسماهیان دریای خزر 

2 تهران، سازمان تحقیقات آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور 

3تهران، پژوهشگاه ملی مهندس ژنتیک و زیست‌فناوری

تاریخ دریافت: 15/4/95                تاریخ پذیرش: 20/3/96 

چکیده

در این تحقیق رده‌های اولیه سلولی از طریق کشت تکه‌های باله دمی تاسماهی ایرانی  Acipenser persicusتهیه شد. حاشیه باله دمی یک عدد ماهی دوساله به طول 23 سانتیمتر و وزن 133گرم را به‌اندازه تقریباً دو سانتیمتر بریده، سه­بار با محلولPBS  حاوی آنتی‌بیوتیک‌ها شستشو داده شد. سپس به تکه‌های تقریباً 1 میلیمتر بریده شد و در محیط­ کشت  L-15حاوی آنتی­بیوتیک­ها و 20 درصد سرم جنین­ گاو تحت دمای 22 درجه سانتیگراد کشت داده شد. پس از تشکیل مقدار کافی لایه سولی بر روی کف فلاسک کشت، سلول­ها با محلولPBS  حاوی آنتی­بیوتیک­ها شستشو شدند و از طریق تیمار با Trypsin-EDTA (25/0درصد) و تکان دادن فلاسک از کف فلاسک جدا شدند. پس از شستشوی سلول‌ها با محلولPBS  حاوی آنتی­بیوتیک ها، آنها در 5 میلی­لیتر محیط­ کشت   L-15حاوی 20 درصد سرم جنین گاو، آنتی­بیوتیک­ها تحت دمای 22 درجه سانتیگراد کشت داده شدند (ساب­کالچر اول). پس از تشکیل مقدار کافی لایه سلولی، مشابه همین مراحل برای ساب­کالچردوم انجام شد. در بین سلول­های حاصل از کشت اولیه تکه­های بافت، سلول­های شبه­فیبروبلاست و شبه­اپی­تلیال مشاهده شد ولی پس از انجام ساب­کالچر (کشت مجدد) اول تعداد سلول­های شبه فیبروبلاست بیشتر بود. در این تحقیق تولید دو رده ­سلولی درنتیجه کشت اولیه و دو ساب­کالچر بررسی شد.

واژه‌های کلیدی:تاسماهی ایرانی،­Acipenser persicus  ، کشت بافت، باله دمی

* نویسنده مسئول، تلفن: 0133453721 ، پست الکترونیکی: Nowruzfashkhami@yahoo.com

مقدمه

 

سلول­های جداشده از بافت جانوری یا خود موجود زنده چنانچه در یک ظرف کشت حاوی مواد غذایی موردنیاز سلول‌ها و فاکتورهای رشد قرارداده شوند به رشد خود ادامه خواهند داد. این عمل کشت بافت نامیده می‌شود (10). کشت بافتماهی‌ها خیلی شبیه روش‌های استفاده شده برای کشت بافت پستانداران و پرندگان استو موارد مشترک فراوانی وجوددارد (61).کشت سلول­هایماهیظاهراً  اندکی آسانتر است (59). در کشت سلولی، سلول­هایحاصل از کشت اولیه و رده سلولی تولید می‌شود(51). سلول­های حاصل از کشت اولیه درنتیجه کشت تکه‌هایبافت (explant) جداشده از خود موجود زنده و یا سلول­های حاصل از تیمار آنزیمی بافت موردنظر بدست می­آیدولی رده‌های سلولی درنتیجه کشت مجدد و متوالی سلول­های حاصل از کشت اولیه بافت (سلول‌ها) حاصل می‌شود.اولین رده سلولی تحت عنوانRTG-2توسط ولف و کویمبای (58) تهیه شد. این رده سلولی از گناد ماهی قزل­آلایرنگین‌کمان جوان برای جداسازی ویروس IPNV تهیه شد. طی پنجاه سال گذشته، رده‌های سلولی متعلق به تعدادزیادی از ماهی­ها بدست آمد و تا سال 2011، 283 رده سلولی از ماهیان باله­دار سراسر جهان تهیه شد (40). کشت سلول­های ماهی­ها برای انجام مطالعات مختلف ازجمله ویروس­شناسی (24 و 62)، بررسی مولکولی و سلولیپروسه‌های فیزیولوژیک و مکانیزم­های سم­شناسی (8)، آلاینده‌های محیط‌زیست (12، 19 و 52)، اندو­کرینولوژی، بیوتکنولوژی و آبزی‌پروری (6)، ایمنولوژی(7 و 15)، بیوشیمی (27)، کنترل بیماری (55)، رادیوبیولوژی (49)، سرطان‌شناسی و ژنتیک (4 و 8) و حفظ ذخایر (13 و 64) صورت می­گیرد. همچنین رده­های سلولی برای تولید مکمل­هایغذایی نظیر اسیدهای چرب امگا 3 استفاده می‌شوند. سلول­های ماهی اگر در مقیاس وسیع تولید شوند پتانسیلبیوتکنولوژیک تولید غذای ماهی را دارند لذا این تکنولوژی ممکن است نیاز به صید گونه‌های وحشیرا کاهش دهد (25).

برخی از بافت‌ها بهتر از سایر بافت‌ها کشت می­شوند. سلول­های جنین و لارو به دلیل بالابودن میزان تقسیمات میتوزی راحت‌ترین بافت‌ها برای کشت هستند (42). گاهی خارج نمودن بافت از بدن بدون کشتن و یا وارد نمودن آسیب جدی به ماهی مهم است و چنانچه ماهی موردنظر کمیاب و یا دارای ارزشاقتصادی زیادیباشد اهمیت این موضوعبمراتب بیشتر است. بافت باله بخاطر تقسیمات میتوزی و قدرتترمیمزیاد (24)، عدم نیاز به کشتن ماهی (44)و سهولت نمونه‌برداری(1) اغلب برای کشت استفاده می‌شود. باله دمی بیش از سایر باله‌ها برای کشت انتخاب می‌شود (34،29 و 63). کشت باله­ دمی در مورد ماهی طلایی Carassius auratus (11 و 44)، ماهی­کپورکوی carpiokoi Cyprinus (16)، ماهی سیم سر­مخطط Sparus  auratus (5)، ماهیکاردینالApogon imberbis  و اردک‌ماهیEsox lucius (2)، کپور­سربزرگ  nobilis Aristichthys (43)،ماهی مداکا  Oryzias latipes(30)، باس دریاییآسیایی Lates calcarifer (39)، ماهی Anabariliusgrahami (57)، کپورماهی روهو Labeorohita (38)،ماهیتوربوت Scophthalmusmaximus (18)، تاسماهی سیبری Acipenser baerii، تاسماهی سفید Acipensertransmontanus و فیلماهی Huso huso (22)، تاسماهی چینیAcipenser sinensis  (64) و تاسماهی ساخالین Acipenser mikadoi (56) انجام شد. با توجه به کاربردهایمختلف کشتبافت ماهیان و ارزش اقتصادی زیاد تاسماهی ایرانی برای کشورمان، در این تحقیق کشت تکه‌های بافت باله تاسماهی ایرانیبمنظور دستیابی به روش کشت­ بافت باله دمی و ردههای سلولیبافت باله این ماهی باارزش انجام شد. تاسماهی ایرانیاز نظر اقتصادی بیش از سایرتاسماهی­های دریای خزر برای کشورمان مهم است زیرا بخش اعظم صید (تقریباً 60 درصد) وخاویار استحصالی (تقریباً 55 درصد) سالیانه از ماهیان خاویاری دریای خزر توسط کشورمان مربوط به این‌گونه می‌باشد.تاسماهی­ایرانی متعلق به خانواده تاسماهیان است. این ماهی بیشتر در سواحل ایرانی دریای خزر زندگی می‌کند لذا علتنامگذاری آن نیز به همین دلیل می‌باشد (28).

مواد و روشها

یک عدد تاسماهی ایرانی پرورشی 2 ساله به طول تقریبی 23 سانتیمتر و وزن 133 گرم که بطور تصادفی جداشده بود برای این مطالعه استفاده شد. برای کشت تکه‌های بافت باله از روش فونتانا و همکاران (22) باکمی تغییرات استفاده شد. پس از بیهوش نمودن ماهی مورد آزمایش با پودر گل­میخک (45)، حاشیه باله­دمی ماهی مورد آزمایش پس از خشک‌ کردن با یک پارچه و ضدعفونی نمودن با اتانول 70 درصد، با یک عدد قیچی استریل به طول تقریباً دو سانتیمتر بریده شد و به یک عدد ظرف پتری استریل حاوی 10 میلی­لیتر محلول PBS، پنی­سیلین­پتاسیم­جی (iu.ml-1, Gibco 200)، استرپتومایسین سولفات (Gibco μg.ml-1, 200) و آمفوتریسین ­B (μg.ml-1, Gibco 5) منتقل شد. پس از 10 دقیقه بافت باله از ظرف پتری خارج و 2­بار دیگر و هربار به مدت 10 دقیقه در ظرف‌های پتری حاوی محلولPBS  و آنتی‌بیوتیک‌های ذکرشده قرارداده شد. سپس بافت باله را به یک ظرف پتری استریل حاوی 5/1 میلی­لیتر محیط کشت ­L-15 (Sigma)، HEPES (mM 25،(Gibco، 10 درصد سرم جنین گاو (FBS،Gibco)، پنی­سیلین­ پتاسیم ­جی (iu.ml-1200)، استرپتومایسین­ سولفات (μg.ml-1200) و آمفوتریسین (μg.ml-1 5) انتقال داده، به‌وسیله دو عدد اسکالپل استریل به تکه‌های کوچک تقریباً 1 میلیمتر بریده شد. قبل از انتقال تکه‌های بافت به یک فلاسک کشت (25 سانتیمترمربع)، بمنظور بالا بردن میزان چسبندگی بافت‌ها به کف فلاسک­کشت، مقدار 2/0 میلی‌لیتر سرم جنین ­گاو  به فلاسک افزوده، به مدت 5/1 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرارداده شد تا سرم خشک شود. سپس 14 عدد تکه­بافت باله به همراه 4 میلی­لیتر محیط­ کشت L-15 حاوی پنی­سیلین پتاسیم جی (iu.ml-1 200)، استرپتومایسین سولفات (μg.ml-1200) و آمفوتریسین B (μg.ml-1 5) توسط یک پیپت 10 میلی‌لیتری دهانه گشاد که قبلاً جداره آن با محیط کشت L-15 خیس شده بود به فلاسک­کشت منتقل شدند و بلافاصله تمامی محیط کشت از فلاسک خارج شد و فلاسک به انکوباتور 25 درجه سانتیگراد منتقل شد تا تکه‌های بافت بر روی کف فلاسک­ها قرارگیرند. پس از گذشت تقریباً 5/1 ساعت، 5/1 میلی‌لیتر محیط کشت  L-15حاوی20 درصد سرم جنین گاو، پنی­سیلین پتاسیم­ جی (iu.ml-1 100)، استرپتومایسین­ سولفات (μg.ml-1 100) و آمفوتریسین B (μg.ml-1 5/2) افزوده، در انکوباتور 22 درجه سانتیگراد قرارداده شد. پس از گذشت 24 ساعت نمونه­ها بررسی شدند. بافت‌های جداشده از کف از فلاسک خارج گردیدند، 1 میلی‌لیتر محیط کشت حاوی 20% سرم جنین­گاو به‌دقت به فلاسک اضافه شد و در انکوباتور قرارگرفت. هرروز مقداری محیط­کشت L-15 به فلاسک اضافه شد تا طی سه روز مقدار محیط­کشت داخل فلاسک به 5 میلی‌لیتر رسانده شد. هر 5 روز نیمی از حجم محیط­ کشت داخل فلاسک­کشت با محیط­کشت جدید جایگزین شد. پس از دو هفته وقتی سلول‌ها در اطراف تکه‌های باله­های کشت داده شده پدیدار شدند و به‌اندازه کافی سطح کف­ فلاسک را اشغال نمودند، سلول‌ها با محلولPBS  حاوی آنتی­بیوتیک­ها شستشو داده شدند و از طریق تیمار با محلول Trypsin-EDTA (25/0­ درصد تریپسین و 02/0 درصدEDTA ، حل‌شده در محلول PBS عاری از یون‌های کلسیم و منیزیم) به مدت­ 5 دقیقه و تکان دادن فلاسک کشت، از کف آن جدا شدند. فلاسک،کشت بمنظور کسب اطمینان از جدا شدن سلول­ها از کف فلاسک مذکور، با استفاده از میکروسکوپ اینورت (Nikon, Eclipse-Ti) مورد بررسی قرارگرفت. پس از سانتریفوژ نمودن سلول‌ها (با سرعت 1600 دور در دقیقه، به مدت 8 دقیقه) و افزودن سرم برای خنثی نمودن اثر تریپسین، سلول‌ها بمنظور کشت مجدد (ساب کالچر اول) به 5 میلی‌لیتر محیط­کشت با همان ترکیب قبلی منتقل شدند. همین مراحل برای کشت مجدد بعدی (ساب­کالچر دوم) نیز انجام شد.

نتایج

طی بیست‌وچهار ساعت اول اغلب تکه‌های باله دمی کشت داده شده به کف ظرف کشت چسبیدند. درصد تکه‌های بافتی چسبیده به کف فلاسک در طول مدت کشت 60 درصد بود. سلول‌ها پس از گذشت 24 ساعت شروع به تکثیر نمودند و سلول­های تکثیر یافته از حاشیه بافت به‌طرف خارج یعنی به سمت محیط­کشت مهاجرت نمودند (شکل 1). این سلول­های اولیه باعث تثبیت تکه‌های بافتی به کف فلاسک شدند. تکثیر و مهاجرت سلول‌ها از تکه‌های بافتی کشت­ داده شده به‌طرف محیط کشت ادامه یافت و باگذشت زمان بیشتر شد. در روز هفتم سلول­ها بخوبی تکثیر یافته بودند و تعداد زیادی سلول پیرامون تکه­های باله­دمی کشت داده شده مشاهده گردید (شکل­های

2 و 3).

 

 

 

 

 

سلول های تکثیر یافته

 

شکل 1-تکثیر سلول های باله دمی تاسماهی ایرانی در محیط کشت (120 ×)

 

 

سلول های تکثیر یافته

 

 

شکل 2- تکثیر سلول های  بافت باله تاسماهی ایرانی (300 ×)

 

سلول های تکثیر یافته

 

 

شکل 3-تکثیر بافت باله تاسماهی ایرانی (300 ×)

 

سلول­های تکثیرشده گسترش یافتند و به نزدیکی تکه­های بافتی مجاور رسیدند تا جایی که پس از گذشت دو هفته تقریباً 90 درصد کف فلاسک را اشغال نمودند. در روز چهاردهم دو نوع سلول در محیط ­کشت وجود داشتند. سلول­های شبه­فیبروبلاست که 70 تا 80 درصد سلول­ها و سلول­های شبیه اپی­تلیال (شکل 4) که بقیه سلول­ها را شامل می‌شدند.

 

 

سلول شبه فیبروبلاست

 

سلول شبه اپی­تلیال

 

شکل 4- سلول های حاصل از کشت اولیه باله دمی تاسماهی ایرانی (600  ×)

 

75 درصد سلول­های کشت داده شده (سلول­های حاصل از ساب­کالچر اول) به کف فلاسک چسبیدند و در محیط­کشت جدید تکثیر شدند. در بین سلول­های حاصل از ساب­کالچر اول نیز سلول­های شبه­ فیبروبلاست و شبه ­اپی­تلیال وجود داشت (شکل 5) و 85 درصد سلول­ها زنده بودند. در بین سلول­های حاصل از ساب­کالچر دوم نیز سلول­های شبه فیبروبلاست و شبه­اپی تلیال وجود داشت و­72 درصد سلول­ها زنده بودند. این سلول­ها تا شش روز به حیات خود ادامه دادند و در روز هفتم تغییر شکل­یافته، کم‌رنگ شدند و تکثیر آنها در روزهای بعد ادامه نیافت. بهترین تکثیر­سلولی تکه­های بافتی در محیط کشت­L-15  حاوی 20 درصد سرم جنین گاو و در دمای 22 درجه­سانتیگراد بدست آمد و در محیط کشت‌هایM199 و DMEM/F12 هیچ تکثیرسلولی مشاهده نشد.

 

 

سلول شبه فیبروبلاست

 

 

سلول شبه اپی­تلیال

 

شکل 5-سلول های حاصل از ساب کالچر اول (600  ×)


بحث

در این تحقیق برای کشت باله­دمی از تکه‌های بافتی (1 تا 2 میلی‌متر) بدون تیمار آنزیمی استفاده شد. در مورداستفاده از آنزیم برای تکه‌تکه کردن بافت قبل از کشت آن، بین محققین اختلاف‌نظر وجود دارد. اغلب محققین ابتدا بافت را به تکه‌های کوچکتر بریده، سپس بدون استفاده از آنزیم آنها را کشت دادند. این کار در مورد ماهی مداکا (30)، ماهی سیم سرطلاییSparusaurata (2 و 5) و ماهی  mahseerطلایی Tor putitora(47) انجام شد. برخی از محققین برای تکه­تکه نمودن بافت از آنزیم استفاده کردند (26 و 33). برخی از آنها ابتدا تکه‌های بافت را مورد تیمار آنزیمی قراردادند سپس سلول­های جداشده را کشت دادند (26 و 33)، استفاده از تکه‌های بافت نسبت به سوسپانسیون سلولی حاصل از تیمار آنزیمی دارای مزایایی نظیر سرعت و سهولت کار، امکان تعیین واکنش­های بین سلولی، حفظ شکل طبیعی و سالم ماندن سلول­ها است (3 و 46). گمان می‌رود تکه­های بافت از نظر ساختمانی شباهت بیشتری به اندام طبیعی دارد (39). در این تحقیق برای تکه­تکه کردن بافت باله از روش هضم آنزیمی نیز استفاده شد ولی از کشت آنها نتایج خوبی بدست نیامد.

علیرغم استفاده از محیط کشت­های M199، DMEM/F12 و L-15، تکثیر باله دمی فقط در محیط کشتL-15  مناسب بود و در سایر محیط­کشت­ها تکثیر سلولی مشاهده نشد. این موضوع باسایر مطالعات انجام‌شده (20 و 54) نیز سازگار می‌باشد. محیط­کشت یکی از متغیرترین پارامترها بین محققین است (59). چندین نوع محیط­کشت ازجملهL- 15 ،  DMEM/F12، MEM، DMEM و M199 برای کشت سلول­های مختلف ماهی­ها استفاده شده است. محیط­کشت DMEM/F12 برای کشت سلول­های پستانداران، پرندگان، خزندگان، دوزیستان و ماهیان استفاده می­شود (3 و 59). محیط­ کشت L-15 به‌جای بیکربنات ­سدیم دارای مقدار زیادی سدیم­ پیروات است و در صورت استفاده از این محیط کشت نیاز به افزودن گاز CO2 به محیط­ کشت نیست. تکثیر سلول­های چندین ماهی با استفاده از این محیط­کشت موفقیت‌آمیز بود (33، 39، 41 و50) و به عقیده برخی از محققین (35، 39 و50) این محیط­کشت بهترین محیط­کشت برای  رشد سلول­های ماهی است.

در این تحقیق زمانی که مقدار سرم جنین­گاو موجود در محیط­کشت از 10 به 20 درصد رسید میزان تکثیرسلولی بافت باله افزایش یافت و بیشترین میزان تکثیر سلولی باله­دمی زمانی محقق شد که 20 درصد حجم محیط­کشت سرم جنین­گاو بود. این سرم توسط اکثر محققین برای غنی­تر نمودن محیط­کشت استفاده می­شود زیرا دارای تعداد زیادی فاکتور رشد است (40). بجار و همکاران (5) و برادفورد (9) از 5 درصد سرم، فونتانا و همکاران (22) و جوزف و همکاران (31) از  15­درصد سرم، لاکرا و بونده (38) و زوو و همکاران (64) از 20 درصد سرم در محیط­کشت برای کشت سلول­های ماهی‌های مختلف استفاده کردند. معمولاً از غلظت بیش از 20 درصد سرم در محیط­کشت استفاده نمی­شود زیرا شواهدی وجود دارد که غلظت زیاد سرم در محیط­ کشت ممکن است از رشد سلول­ها جلو­گیری نماید (13 و 23). علاوه­بر رشد سلول‌ها سرم می­تواند نقش کلیدی در چسبیدن سلول‌ها به بستر و تکثیر آنها داشته باشد، نظیر آنچه در مورد تهیه رده­های سلولی تاسماهی­چینی (64) و تحقیق حاضر مشاهده شد. رشد خوب سلول‌ها بستگی به چسبندگی خوب سلول­ها به کف ظرف کشت دارد. چسبیدن سلول­ها به کف ظرف کشت اولین ضرورت موفقیت‌آمیز بودن کشت سلولی است. ازآنجایی‌که آغشته نمودن کف پلاستیکی ظرف کشت با فیبرونکتین باعث چسبندگی خوب سلول­ها به کف و تکثیر مناسب آنها می­گردد. بنابراین پوشاندن کف ظرف­کشت با سرم که دارای فیبرونکتین است به چسبیدن بهتر تکه­های بافت به کف ظرف­کشت کمک می­کند (48).

خطر آلودگی میکروبی یکی از مشکلات اصلی کشت سلول است. استفاده از ماهیان سالم و شستشوی بافت با اتانول قبل از جدا­سازی بافت از بدن به‌تنهایی کافی نیست. بااستفاده درست از آنتی­بویتیک­ها و ضدقارچ می‌توان مانع بروز آلودگی میکروبی شد (48). استفاده از دز زیاد این مواد نیز باعث تکثیر کم و یا توقف تکثیر سلول‌ها خواهد شد. در این تحقیق استفاده از پنی­سیلین پتاسیم­ جی (iu.ml-1 200)، استرپتومایسین­سولفات (μg.ml-1 200) و آمفوتریسین B (μg.ml-1 5) در ترکیب محیط­کشت برای از بین بردن آلودگی میکروبی مناسب بود. قبلاً نیز از پنی‌سیلین (iu.ml-1 1000)، استرپتومایسین سولفات (μg.ml-1 1000) و نیستاتین (mg.ml-1 5) برای کشت باله­دمی تاسماهی چینی (64)، از جنتامایسین (μg.ml-1 1000) و آمفوتریسین B (μg.ml-1 5/2) برای کشت باله دمی ماهی طلایی (44)، از پنی‌سیلین (iu.ml-1 1000) و استرپتومایسین سولفات (μg.ml-1 100) برای کشت باله دمی تاسماهی سیبری، تاسماهی سفید و فیلماهی (22)، از پنی­سیلین­سدیم ­جی (iu.ml-1  200)، استرپتومایسین سولفات (μg.ml-1 200) و آمفوتریسین B (μg.ml-1 50) برای کشت باله کپورماهی روهو (48)، از ضدقارچ (μg.ml-1 2/1) و جنتامایسین (μg.ml-1 50) برای کشت باله­ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان Oncorhynchus mykiss (17)، از پنی­سیلین­جی (iu.ml-1 10000)، استرپتومایسین­سولفات (mg.ml-1 10) و آمفوتریسین B ( mg.ml-125) برای کشت باله ماهی سیم­دریایی سر مخطط (5) و بالاخره از پنی­سیلین (iu.ml-1 100) و استرپتومایسین ( μg.ml-1100) برای کشت باله ماهی توربوت (18) استفاده شد.

در این مطالعه مشخص گردید استفاده از دمای 25 درجه­سانتیگراد به مدت 5/1 تا 2 ساعت برای چسبیدن تکه­های بافت باله به کف ظرف­کشت و دمای 22درجه سانتیگراد برای تکثیر یافتن سلول­های باله­دمی تاسماهی ایرانی مناسب بود. در آزمایش­های انجام‌شده طی این تحقیق مشاهده شد دمای بیش از 25 درجه سانتیگراد برای کشت سلول­های باله­دمی تاسماهی ایرانی مناسب نیست و مانع تکثیر سلول­های باله می­شود. برخی مطالعات هم نشان داد بیشترین میزان تکثیر رده­های سلولی ماهیان در دمای 20 تا 25 درجه­سانتیگراد انجام‌شده است (32 و 53) و دمای 35 تا 37 درجه­سانتیگراد برای بسیاری از رده­های سلولی ماهی­ها مهلک است (53). همچنین گزارش‌شده است اغلب رده­های سلولی بدست آمده از ماهیان سرد آبی در دمای 15 تا 20 درجه سانتیگراد تکثیر می‌یابند (21) و دمای بیش از20 درجه سانتیگراد برای کشت سلول­های ماهیان سرد آبی مناسب نیست و دمای 25 درجه سانتیگراد یک عامل بازدارنده تقسیمات سلولی ماهیان مذکور (21 و 60) می­باشد. بیشترین میزان تکثیر رده­ های سلولی ماهیان گرمابی نیز در دماهای 20 تا 25 درجه سانتیگراد (32 و 53)، 28 درجه سانتیگراد (36، 37 و50) و 32 درجه سانتیگراد (37) گزارش‌شده است. نتایج کسب‌شده در این تحقیق نشان داد باله­دمی تاسماهی ایرانی برای کشت مناسب است و در آینده می‌تواند به‌عنوان منبعی مناسب برای تهیه رده­های سلولی استفاده شوند. کشت باله اغلب در مورد باله­دمی انجام‌شده است (34 و 63) و این کار در مورد تعدادی از گونه‌ها انجام‌شده است (26، 31 و 63). زیرا سلول­های آن از پتانسیل بالای تکثیر برخوردارند و نمونه‌برداری از باله مذکور بدون آسیب رساندن و یا کشتن ماهی امکانپذیر است.

اولین سلول­هایی که از بافت باله به‌طرف محیط کشت مهاجرت کردند سلول­های شبه­ فیبروبلاست و شبه اپی­تلیال بودند، اما در مراحل بعدی کشت (ساب­کالچرها) تعداد سلول­های شبه­اپی­تلیال کاهش یافتند و تعداد سلول­های شبه­ فیبروبلاست بیشتر بود. غالب بودن تعداد سلول­های شبه فیبروبلاست بر سلول­های شبه اپی­تلیال در مورد سایر ماهیان نیز گزارش‌شده است (5، 14 و 37). فرش­نی (23) عنوان داشت برخی از پروتئین­های ترشح شده از پلاکت­های خون که در سرم جنین­گاو وجود دارد دارای اثر میتوژنی قوی بر سلول­های فیبروبلاست است ولی اثر بازدارنده در تکثیر سلول­های اپی­تلیال دارد (23). بنابراین باعث غالبیت سلول­های شبه­فیبروبلاست بر سلول­های شبه اپی­تلیال در ساب­کالچرها می­گردد. افزایش رقت محیط­کشت یا شستشوی سلول­ها با آب مقطر بجای محلول PBS نیز می‌تواند باعث لیز شدن و تخریب سلول­های شبه اپی­تلیال و درنتیجه غالب شدن تعداد سلول­های شبه فیبروبلاست در محیط کشت گردد (22). نتایج بدست آمده در این تحقیق نشان داد سلول­های شبه فیبروبلاست حاصل از کشت باله دمی تاسماهی ایرانی دارای توانمندی بالای تکثیر هستند و می­توانند مجدداً با موفقیت کشت داده شوند.

1- Akimenko, M. A., Mari-Beffa, M., Becerra, J., and Geraudie, J., 2003. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Developmental Dynamics, 226, PP: 190–201.
2- Alvarez, M. C., Otis, J., Amores, A., and Guise, K., 1991. Short term cell culture technique for obtaining chromosomes in marine and freshwater fish, Journal of Fish Biology, 39, PP: 817–824.
3- Avella, M., Berhaut, J., and Payan, P., 1994. Primary culture of gill epithelial cells from the sea bass Dicentrarchus labrux, In Vitro Cell and Developmental Biology, 30, PP: 41-49.
4- Babich, H., Rosenberg, D. W., and Borenfreund, E., 1991. In vitro cytotoxicity studies with the fish hepatoma cell line, PLHC-1 (Poeciliopsis lucida), Journal of Ecotoxicology Environmental Safety, 21, PP: 327−336.
5- Bejar, J., Borrego, J. J., and Alvarez, M. C., 1997. A continuous cell line from the cultured marine fish gilt-head sea bream Sparus aurata, Aquaculture, 150, PP: 143-153.
6- Bols, N. C., and Lee, L. E. J., 1991. Technology and uses of cell culture from tissues and organs of bony fish, Cytotechnology, 6 (3), PP: 163-187.
7- Bols, N. C., Brubacher, J. L., Ganassin, R. C., and Lee, L. E. J., 2001. Ecotoxicology and innate immunity in fish, Developmental & Comparative Immunology, 25 (8-9), PP: 853-873.
8- Bols, N. C., Dayeh, V. R., Lee, L. E. J., and Schirmer, K., 2005. Use of fish cell lines in the toxicology and ecotoxicology of fish, Piscine cell lines in environmental toxicology, In: Mommsen TP, Moon TW (Eds.), Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Vol 6. Environmental toxicology, Elsevier, Amsterdam, PP: 43−84.
9- Bradford, C. S., 1997. Characterization of cell cultures derived from Fugu, the Japanese Puffer fish. Molecular Marine Biology and Biotechnology,6 (4), PP: 279-288.
10- Butler, M., 2004. Animal Cell Culture and Technology,BIOS Scientific Publishers, Tylor & Francis Group, London and New York, 299 p.
11- Casiano, H., Choresca, J., kang, J. K., Han, J. E., Kim, J. H., Shin, S. P., Jun, J. W., Lee, B., C., and Park, S. C., 2012. Effect of storage media and time on fin explants culture in the goldfish Carassius auratus. African Journal of Biotechnology,11 (24), PP: 6599-6602. 
12- Castano, A., Bols, N. C., Braunbeck, T., Dierickx, P., Halder, M., Isomaa, B., Kawahara, K., Lee, L. E. J., Mothersill, C., Part, P., Repetto, G., Riego Sintes, J., Rufli, H., Smith, R., Wood, C., and Segner, H., 2003. The use of fish cells in ecotoxicology, Alternatives to Laboratory Animals, 31, PP: 317–351.
13- Chen, S. L., and Qin, Q. W., 2011. Theory and Technology of Fishes Cell Culture, Beijing Science Press, 289P.
14- Chi, S. C., Hu, W. W., and Lo, B. J., 1999. Establishment and characterization of a continuous cell line GF-I derived from grouper Epinephelus coioides (Hamilton): a cell line susceptible to grouper nervous necrosis virus GNNV, Journal of Fish Diseases, 22, PP: 173- 182.
15- Clem, L. W., Bly, J. E., Wilson, M., Chinchar, V. G., Stuge, T., Barker, K., Luft, C., Rycyzyn, M. Hogan, R.J., Van Lopik, T., and Miller, N.W., 1996. Fish immunology: the utility of immortalized lymphoid cells, a mini review, Veterinary Immunology and Immunopathology. 54, PP: 137-144.
16- Dong, C., Weng, S., Li, W., Li, X., Yi, Y., Liang, Q., and Gianguo, H., 2011. Characterization of a new cell line from caudal fin of koi, Cyprinus carpio koi and first isolation of cyprinid herpesvirus in China.Virus Research, 161, PP: 140-149.
17- Estepa, A., Frias, D., and Coll, J. M., 1993. In vitro susceptibility of rainbow trout fin cells to viral haemorrhagic septicaemia virus. Diseases of Aquatic Organisms, 15, PP: 35-39.
18- Fan, T. J., Ren, B. X., Geng, X. F., Yu, Q. T., and Wang, L. Y., 2010. Establishment of a turbot fin cell line and its susceptibility toturbot reddish body iridovirus. Cytotechnology, 62 (3), PP: 217-223.
19- Fent, K., 2001. Fish cell lines as versatile tools in ecotoxicology: assessment of cytotoxicity, cytochrome P4501A induction potential and estrogenic activity of chemicals and environmental samples. Toxicology In Vitro, 15, PP: 477-488.
20- Fernandez, R. D., Yoshimizu, M., Ezura, Y., and Kimura, T., 1993a. Comparative growth response of fish cell lines in different media, temperature and sodium chloride concentrations, Fish Pathology, 28, PP: 27-34.
21- Fernandez, R. D., Yoshimizu, M., Kimura, T., and Ezura, Y., 1993c. Establishment and characterization of seven continuous cell lines from freshwater fish, Journal of Aquatic Animal Health, 15 (2), PP: 137-147.
22- Fontana, F., Rossi, R., Lanfredi, M., Arlati, G., and Bronzi, P., 1997. Cytogenetic characterization of cell lines from three sturgeon species, Caryologia, 50 (1), PP: 91-95.
23- Freshney, R. I., 2000. Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, 4th edition, Wiley-Liss, JohnWiley and Sons, Inc, Publ, New York, 577 p.
24- Fryer, J., and Lannan, C., 1994. Three decades of fish cell culture: a current listing of cell lines derived from fishes. Methods in Cell Science, 16 (2), PP: 87-94.
25- Grunow, B., Noglick, S., Kruse, C., and Gebert, M., 2011. Isolation of cells from Atlantic sturgeon Acipenser oxyrinchusand optimization of culture conditions, Aquatic Biology, 14, PP: 67–75.
26- Hashimoto, H., Toyohara, H., Yokoyama, Y., Sakaguchi, M., Ozato, K., and Wakamatsu, Y., 1997. Effects of Carp serum on the growth of gold fish fin cells in early passage. Journal of Fish Biology,50, PP: 201–207.
27- Hightower, L. E., and Renfro, J.L., 1988. Recent applications of fish cell culture to biomedical research, Journal of Experimental Zoology, 248, PP: 290−302.
28- Holcik, J., 1989. The freshwater fishes of Europe, Vol I/II, General Introduction to fishes Acipenseriformes, Aula-Verlag Wiesbaden 468, PP: 342-362.
29- Iovine, M. K., 2007. Conserved mechanisms regulate outgrowth in zebra fish fins. Nature Chemical Biology, 3, PP: 613-618.
30- Ju, B., Pristyazhnyuk, I., Ladygina, T., Kinoshita, M., Ozato, K., and Wakamatsu, Y., 2003. Development and gene expression of nuclear transplants generated by transplantation of cultured cell nuclei into none-nucleated eggs in the medaka Oryzias latipes. Development, Growth & Differentiation, 45, PP: 167–174.
31- Joseph, M. A., Sushmitha, R. K., Mohan, C. V., and Shankar, K. M., 1998. Evaluation of tissues of Indian major carps for development of cell lines by explant method. Current Science, 75, PP: 1403-1406.
32- Kang, M. S., Oh, M. J., Kim, Y. J., Kawai, K., and Jung, S. J., 2003. Establishment and characterization of two new cell lines derived from founder, Paralichtys olivaceus (Temminck & Schlegel), Journal of Fish Diseases, 26, PP: 657- 665.
33- Komura, J. I., Mitani, H., and Shima, A., 1988. Fish cell culture: establishment of two fibroblast-like cell lines (OL-17 and OL-32) from fins of the medaka Oryzias latipes. In Vitro Cellular & Developmental Biology, 24, PP: 294–298.
34- Kondo, H., and Watabe, S., 2004. Temperature-dependent enhancement of cell proliferation and mRNA expression for type I collagen and HSP70 in primary cultured goldfish cells, Journal of Comparative Biochemistry and Physiology, 138 (2), PP: 221– 228.
35- Kumar, G. S., Singh, I. B. S., and Philip, R., 2001. Development of a cell culture system from the ovarian tissue of African catfish Clarius gariepinus, Aquaculture, 194, PP: 51-62.
36- Lai, Y. S., Murali, S., Ju, H. Y.,Wu, M. F., Guo, I. C., Chen, S. C., Fang, K., and Chang, C. Y., 2000. Two iridovirus susceptible cell lines established from kidney and liver of grouper, Epinephelus awoara (Temmick & Schlegeli), and partial characterization of grouper iridovirus, Journal of Fish Diseases, 23, PP: 379-388.
37-Lai, Y. S., John, J. A. C., Lin, C. H., Guo, I. C., Chen, S. C., Fang, K., Lin, C. H., and Chang, C. Y., 2003. Establishment of cell lines from a tropical grouper Epinephelus awoara (Temminck and Schlegel) and their susceptibility to grouper irido and noda viruses. Journal of Fish Diseases, 26, PP: 31-42.
38- Lakra, W. S., and Bhonde, R. R., 1996. Development of primary cell culture from the caudal fin of an Indian major carp Labeo rohita (Hamilton), Asian Fisheries Science, 9, PP: 149-152.
39- Lakra, W. S., Sivakumar, N., Goswami, M., and Bhonde, R., 2006. Development of two cell culture systems from Asian Seabass Lates calcarifer, Aquaculture Research, 37, PP: 18-24.
40- Lakra, W. S., Swaminathan, T. R., and Joy, K. P., 2011. Development, characterization, conservation and storage of fish cell lines, a review. Fish Physiology and Biochemistry, 37 (1), PP: 1-20.
41- Leibovitz, A., 1963. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. American Journal of Hygiene, 78, PP: 173-180.
42- Lester, k., 2007. Primary cell cultures from Cod Gadus morhua and Atlantic Halibut Hippoglossus. A thesis submitted in the fulfilment of the requirements of Stirling
University for the degree of Master of Philosophy, Stirling University In collaboration with Fisheries Research Services Aberdeen, 64 p.
43- Liu, T. M.,Yu, X. M., Ye, Y. Z., Zhou, J. F., Wang, Z. W., Tong, J. G., and Wu, C. J., 2002. Factors affecting the efficiency of somatic cell nuclear transplantation in the fish embryo, Journal Experimental Zoology, 293(7), PP: 719–725.
44- Mauger, P. E., LeBail, P. Y., and Labbé, C., 2006. Cryobanking of fish somatic cells, Optimizations of fin explant culture and fin cell cryopreservation, Comparative Biochemistry and Physiology, 144 (1), PP: 29-37.
45- Nowruzfashkhami, M. R., Safaiian, S., Bahmani, M., and Chubian, F., 2006. Karyotype analysis in ship sturgeon Acipenser nudiventris in the south Caspian Sea using leukocyte culture, Journal of Applied Ichthyology, 22, PP: 97–98.
46- Parkinson, E. K., and Yeudall, W. A., 1992. The epidermis, In: Culture of epithelial cells ed. Freshney RIWiley-Liss, New York, PP: 59-80.
47- Prasanna, I., Lakra, W. S., Ogale, S. N., and Bhonde, R.R., 2000. Cell culture from fin explant of endangered golden mahseer, Tor putitora (Hamilton), Current Science, 79 (1), PP: 93-98.
48- Rathore, G., Kumar, G., Swaminathan, T. R., Sood, N., Singh, V., Abidi, R., and Lakra, W.S., 2007. Primary cell culture from fin explants of Labeo rohita (Hamilton), Indian Journal of Fisheries. 54 (1), PP: 93-97.
49- Ryan, L. A., Seymour, C. B., O’Neill-Mehlenbacher, A., and Mothersill, C. E., 2008. Radiation- induced adaptive response in fish cell lines, Journal of Environmental Radioactivity, 99 (4), PP: 739–747.
50- Sathe, P. S., Basu, A., Mourya, D. T., Marathe, B. A., Gogate, S. S., and Banerjee, K., 1997. A cell line from the gill tissues of Indian cyprinoid Labeo rohita, In Vitro Cellular & Developmental Biology,33, PP: 425-427.
51- Schaeffer, W. I., 1990. Terminology associated with cell, tissue and organ culture, molecular biology and molecular genetics. In Vitro Cellular & Developmental Biology, 26, PP: 97−101.
52- Schirmer, K., 2006. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish, Toxicology, 224, PP: 163–183.
53- Tong, S. L., Li, H., and Miao, H. Z., 1997. The establishment and partial characterization of a continuous fish cell line FG-9307 from the gill of founder Paralichthys olivaceus. Aquaculture, 56, PP: 327-333.
54- Tung, L. C., Chen, S. N., and Kou, G. H., 1991. Three cell lines derived from spleen and kidney of black porgy Acanthopagrus schlegeli. Gyobyo Kenkyu (Fish pathology), 26 (3), PP: 109-117.
55- Villena, A. J., 2003. Application and needs of fish and shellfish cell culture for disease control in aquaculture, Reviews in Fish Biology Fisheries, 13, PP: 111–140.
56- Vishnyakova, K. S., Mugue, N. S., Zelenina, D. A., Mikodina, E. V., Kovaleva, O. A., Madan, G. V., and Yegorov, Y. E., 2009. Cell culture and karyotype of Sakhalin sturgeon Acipenser mikadoi, Membrane and Cell Biology, 3 (1), PP: 42-54.
57- Wang, X., Yang, J., Chen, X., and Pan, X., 2012. Establishment and characterization of fibroblast-like cell line from Anabarilius graham, Zoological Research,33, PP: E89-E97.
58- Wolf, K., and Quimby, M. C., 1962. Established eurythermic line of fish cells in vitro, Science, 135, PP: 1065-1066.
59- Wolf, K., and Quimby, M. C., 1969. Fish Cell and Tissue Culture In: Hoar WS, Randall DJ (Eds), Fish Physiology, volume III, Academic Press, New York, PP: 253-305.
60- Wolf, K., and Mann, J. A., 1980. Poikilotherm vertebrate cell lines and viruses a current listing for fishes. In Vitro, 16 (2), PP: 168-179.
61- Wolf, K., and Ahne, W., 1982. Fish Cell culture. In Advances in cell culture Vol. 2 (Ed.
Maramorosch K), New York Academic Press, PP: 305-328.
62- Wolf, K., 1988.Viral hemorrhagic septicemia. In:Fish viruses and fish viral diseases. Cornell University Press, Ithaca, NY, p 217-249.
63- Zhou, L. R., Deane, E. E., and Woo, N. Y. S., 2003. Development of a black sea bream fibroblast cell line and its potential use as an in vitro model for stress protein studies. Fish Physiology & Biochemistry. 29, PP: 255–262.
64- Zhou, G. Z., Gui, L., Li, Z., Yuan, X., and Zhang, Q., 2008. Establishment of a Chinese sturgeon Acipenser sinensis tail fin cell line and its susceptibility to frog iridovirus, Journal of Fish Biology, 73 (8), PP: 2058-2067.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 30، شماره 4
بهمن 1396
صفحه 483-494
  • تاریخ دریافت: 15 تیر 1395
  • تاریخ بازنگری: 30 آذر 1395
  • تاریخ پذیرش: 20 خرداد 1396