نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی جانوری، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه تبریز ، تبریز ، ایران

2 عضو هیات علمی دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز

3 گروه علوم پایه، دانشگاه فرهنگیان ، تهران ، ایران

چکیده

بیماری مالتیپل اسکلروزیس و نیز توکسین هایی مانند اتیدیوم بروماید موجب تخریب میلین نورون ها می‌شود. ویژگی‌های آنتی-اکسیدانی باکوپا مونرو در مطالعات قبلی گزارش شده است. هدف از این مطالعه بررسی تداخل اثر باکوپا مونرو و اتیدیوم بروماید بر حافظه فضایی و پراکسیداسیون لیپیدی در تشکیلات هیپوکامپ است. این مطالعه بر روی8 گروه 7‎ تایی موش‌های صحرایی نر صورت گرفته است. سه روز پس از تزریق اتیدیوم بروماید یا باکوپا مونرو و نیز ترکیب این داروها در ناحیه CA1 هیپوکامپ، آزمون ماز آبی موریس به منظور سنجش پارامترهای حافظه فضایی مورد استفاده قرار گرفت. سپس پارامتر پراکسیداسیون لیپیدی در این ناحیه سنجش گردید.‌ تزریق 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید 01/0 به ناحیه CA1 موجب کاهش پارامترهای مرتبط با حافظه فضایی)01/0>P ( و افزایش پراکسیداسیون لیپیدی شد)01/0>P‌(. همچنین بکارگیری دوز بی اثر 5 میکروگرم باکوپا مونرو بر رت، اثر ناشی از تزریق سه روزه اتیدیوم بروماید بر حافظه فضایی را متوقف )01/0>P و001/0>P ( و پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش داد)01/0>P‌(.‌ باکوپا مونرو با کاهش میزان پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از تزریق موضعی اتیدیوم بروماید، می‌تواند در بهبودی حافظه فضایی مؤثر باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

The effect of Bacopa monnieri on spatial memory impairment and lipid peroxidation induced by local injection of ethidium bromide in the hippocampus of rat.

نویسندگان [English]

  • Soda Aghayi Nojedeh 1
  • Homira Hatami Nemati 1
  • Mohammad Malek Ahmadi 1
  • Seyyed Mehdi Banan Khojasteh 2
  • Hatam Ahmadi 3

1 Department of Animal Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran

2 Department of Animal Biology, Faculty of Natural Sciences, University of Tabriz, Tabriz, Iran

3 Department of Basic Sciences, University of Farhangian, Tehran, I.R. of Iran

چکیده [English]

Multiple sclerosis, as well as toxins such as ethidium bromide, can damage the myelin of neurons. The antioxidant properties of Bacopa monnieri have been reported in previous studies. The aim of this study was to investigate the interaction of Bacopa monnieri and ethidium bromide on spatial memory and lipid peroxidation in the hippocampal formation. This study was performed on eight groups of seven-member male rats. Three days after injection of ethidium bromide or Bacopa monnieri, and also combination of these drugs in the CA1 region of the hippocampus, Morris Water Maze test was employed to measure spatial memory parameters. Then the lipid peroxidation parameter was measured in this region. bromide into the CA1 region Injection 3 μL of ethidium bromide 1% reduced the parameters related to spatial memory (P

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacopa monnieri
  • Ethidium Bromide
  • spatial memory
  • lipid peroxidation

اثر باکوپا مونرو براختلال حافظه فضایی و پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از تزریق موضعی اتیدیوم بروماید در هیپوکامپ موش صحرایی

سودا آقایی نوجه ده1، حمیرا حاتمی نعمتی1، محمد ملک احمدی2، سید مهدی بانان خجسته1 و حاتم احمدی3*

1 ایران، تبریز، دانشگاه تبریز، دانشکده علوم طبیعی، گروه زیست‌شناسی جانوری

2 ایران، تهران، کلینیک پارسه

3 ایران، تهران، دانشگاه فرهنگیان، گروه علوم پایه

تاریخ دریافت: 15/10/1398          تاریخ پذیرش: 13/5/1399

چکیده

بیماری مالتیپل اسکلروزیس و نیز توکسین­هایی مانند اتیدیوم بروماید موجب تخریب میلین نورون‌ها می­شود. ویژگی­های آنتی­اکسیدانی باکوپا مونرو در مطالعات قبلی گزارش شده است. هدف از این مطالعه بررسی تداخل اثر باکوپا مونرو و اتیدیوم بروماید بر حافظه فضایی و پراکسیداسیون لیپیدی در تشکیلات هیپوکامپ است. این مطالعه بر روی 8 گروه 7‎ تایی موش­های صحرایی نر صورت گرفته است. سه روز پس از تزریق اتیدیوم بروماید یا باکوپا مونرو و نیز ترکیب این داروها در ناحیه CA1 هیپوکامپ، آزمون ماز آبی موریس به‌منظور سنجش پارامترهای حافظه فضایی مورد استفاده قرارگرفت. سپس پارامتر پراکسیداسیون لیپیدی در این ناحیه سنجش گردید. تزریق 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید 01/0 به ناحیه CA1 موجب کاهش پارامترهای مرتبط با حافظه فضایی (01/0>P) و افزایش پراکسیداسیون لیپیدی شد (01/0>P). همچنین بکارگیری دوز بی‌اثر 5 میکروگرم باکوپا مونرو بر رت، اثر ناشی از تزریق سه روزه اتیدیوم بروماید بر حافظه فضایی را متوقف (01/0>P و001/0>P ) و پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش داد(01/0>P). باکوپا مونرو با کاهش میزان پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از تزریق موضعی اتیدیوم بروماید، می­تواند در بهبودی حافظه فضایی مؤثر باشد.

واژه‌های کلیدی: باکوپا مونرو، اتیدیوم بروماید، حافظه فضایی، پراکسیداسیون لیپیدی

*نویسنده مسئول، تلفن: 04134422924، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

تخریب میلین نورون­ها (دمیلیناسیون) در بیماری مالتیپل اسکلروزیس و شرایط دیگری مانند ایسکمی مغزی و در معرض سموم مختلف رخ می­دهد (18). مطالعات نشان داده است که استرس اکسیداتیو  به علت عدم تعادل بین تولید رادیکال‌های آزاد و مکانیسم­های آنتی­اکسیدانی درون‌زاد، احتمالاً نقشی کلیدی در مکانیسم آسیب بافتی بیماری­های دمیلیناسیون دستگاه عصبی مرکزی ایفا می‌کند (9). گزارش مربوط به بررسی پلاک‌های مالتیپل اسکلروزیس بیانگر افزایش پراکسیداسیون لیپید­ها می­باشد (13). تزریق مستقیم اتیدیوم بروماید ابزاری ساده برای القاء دژنراسیون سلول­های عصبی است و به پژوهشگران کمک می­کند تا فرایندهای دمیلیناسیون و ریمیلیناسیون را مطالعه کنند (5). این ماده با تولید رادیکال‌های آزاد و القاء استرس اکسیداتیو می­تواند موجب از بین رفتن آستروسیت­ها و اولیگودندروسیت­ها شده که وظیفه‌ی کنترل فرآیندهای دمیلیناسیون و رمیلیناسیون را بر عهده دارند و درنهایت موجب تضعیف سد خونی-مغزی و نیز دمیلیناسیون نورونی ‌شود (5). همچنین دمیلیناسیون سمی توسط اتیدیوم بروماید به طور معمول برای بررسی ظرفیت ترمیمی سیستم اعصاب مرکزی کاربرد دارد (19). مطالعات تصویربرداری عصبی نشان داده که آتروفی ناحیه­ی CA1 هیپوکامپ در اختلال حافظه­ی بیماران مبتلا به مالتیپل اسکاروزیس دخیل است (28). بیماری مالتیپل اسکلروزیس، موجب اختلال در حافظه بلندمدت و حافظه کاری می­شود (6 و 12). حساسیت و آسیب‌پذیری هیپوکامپ در مقایسه با دیگر نواحی مغزی، نسبت به محرک‌های تهدیدکننده و موتاژن همچون اتیدیوم بروماید بیشتر است (7).

باکوپا مونرو­(Bacopa monirea=BM) که با نام براهمی (Brahmi) هم نامیده می­شود و تشکیل‌دهنده اصلی داروهای گیاهی هند محسوب می­شود. باکوپا مونرو گیاه کوچک خزنده‌ای با شاخه‌های بسیار، برگهای دراز و کوچک و گلهای ارغوانی روشن از خانواده Scrophulariaceae است. ویژگی­های آنتی‌اکسیدانی آن به طور گسترده شناخته‌شده و در مطالعات قبلی به آن اشاره‌شده است (29). تجویز عصاره گیاه باکوپا مونری با برگرداندن سطوح آنزیم‌های آنتی­اکسیدانی به سطح نرمال و کاهش پراکسیداسیون لیپیدی موجب بهبودی استرس اکسیداتیو ناشی از ترکیباتی همچون دی هیدروژن پراکسید، سرب و سدیم نیتروپروساید می­شود (24). گزارش­های زیادی مبنی براثر عصاره این گیاه در بهبودی حافظه و گسترش دندریتیک نورونی در هیپوکامپ مغزی آمده است (21). آزمایشات بالینی مؤید اثر گیاه باکوپا مونرو در بهبود عملکرد حافظه‌ی افراد بالای 55 سال می­باشد (1و 9).

باتوجه به مطالعات پیشین مبنی بر اثرات مثبت و مفید آنتی­­اکسیدانها در درمان و بهبود علائم بیماری مالتیپل اسکلروزیس (8 و 9) و نیز گزارش­هایی مبنی بر اثرات حفاظتی باکوپا مونرو به‌عنوان یکی از قویترین آنتی‌اکسیدان‌ها، در مطالعه حاضر برای اولین بار اثر تزریق موضعی کوتاه‌مدت و بلند­مدت عصاره الکلی این گیاه بر حافظه فضایی مدل­های تجربی دمیلین شده ناشی از تزریق اتیدیوم بروماید بررسی گردید.

مواد و روشها

در این تحقیق از رت­های نر نژاد ویستار، تهیه‌شده از حیوان خانه‌ی پشمینه تبریز، در محدوده وزنی­50±200 گرم استفاده شد. به‌منظور کاهش استرس و عادت به شرایط آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری در دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز، جانوران به مدت دو هفته در گروههای 5‎ تایی در شرایط دمای ثابت محیطی (C°2±22) و تنظیم نور با دوره­ی تاریکی­-روشنایی­12ساعته (روشنایی از ساعت­ 7­صبح) نگهداری می­شدند. هنگام کار با رت­ها موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت می­شد. علت انتخاب موش­های نر، تداخل کمتر هورمون‌های جنسی با داروها بود.

وسایل و داروهای مورد استفاده: دستگاه استریوتاکسی مدل kopf جهت کانول­گذاری مغز حیوان، دستگاه اسپکتروفتومتری، داروی اتیدیوم بروماید (به‌منظور دمیلیناسیون) خریداری شده از شرکتSigma, St Louis, MO, USA))

برای تهیه عصاره از گیاه باکوپا مونرو با استفاده از حلال اتانولی، 100 گرم پودر برگ­های گیاه در یک لیتر اتانول 80 درصد به مدت 3 روز خیسانده شد. پس از صاف کردن محلول و حذف حلال تحت خلأ و در دمای C°50 تا 60 در دستگاه سوکسله، عصاره بدست آمده تا زمان استفاده در یخچال و در دمای 4 نگهداری شد. داروها بلافاصله قبل از آزمایش‌ها در محلول سالین استریل 9/0 درصد حل می‌شد.

برای بیهوش‌کردن رت­ها، تزریق درون صفاقی داروهای کتامین (mg/kg 100) و زایلزین (mg/kg5) متعلق به شرکت (Alfasan Chemical Co, Woerden, and Holland) با استفاده از سرنگ انسولینی صورت می­گرفت و بلافاصله در دستگاه استریوتاکسی قرار داده می‌شدند. با استفاده از اطلس پاکسینوس و واتسون مختصات مغز رت (25)، مشخصات ناحیه CA1 هیپوکامپ {8/3--AP= (قدامی- خلفی)، از خط وسط mm2/2+ ML=(میانی- جانبی)، از سطح جمجمه mm7/2+DV= (شکمی- پشتی)} به‌صورت یکطرفه را به‌دست آورده و کانول‌های راهنما باضخامت 23 گیج در ناحیه مذکور با دقت وارد می­شد، طوری که درست در سطح بالایی ناحیه CA1 قرار گیرد (شکل1). اطراف کانول­های روی استخوان جمجمه، ترکیب آکریل مخصوص دندانپزشکی و مونومر آن ریخته می‌شد، طوری که کانول­ها در بالای ماده آکریل جهت تزریق قابل دسترس باشد. در پنج تا هفتمین روز دوره بهبودی بعد از جراحی، موش‌ها آماده تزریق و آزمون بودند. برای تزریق دارو در روز اجرای آزمون از سر سوزن 27 گیج دندان‌پزشکی (شرکت سوپا، ایران) که طول آن mm2 بلندتر از کانول راهنما بوده و به لوله پلاستیکی متصل به سرنگ همیلتون 10 میکرولیتری بود استفاده می‌شد.

شکل1-جایگاه تقریبی محل کانول وارد شده به‌طرف چپ ناحیه CA1 هیپوکامپ

حجم تزریق برای تمام داروها در هر نوبت 3 میکرولیتر به مدت 3 دقیقه (1 میکرولیتر در هر دقیقه) بود. الگوی حجم تزریق و مدت‌زمان آن، بر پایه تحقیقات قبلی و نیز پاسخ دوزی دارویی بوده است (2و 10). تمام تزریق‌های دارویی در ناحیه CA1 هیپوکامپ صورت گرفت.

رت­ها در قالب 8 گروه آزمایشی7 تایی تقسیم شدند:گروه کنترل، که هیچ‌گونه تیماری اعمال نگردید.گروه آزمایشی شاهد که3 میکرولیتر سالین را در 3 دقیقه به مدت7 روز دریافت کردند. گروه­های آزمایشی که حجم 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید 01/0 را به مدت 3و7 روز دریافت کردند. گروه­های آزمایشی دیگر، که دوزهای­10و5 میکروگرم بر رت از عصاره الکلی باکوپا مونرو دریافت کردند. گروه آزمایشی آخر که یک هفته بعد از دریافت تک‌دوز 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید 01/0 به مدت 3 و یا 7 روز، دوز بی‌اثر 5 میکروگرم برای هر رت از عصاره الکلی باکوپا مونرو را دریافت کردند.

بررسی حافظه فضایی: سه روز پس از اتمام تیمار با دوزهای دارویی اتیدیوم بروماید یا عصاره الکلی باکوپا مونرو و نیز ترکیب آنها با همدیگر، به‌منظور سنجش پارامترهای مرتبط با حافظه فضایی، روش ماز آبی موریس مورد استفاده قرارگرفت. این دستگاه ساخت شرکت برج صنعت آزما از یک حوضچه استوانه‌ای­شکل سیاه‌رنگ با قطر 136 و ارتفاع 60 سانتی­متر تشکیل‌شده که تا ارتفاع 25 سانتی­متری از آب 2±25 درجه‌ی سانتی­گراد پر شده است. سکوی فلزی سیاه‌رنگ به قطر 10 سانتی‌متر به‌طور ثابت و به‌صورت قراردادی در مرکز ربع دایره جنوب غربی قرارگرفته است. به‌این‌ترتیب که هر موش به مدت 5 روز و هرروز در یک نوبت (هر نوبت شامل­4 تجربه) در دستگاه ماز آبی موریس تحت آزمایش قرار می­گرفت. پس از اتمام تجربه چهارم در هر نوبت، رت­ها از دستگاه خارج و خشک می­شدند. پارامترهای قابل اندازه‌گیری و مرتبط با حافظه فضایی در ماز آبی موریس عبارتند از : 1-زمان پیدا کردن سکو 2- مسافت طی شده برای پیدا کردن سکو، که این پارامترها به کمک دوربین نصب شده و نرم‌افزار Maze Router ثبت می­شد (3).

سنجش پراکسیداسیون لیپیدی: ابتدا موش‌ها با پنبه­ی آغشته به اتر بیهوش می­شدند و سر حیوان توسط گیوتین جدا و هیپوکامپ از مغز جدا شده و بلافاصله در نیتروژن مایع C°80-به‌صورت فریزر نگه‌داری می­شد. به‌منظور تهیه هموژن بافتی از هیپوکامپ، روی هریک از نمونه‌ها محلول سرد KCL 15% با نسبت (w/v­1:10) اضافه گردید. هموژن بافتی با استفاده از هموژنایزر مکانیکی تهیه شد. بعد از سانتریفیوژ کردن در دور RPM­3000 به مدت 10­دقیقه در دمای­ C°4، محلول شفاف رویی از رسوب زیرین جدا شد تا برای آنالیزهای بیوشیمیایی مورد استفاده قرار گیرد (2). مالون دی آلدئید(MDA) حاصل تجزیه پلی اسیدهای چرب غیراشباع است و اندازه‌گیری آن شاخصی از پراکسیداسیون لیپیدی است. اندازه‌گیری MDA در بافت هموژنیزه هیپوکامپ بر پایه واکنش با تیوباربیتوریک اسید و ایجاد TBARS (Thiobarbituric acid reactive substance) است، که جذب نوری آن در دستگاه اسپکترومتر در طول‌موجnm  532 تعیین گردید. نتایج به‌صورت نانومول درمیلی­گرم پروتئین بیان گردید (17).

به‌منظور تائید محل تزریق داروها، از هر گروه آزمایشی یک رتبه طور تصادفی انتخاب و توسط کلروفرم کشته می­شد، سپس مغز آن توسط دستگاه میکروتوم ویبرواسلایس برش داده می­شد و تصاویر این برش­ها با اطلس پاکسینوس و واتسون مقایسه می­شد (شکل1) .

مطالعات آماری: داده‌های به دست آمده در نرم‌افزار SPSS تجزیه‌وتحلیل آماری می­شد. از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه و آنالیز Post Hoc Tukey برای مقایسه اثرات دوزهای مختلف هر دارو با گروه کنترل و نیز اثرات برهم کنش بین داروها با گروه مربوطه استفاده می­شد. 05/0>P به‌عنوان تفاوت مقدار معنی‌دار گروه‌ها مورد ملاک قرار می­گرفت. رسم نمودارها با استفاده از از نرم‌افزار­Excel 2016 صورت می­گرفت.

نتایج

نتایج مربوط به حافظه فضایی: نمودار1و 2: تحلیل واریانس یکطرفه وpost hoc Tukey در روز پنجم آزمون ماز آبی موریس نشان داد که تزریق دوطرفه 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید01/0 به ناحیه CA1 هیپوکامپ مغزی باعث افزایش زمان یافتن سکو در دوره­های 3 روزه (05/0>P­ نمودار­1، طرف چپ) و 7 روزه( ­01/0>P، نمودار­1، طرف چپ) و نیز افزایش مسافت طی شده در دوره 7 روزه (01/0>P، نمودار2، طرف چپ) نسبت به گروه کنترل شد. نتایج نشان داد که تزریق 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید در ناحیه CA1 هیپوکامپ در دوره کوتاه مدت و بلندمدت موجب کاهش عملکرد حافظه فضایی موش­های صحرایی در ماز آبی موریس می­شود. دوزهای بکار رفته 5و10 میکروگرم بر رت از عصاره الکلی باکوپا مونرو تغییری معنی‌دار در زمان پیدا کردن سکو (نمودار1، وسط) و مسافت طی شده برای یافتن سکو در روز پنجم آزمایش ایجاد نکرد (نمودار2، وسط).

نمودار1- اثر تزریق اتیدیوم بروماید ، باکوپا مونرو و  برهم کنش آنها در ناحیه CA1 هیپوکامپ بر زمان سپری شده برای یافتن سکو در ماز آبی موریس در موش صحرایی نر. 01/0>P ** و 05/0>P * در مقایسه با گروه کنترل و 01/0>P ++ در مقایسه با گروه‌هایی که فقط اتیدیوم بروماید دریافت کردند.

نتایج مطالعه همچنین نشان داد که تزریق دوز بی‌اثر 5 میکروگرم برای هر رت از عصاره الکلی باکوپا مونرو موجب توقف اثر سه روزه حجم3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید بر زمان سپری شده ( 01/0>P، نمودار1، طرف راست) و نیز مسافت طی شده برای رسیدن به سکو شد­­ ( 001/0>P ، نمودار2­، طرف راست)، درصورتیکه تزریق دوز بی‌اثر 5 میکروگرم بر رت از عصاره الکلی باکوپا مونرو قادر به برگشت پاسخ اتیدیوم بروماید در دوره هفت‌روزه بر زمان سپری شده (نمودار1، طرف راست) و مسافت طی شده (نمودار2، طرف راست) برای یافتن سکو نشد. نتایج برهم­کنش داروها نشان می­دهد که تزریق دوز بی‌اثر باکوپا مونرو در ناحیه CA1 هیپوکامپ قادر به  بهبودی حافظه رت­های مسموم شده ناشی از مصرف اتیدیوم بروماید در مصرف کوتاه مدت می­شود.

نمودار2- اثر تزریق اتیدیوم بروماید، باکوپا مونرو و  برهم کنش آنها در ناحیه CA1 هیپوکامپ بر مسافت طی شده برای یافتن سکو در ماز آبی موریس در موش صحرایی نر. 01/0>P ** در مقایسه با گروه کنترل و 001/0>P +++ در مقایسه با گروهی که فقط اتیدیوم بروماید دریافت کردند

نتایج پراکسیداسیون لیپیدی: نمودار3- نشان می­دهد که مقدارTBARS (به‌عنوان شاخصی از پراکسیداسیون لیپیدی) گروه­های دریافت‌کننده 3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید01/0 در دوره کوتاه­مدت­3روزه (01/0>P) و بلندمدت 7 روزه (01/0>P) نسبت به گروه‌ کنترل تفاوت معنی­داری نشان می­دهد (نمودار3، طرف چپ). دوزهای10و5 میکروگرم بر رت عصاره‌ی الکلی باکوپا مونرو تغییری معنی­دار در TBARS ایجاد نکرد(نمودار3، وسط). همچنین تزریق دوز بی‌اثر 5 میکروگرم بر رت باکوپا مونرو قادر به برگشت پراکسیداسیون لیپیدی ناشی از تزریق ­3 میکرولیتر اتیدیوم بروماید در دوره کوتاه‌مدت3­روزه (01/0>P) و بلندمدت 7 روزه شد­(01/0>P) (نمودار3، طرف راست).

نمودار 3- اثر تزریق اتیدیوم بروماید، باکوپا مونرو و برهم کنش آنها در ناحیه CA1 هیپوکامپ بر میزان پراکسیداسیون لیپیدی (TBARS) در موش صحرایی نر. 01/0>P ** در مقایسه با گروه کنترل و 01/0>P ++ در مقایسه با گروههایی که فقط اتیدیوم بروماید دریافت کردند.

بحث و نتیجه­گیری

نتایج به‌ دست‌آمده از مطالعه حاضر نشان داد که تزریق اتیدیوم بروماید­(به‌عنوان عامل دمیلیناسیون) در ناحیه CA1 هیپوکامپ موش­های صحرائی نر بالغ منجر به پراکسیداسیون لیپیدی می­گردد. داده­های این پژوهش با نتایج تحقیقات قبلی همخوانی دارد. تزریق موضعی اتیدیوم بروماید در ناحیه CA1 هیپوکامپ رت­های نر، میزان آنزیم­های آنتی­اکسیدانی را کاهش می­دهد (3و 30). ممکن است کاهش فعالیت آنزیم­ها به علت استفاده بیش‌ازحد از آنزیم­های آنتی­اکسیدانی برای مقابله با رادیکال­های آزاد تولیدشده ناشی از تزریق اتیدیوم بروماید باشد (20). همچنین گزارش شده که اتیدیوم بروماید با افزایش MDA موجب افزایش میزان پراکسیداسیون لیپیدی می­شود (1). از دیگر عوارض ناشی از تزریق اتیدیوم بروماید در ناحیه ­CA1 هیپوکامپ در مطالعه حاضر، کاهش پارامترهای مرتبط با حافظه فضایی است. در گروه دریافت­کننده‌ی بلند­مدت اتیدیوم بروماید، زمان و مسافت لازم برای یافتن سکو افزایش یافت. همچنین اثر کوتاه مدت این دارو بر زمان یافتن سکو افزایشی بود. نتایج مطالعه حاضر بیانگر اثر نامناسب این ماده بر یادگیری، حافظه‌ی فضایی و نیز فعالیت حرکتی رت­ها است. تزریق اتیدیوم بروماید به ساقه مغزی رت­ها موجب دمیلیناسیون نورون­های این ناحیه و کاهش رفتار حرکتی آنها می­شود، طوری که این رت­ها در تست پیاده­روی شعاعی در محفظه آبی، قدم‌های کمتری نسبت به حیوانات دمیلینه نشده برداشتند (23). مطالعات متعددی ارتباط عوامل اکسیداتیو را به تخریب و تضعیف حافظه نشان داده‌اند (12). التهاب و همچنین استرس اکسیداتیو مغزی با اختلال در تثبیت حافظه در مدل تجربی انسفالومیلیت خود ایمن (EAE) بیماری مالتیپل اسکلروزیس مرتبط است (15).

همچنین نتایج به‌ دست‌آمده از مطالعه حاضر نشان داد که تزریق باکوپا مونرو در ناحیه CA1 هیپوکامپ بر حافظه فضایی و پراکسیداسیون لیپیدی اثری معنی‌دار ندارد. داده‌های این پژوهش با نتایج تحقیقات قبلی در برخی موارد همخوانی و در برخی موارد در تناقض است. گزارش شده که پراکسیداسیون لیپیدی در پری فرونتال و هیپوکامپ تحت تیمار با باکوپا مونرو مهار می‌شود (4). باکوپا مونرو با اثرات ضد پراکسیداسیون لیپیدی که اعمال می­کند، احتمالاً موجب بهبودی نقص شناختی می­شود (31). عدم همخوانی نتایج حاصل از تزریق باکوپا مونرو در این مطالعه با برخی از نتایج محققین قبلی ممکن است مربوط به دوز مصرفی، مدت‌زمان تجویز دارو و نیز نوع تیمار دارویی باشد.

در تحقیقات قبلی تاکنون تداخل اثر باکوپا مونرو با اتیدیوم بروماید بر روی حافظه فضایی و استرس اکسیداتیو یا پراکسیداسیون لیپیدی بررسی نشده است. اگرچه در مطالعات قبلی، تداخل اثر اتیدیوم بروماید با داروهای دیگر بررسی شده است. گزارش شده که تیمار بلندمدت با استفاده از ویتامینهای آنتی­اکسیدانی D3 و E، وسعت دمیلیناسیون القا شده با اتیدیوم بروماید در هیپوکامپ را به طور قابل‌توجهی کاهش می‌دهد (11). تزریق داخل صفاقی ویتامین آنتی اکسیدانی E به مدت یک هفته، مانع از افزایش محصولات پروکسیداسیون لیپیدی در نمونه­های سرم رت­های دمیلینه شده با سم اتیدیوم بروماید می‌گردد (10).  همچنین در برخی از مطالعات پیشین، اثر مفید اعمال باکوپا مونرو در تداخل با داروهای دیگر بررسی شده است. روند فراموشی القاء شده با دیازپام به طور قابل‌توجهی با باکوپا مونروی که به‌صورت خوراکی به موش داده شد بود، معکوس شد(27).گیاه باکوپا مونرو قادر به معکوس شدن فراموشی پیش­گرا و پس‌گرای ناشی از تجویز اسکوپولامین و بهبودی حافظه‌ی فضایی موش است (26). اختلال حافظه و مهارت یادگیری موش­های صحرایی ناشی از تزریق استرپتوزوتوسین در بطن‌های درون مغزی، به طور معنی‌داری با تجویز عصاره­ی گیاه باکوپا مونرو بهبود پیدا کرد (16). گیاه باکوپا مونرو در بهبود سمیت ناشی از دی فنیل اتر دکربناته (PBDE-209) در نوزادان و موش‌های ماده جوان نقش دارد (32). فعالیت آنزیمی کاتالاز (CAT)، سوپراکسیددسموتاز (SOD) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) به طور معنی‌داری در موش‌های دیابتی القاء شده با آلوکسون که با عصاره باکوپا مونرو تیمار شده بودند بهبود یافت (14). نتایج برهم کنش داروها در مطالعه حاضر نشان می­دهد که تزریق درون مغزی دوز بی‌اثر باکوپا مونرو در ناحیه CA1 هیپوکامپ، اگرچه موچب ترمیم پراکسیداسیون لیپیدی القاء شده ناشی از تزریق اتیدیوم بروماید 3 و 7 روزه در همین ناحیه شده است، اما صرفاً قادر به بهبودی حافظه رت­های مسموم شده ناشی از مصرف سه روزه اتیدیوم بروماید می­شود و قادر به توقف اثر نامناسب تزریق 7 روزه اتیدیوم بروماید روی حافظه فضایی نیست. به نظر می­رسد دامنه اثرات نامناسب تزریق 7 روزه اتیدیوم بروماید ممکن است موجب اختلال در دیگر مکانیسم‌های سلولی مرتبط با حافظه مانند تغییر در نوروترانسمیترهای مغزی و نیز آنزیم­های آنتی­اکسیدانی شده که تزریق باکوپا و ترمیم پراکسیداسیون لیپیدی در این مطالعه برای بهبودی حافظه کافی نبوده است.

نتایج حاصل از تداخل دارویی در این مطالعه نشان می­دهد که تزریق دوز بکار رفته باکوپا مونرو در ناحیه CA1 هیپوکامپ با مهار پراکسیداسیون لیپیدی و کاهش آسیبهای ایجاد شده توسط رادیکالهای آزاد در شرایط تخریب میلین نورونی، اثرات نامناسب ناشی از تزریق دوزهای بکار رفته سم اتیدیوم بروماید در این ناحیه را کاهش می­دهد، اما در بهبودی حافظه فضایی رت­های تیمار شده با تزریق اتیدیوم بروماید در دوره مصرفی کوتاه مدت مفید است و اثرات نامناسب تزریق بلندمدت اتیدیوم بروماید را روی حافظه تغییر نمی­دهد. جهت تائید نتایج مطالعه حاضر، پیشنهاد می­شود که برهم کنش اثر داروها در دیگر مناطق مغز­ی و نیز به‌صورت درون صفاقی بر  مقدار نوروترانسمیترهای دستگاه عصبی مرکزی و نیز تغییرات دندریت نورونی مورد بررسی قرارگیرد.

سپاسگزاری

مقاله حاضر حاصل طرح پایان‌نامه دوره کارشناسی ارشد می­باشد. از معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز بابت تأمین اعتبار لازم قدردانی می­گردد.

1- Abdel-salam, O. M. E., Khadrawy, Y. A., and Mohammed, N. A., 2012. Neuroprotective effect of nitric oxide.donor isosorbide-dinitrate against oxidative stress induced by ethidium bromide in rat brain, EXCLI Journal, 11, PP: 125-141.
3- Abdel- Sleem, O. M. E., Khadrawy, Y. A., and Salem, N. A., 2011. Oxidative stress in a model of demyelination in rat brain: the effect of piracetam and vinpocetine, Neurochemical Research, 36(6), PP: 1062-1072.
4- Bhattacharya, K., Bhattacharya, A., Kumar, A., and Ghosal, S., 2000. Antioxidant activity of Bacopa monniera in rat frontal cortex, striatum and hippocampus, Phytotherapy Research,14(3), PP: 174–179.
5- Bondan, E., Lallo, M., Trigueiro, A., Ribeir, C., Sinhorini, I., and Graça, D., 2006. Delayed Schwann cell and oligodendrocyte remyelination after ethidium bromide injection in the brainstem of Wistar rats submitted to streptozotocin diabetogenic treatment, Brazilian Journal of Medical & Biological Research, 39(5), PP: 637–646.    
6- Calabrese, C., Gregory, W. L., Leo, M., Kraemer, D., Bone, K., and Oken, B., 2008. Effects of a standardized bacopa monnieri extract on cognitive performance, anxiety, and depression  in the elderly: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial, The Journal of Alternative and Complementary Medicine, 14, PP: 707–713. 
7- Emeterio, E. P. S., Tramullas, M., and Hurlé, M. A., 2006. Modulation of apoptosis in the mouse brain after morphine treatments and morphine withdrawal, Journal of Neuroscience, 83(7), PP: 1352-1361.
8- Ghaffary, S., Hatami Nemati, H., and Dehghan, G., 2013. Protective effects of Short-term Administration of Saffron Extraction on Improvement of Cognitive Deficits and Decrement of Lipid Peroxidation Induced by Ethidium Bromide in Experimental Models of MS, Journal of Physiology and Pharmacology, 17(3), PP; 315-327.   
9- Gilgun-Sherki, Y., Melamed, E., and Offen, D., 2004. The role of oxidative stress in the pathogenesis of multiple sclerosis: the need for effective antioxidant therapy, Journal of Neurology, 251(3), PP:261-8.
10- Goudarzvand, M., Choopani, S., Shams, A., Javan, M., Khodaii, Z., and Ghamsari, F., et al.,  2016. Focal injection of ethidium bromide as a simple model to study cognitive deficit and its improvement. Basic and Clinical Neuroscience, 7(1), PP: 63–72.
11- Goudarzvand, M., Javan, M., Mirnajafi-Zadeh, J., Mozafari, S., and Tiraihi, T., 2010. Vitamins E and D3 attenuate demyelination and potentiate remyelination processes of hippocampal formation of rats following local injection of ethidium bromide, Cellular and Molecular Neurobiology, 30(2), PP: 289-299.
12- Guimarães, J., and Sá, M. J., 2012. Cognitive dysfunction in Multiple Sclerosis, Front in Neurology. 3(74), PP: 1-8.
13- Haider, L., Fischer, M. T., Frischer, J. M., Bauer, J., Höftberger, R., and Botond, G., 2011. Oxidative damage in multiple sclerosis lesions, Brain, 134, PP: 1914-24.
14- Kapoor, R., Srivastava, S., and Kakkar, P., 2009. Bacopa monnieri modulates antio responses in brain and kidney of diabetic rats. Environmental Toxicology and Pharmacology, 27, PP: 62–69.
15- Kim, D., Hao, J., Liu, R., Turner, G., Shi, F. D., and Rho, J. M., 2012. Inflammation-Mediated Memory Dysfunction and Effects of a Ketogenic Diet in a Murine Model of Multiple Sclerosis, Pharmacology, 667(1), PP:222-229.
16- Khan, M. B., Ahmad, M., Ahmad, S., Ishrat, T., Vaibhav, K., and Khuwaja, G., 2015. Bacopa monniera ameliorates cognitive impairment and neurodegeneration induced by intra-  cerebro-ventricular-streptozotocin in rat: behavioral, biochemical, immune-histochemical and histopathological evidences, Metabolic, Brain Discovery, 30, PP: 115–127.
17- Kuloghi, M., Ustundag, B., Atmaca, M, Canatan, H., Tezean, A. E, and Cinkiline, N., 2002. Lipid peroxidation and antioxidant enzyme levels in patients with schizophrenia and bipolar disorder, Cell Biochemistry, 20(2), PP: 171-175.
18- Lassmann, H., 2001. Classification of demyelinating diseases at the interface between etiology and pathogenesis, Current Opinion in Neurology,14, PP: 253-8.
19- Mazzanti, C. M., Spanevello, R., Ahmed, M., Schmatz, R., Mazzanti, A., and Salbego, F. Z., et al., 2007. Cyclosporine A inhibits acetylcholinesterase activity in rats experimentally demyelinated with ethidium bromide. International Journal of Development Neuroscience, 25(4), PP: 259-264.
20- Mitosek-Szewczyk, K., Gordon-Krajcer, W., Walendzik, P., and Stelmasiak, Z., 2010. Free radical peroxidation products in cerebrospinal fluid and serum of patients with multiple sclerosis after glucocorticoid therapy, Folia Neuropathologica, 48, PP:116-22.
21- Mohandas, K. G., Muddanna, S., and Gurumadhva, S., 2009. Enhancement of amygdaloid neuronal dendritic arborization by fresh leaf juice of Centella asiatica (Linn) during growth spurt period in rats, Evidence-Based Complementary and Alternative in Medicine, 6(2), PP: 203–210.
22- Morgan, A., Stevens, J., 2010. Does Bacopa monnieri improve memory performance in  older persons? Results of a randomized, placebo-controlled, double-blind trial, The Journal of Alternative and Complementary Medicine, 16, PP: 753–759.
23- Nassar, C. C. S., Bondan, E., and Alouche, S. R., 2009. Effects of aquatic exercises in a rat model of brainstem demyelination with ethidium bromide on the beam walking test, Arquivos  de Neuro-Psiquiatria, 67(3A), PP: 652-656.
 24- Pandareesh, M. D., Anand, T., and Bhat, P. V., 2014. Cytoprotective propensity of bacopa monniera against hydrogen peroxide induced oxidative damage in neuronal and lung epithelial cells, Cytotechnology, 68, PP: 157–172.
25- Paxinos, G., and Watson, C., 2005. The rat brain in stereotaxic coor­dinates: hard cover edition: Academic press.
26- Saraf, M. K., Prabhakar, S., Khanduja, K. L., and Anand, A., 2011. Bacopa monniera attenuates scopolamine-induced impairment of spatial memory in mice. Evidence- Based Complementary and Alternative in Medicin, 186, PP:38-48.
27- Saraf, M., Prabhakar, S., Pandhi., and Anand, A., 2008. Bacopa monniera ameliorates amnesic effects of diazepam qualifying behavioral–molecular partitioning. Neuroscience, 155, PP: 476–484.
28- Sicotte, N., Kern, K., Giesser, B., Arshanapalli, A., Schultz, A., and Montag, M., et al., 2008. Regional hippocampal atrophy in multiple sclerosis. Brain, 131(4), PP: 1134-1141.
29- Simpson, T., Pase, M., and Stough, C., 2015. Bacopa monnieri as an Antioxidant therapy to reduce oxidative stress in the baging Brain, Medicine, 21(36), PP: 1-9.
30- Spanevello, R., Mazzanti, C. M., Schmatz, R., Bagatini, M., Stefanello, N., and Correa, M., et al., 2009. Effect of vitamin E on ectonucleoti daseactivities in synaptosomes and platelets and parameters of oxidative stress in rats experimentally demyelinated, Brain research bulletin, 80(1), PP: 45-51. 
31- Vani, K. G., Balakrishna, K., and Devi, C. S. S., 2000. Effect of bacoside A on brain antioxidant, Anbarasi status in cigarette smoke exposed rats,” Life Sciences,78(12), PP: 1378–1384.
32- Verma, P., Singh, P., and Gandhi, B. S., 2014. Neuromodulatory role of bacopa monnieri on oxidative stress induced by postnatal exposure to decabromodiphenyl ether (pbde-209) in neonate and young female mice. Iranian Journal of Basic Medical Science, 17(4), PP: 307- 311.