نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشگاه محقق اردبیلی

2 عضو هیئت علمی گروه زیست شناسی، دانشکده علوم ، دانشگاه ارومیه

3 دانشگاه ارومیه، گروه زیست شناسی

4 عضو هیات علمی / دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه

5 پژوهشکده آرتمیا و آبزی پروری ، دانشگاه ارومیه

چکیده

در این تحقیق تاثیرات استفاده از پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از ضایعات موتوماهیان بر ظرفیت آنتی اکسیدانی کل، شاخص های اسپرمی، قطر لوله های منی ساز، ضخامت لایه اپیتلیوم و همچنین آسیب DNA در بافت بیضه رت های نر تیمار شده با سایمتیدین بررسی شد. تعداد 36 عدد رت نر نژاد ویستار سالم با وزن اولیه 40±200 گرم به 6 قفس منتقل شدند و به مدت 45 روز با تیمارهای غذایی (گروه C کنترل، گروه P 20 میلی گرم پپتید، گروه CIM40 و CIM120 به ترتیب 40 و 120 گرم سایمتیدین، گروه CIMP40 و CIMP120 به ترتیب 40 و 120 گرم سایمتیدین + 20 میلی گرم پپتید) تغذیه شدند. نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال و سایمتیدین طور معنی داری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی بیضه را نسبت به تیمار کنترل افزایش می دهد (P

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Protective effects of Bioactive peptides on testis tissue, sperm characteristics and suppression of oxidative stress in Cimetidine treated male rats

نویسندگان [English]

  • Ziba Ahmadi 1
  • Ebrahim H. Najdegerami 2
  • vahid Nejati 3
  • Gholamreza Najafi 4
  • Mehdi Nikoo 5

1 Department of Biology, University of Mohaghegh Ardabili

2 Department of BiologyFaculty of Science  Urmia University Urmia - Iran

3 Department of Biology, Urmia University

4 Department of basic science, faculty of veterinary

5 Artemia and aquaculture research institute, Urmia University

چکیده [English]

protective effects of bioactive peptides extracted from Anchovy wastes on total antioxidant capacity, sperm parameters, sperm tubular diameters, epithelium thickness (ET) and DNA damage in Cimetidine treated rats was investigated. Thirty-six healthy male rats (200±40) were randomly assigned to 6 cages and fed with experimental diets (Control, 20mg bioactive peptide P, 40 mg Cimetidine CIM40, 120 mg Cimetidine CIM40, CIM40+P, CIM120+P) for 45 days. The results showed that the rat fed on Cimetidine treatments and Cimetidine + peptide had significant higher TAC then the control (P

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioactive peptides
  • Cimetidine
  • anchovy
  • Infertility
  • oxidative Stress

اثر حفاظتی پپتیدهای زیست فعال بر شاخص‏های بافتی بیضه و اسپرماتوژنز در رت های نر تیمار شده با سایمتیدین

زیبا احمدی1، ابراهیم حسین نجدگرامی1*، وحید نجاتی1، غلامرضا نجفی2 و مهدی نیکو3

1 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی

2 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، دانشکده علوم، گروه علوم پایه

3 ایران، ارومیه، دانشگاه ارومیه، پژوهشکده آرتمیا و آبزی پروری

تاریخ دریافت: 25/08/1399          تاریخ پذیرش: 09/09/1399

چکیده

براساس تحقیقات انجام شده، مصرف طولانی مدت این دارو با افزایش استرس اکسیداتیو، باعث ناباروری می­شود. در این تحقیق تأثیرات استفاده از پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از ضایعات موتوماهیان بر ظرفیت آنتی اکسیدانی کل، شاخص­های اسپرمی، قطر لوله­های منی ساز و همچنین ضخامت لایه اپیتلیوم در بافت بیضه رت­های نر تیمار شده با سایمتیدین بررسی شد. تعداد 36 عدد رت نر نژاد ویستار سالم با وزن اولیه 40±200 گرم به 6 قفس منتقل شدند و به مدت 45 روز با تیمارهای غذایی (گروه C کنترل، گروه P20 میلی گرم پپتید، گروه CIM40 و CIM120 به ترتیب 40 و 120 گرم سایمتیدین، گروه CIMP40 و CIMP120 به ترتیب 40 و 120 گرم سایمتیدین + 20 میلی گرم پپتید) تغذیه شدند. نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال و سایمتیدین طور معنی داری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی بیضه را نسبت به تیمار کنترل افزایش می دهد (05/0P<). همچنین براساس این نتایج، کاهش معنی­دار در زنده مانی اسپرم و ضخامت لایه اپیتلیوم در رت هایی که از پپتیدهای زیست فعال و تیمارهای CIM40 و CIM120 استفاده کرده بودند مشاهده شد که با تیمار کنترل اختلاف معنی دار داشتند (05/0P<). براساس این نتایج استفاده از پپتیدهای زیست فعال همراه با سایمتدین میزان این شاخصها را افزایش داد که با تیمار کنترل اختلاف معنی دار نداشتند (05/0P>). به نظر می­رسد باتوجه به تأثیرات آنتی اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال که در تحقیقات قبلی گزارش شده بود، این مواد تأثیرات اکسیداتیو سایمتیدین را در بافت بیضه و همچنین اسپرمها تعدیل کرده است.

واژه­های کلیدی: پپتیدهای زیست فعال، موتوماهیان، ناباروری، استرس اکسیداتیو

* نویسنده مسئول، تلفن:  04431942119 ، پست الکترونیکی: [email protected]

مقدمه

 

شرایط استرس زای زندگی امروزی به همراه تغذیه نامناسب و عدم وجود مواد مناسب در مواد غذایی مصرفی، باعث انواع بیماری های گوارشی و قلبی- عروقی شده که یکی از این بیماری ها زخم معده است که در اثر ترشح بیش از حد اسید معده و در اثر عواملی مانند سوء تغذیه، استرس زیاد، استفاده مکرر از مسکن­ها و استفاده از داروهای ضدالتهابی غیراستروئیدی ایجاد می شود (29). برای درمان این عارضه از روش­های مختلف استفاده می‍شود که از آن جمله می­توان به استفاده از داروی سایمتیدین (Cimetidine) اشاره کرد. این دارو به طور قابل توجهی مانع ترشح اسید معده ناشی از غذا، هیستامین، پنتاگاسترین، کافئین و انسولین می­شود. اما مصرف مداوم آن دارای عوارض جانبی از جمله از دست دادن میل جنسی و بی اختیاری (26)، افزایش سطح FSH و کاهش تستوسترون (14)، کاهش وزن بیضه (9)، از دست دادن سلول­های بنیادی توسط فرایند آپوپتوز (15)، و مرگ سلول های Peritubular myoid می شود (21). تمامی موارد فوق الذکر، توان افزایش ریسک ناباروری را دارند. محققان برای کاهش تأثیرات استرس اکسیداتیو ناشی از مصرف سایمتیدین، از آنتی­اکسیدانهای طبیعی مانند انواع ویتامینها (C, E) و سایر مواد طبیعی استفاده می کنند (19، 20 و 24). اخیراً در برخی از تحقیقات استفاده از مواد پروتئینی آبکافت شده طبیعی (Hydrolysate protein) یا پپتیدهای زیست فعال (Bioactive peptides) در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از برخی داروها گزارش شده است. پپتیدهای زیست فعال معمولاً دارای 2 تا 20 اسیدآمینه با وزن مولکولی 200 تا 1800 دالتون هستند که در اثر هیدرولیز آنزیمی و یا تخمیر میکروبی از مواد پروتئینی مانند شیر، سویا و سایر ضایعات پروتئینی تولید می شوند (13 و 32). در کنار ارزش غذایی، اثرات شبه هورمونی و فیزیولوژیکی این مواد در بدن گزارش شده است که این اثرات بستگی به ترکیب و قرارگیری اسید آمینه در موقعیت N- و C- ترمینال، طول زنجیره پپتید، نوع بار اسیدهای آمینه تشکیل دهنده­ی پپتید و خصوصیات آبگریز / هیدروفیل زنجیره آنها دارد (23). از جمله اثرات پپتیدهای زیست فعال می­توان به تأثیرات ضد فشار خون، آنتی اکسیدان، ضد سرطان، ضد میکروبی، همچنین تعدیل کننده­ی سیستم ایمنی و کاهنده کلسترول اشاره کرد (6، 16 و 29). متأسفانه با توجه به مرور منابع، رفرنسی که در رابطه با تأثیرات پپتیدهای زیست فعال در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از سایمتیدین باشد یافت نشد. ولی با توجه به تأثیرات سایر آنتی اکسیدانت های طبیعی مانند ویتامین ها و ... به برخی از نتایج آنها اشاره می شود. النیلی و همکاران در سال2010 تأثیر استفاده از شیره­ی گیاه Nigella sativa به همراه سایمتیدین را بر روی سیستم تولیدمثلی موش رت نر بررسی کردند و نتایج نشان داد که شیره ی این گیاه به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی آسیب‍های ناشی از سمیت مصرف طولانی مدت سایمتیدین بر تولید مثل جنس نر را بهبود بخشد و باعث بهبود میزان قطر لوله های اسپرماتوزنز و ضخامت لایه ی اپیتلیوم و پارامترهای اسپرمی از جمله تحرک اسپرم ها می‍شود. بلترام و همکاران در سال 2011 تأثیر ویتامین B12 را بر سایمتیدین در سیستم تولیدمثلی رت نر بررسی کردند و نتایج نشان دادکه مکمل ویتامین B12 قادر به تحریک اسپرماتوژنز و احیای تعداد سلولهای سرتولی و طبیعی شدن اندازه ی لوله های اسپرماتوژنز و بهبود پارامترهای اسپرمی از جمله تحرک و زنده مانی اسپرم ها نسبت به تیمارهای سایمتیدین بود و اثرات مخرب سایمتیدین را بر ضخامت لایه اپیتلیوم کم می کند. آپریوکو و همکاران در سال 2014 تأثیر ویتامین  Cرا به عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی بر روی اثرات مخرب سایمتیدین بر بیضه در موش صحرایی را بررسی کردند و نتایج آنها نشان داد که سایمتیدین بطور وابسته به دوز باعث کاهش معنی دار در تعداد و حرکت و زنده مانی اسپرم­ها می شود. همچنین نتایج نشان داد که سایمتیدین باعث تغییرات معنی­دار در بافت شناسی بیضه و کاهش معنی دار ضخامت اپیتلیوم لوله های سمینی فر و کاهش بلوغ سلول­های اسپرماتوژنیک و میزان فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی از جمله ظرفیت آنتی اکسیدانی تام (TAC) می شود ویتامین C باعث بهبود اختلال در عملکرد و شکل لوله­های اسپرماتوژنز و افزایش تعداد و حرکت اسپرم­ها و بهبود فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی می­شود. همچنین بلترام و همکاران در سال 2017، تأثیرات ویتامین B12 در تعدیل تأثیرات منفی داروی سایمتیدین را بر روی فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی از جمله ظرفیت آنتی اکسیدانی تام (TAC) و تعداد اسپرمها، اسپرماتوسیت، تعداد سلول های ژرمینه (Germinal cells) بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد که رابطه معنی داری بین ویتامین B12 و بهبود پارامتر های اسپرم از جمله زنده مانی و تعداد و حرکت اسپرم­ها، اسپرماتوژنز و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی و حفظ عملکرد طبیعی اسپرم در مردان در مقایسه با تیمارهای سایمتیدین وجود دارد. باتوجه به توضیحات داده شده در خصوص القای استرس اکسیداتیو بوسیله سایمتیدین و همچنین تأثیرات آنتی اکسیدانی پپتیدهای زیست فعال که در مطالعات پیشین گزارش شده است، این مطالعه با هدف بررسی تأثیرات استفاده از سایمتیدین و تأثیرات تعدیل کنندگی ناشی از آن بوسیله پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از ضایعات موتو ماهیان، طراحی و اجرا شد.

مواد و روشها

تعداد 36 عدد رت نر نژاد ویستار سالم با وزن اولیه 40± 200گرم از خانه حیوانات گروه زیست شناسی دانشگاه ارومیه برای انجام تحقیق به 6 قفس مربوطه منتقل شدند. رت ها در طول مدت آزمایش، در درجه حرارت 25 درجه سانتیگراد و رژیم نوری 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با جیره استاندارد تغذیه شدند. بعد از دو هفته آداپتاسیون با شرایط آزمایش به شش گروه آزمایشی تقسیم و با تیمارهای تغذیه ای به صورت دهانی به مدت 45 روز تغذیه شدند. تیمارهای آزمایشی به شرح زیر بودند: گروه C کنترل، گروهP 20 میلی گرم پپتید به ازای هر کیلوگرم بدن، گروههای CIM40 و CIM120 به ترتیب 40 و 120 میلی گرم سایمتیدین به ازای هر کیلوگرم بدن، گروه CIMP40 و CIMP120 به ترتیب 40 و 120 میلی گرم سایمتیدین + 20 میلی گرم پپتید به ازای هر کیلوگرم بدن.

برای تهیه پپتیدهای زیست فعال، از سس تخمیری مهیاوه که از فروشگاه­های محلی در بندر عباس خریداری شده بود استفاده شد. نمونه تهیه شده در آزمایشگاه با استفاده از خشک کن انجمادی خشک شد. قبل از آنالیز، عصاره پپتیدی از طریق حل نمودن 1 قسمت پودر خشک شده با 5 قسمت آب مقطر تهیه و مخلوط حاصل در حمام آبی با دمای 30 درجه سانتی­گراد به مدت یک ساعت ونیم توسط هم زن الکتریکی بهم زده شد. در انتها، مخلوط به هم زده شده در دور g1000 برای مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی­گراد سانتریفیوژ گردید. سوپرناتانت های حاصل سپس با یکدیگر جمع و توسط کاغذ واتمن فیلتر گردیده تا عصاره پپتیدی شفافی حاصل گردد. عصاره پپتیدی سپس با استفاده از خشک کن انجمادی خشک گردیده و در دمای 18- درجه سانتی گراد برای استفاده­های بعدی نگهداری شد. مقدار پروتئین عصاره پپتیدی به روش بیورت با استفاده از آلبومین سرم گاوی (BSA) تعیین گردید (18).

پپتیدهای زیست فعال تهیه شده با روش فوق، در غلظت 20 میلی گرم در کیلوگرم وزن بدن موش روزانه در 1 میلی لیتر آب مقطر حل شده و از طریق گاواژ وارد دستگاه گوارشی رت­ها می شد. سایمتیدین مورد استفاده در این تحقیق از شرکت دارویی داروپخش تهیه شد و بعد از حل کردن در آب مقطر حاوی 5/0 درصد کربوکسی متیل سلولز سدیم (CMC= Sodium carboxymethyl cellulose) به صورت روزانه از طریق گاواژ در موشها مورد استفاده قرار می­گرفت (3). لازم به ذکر است که در گروه کنترل به جای سایر مواد مورد استفاده، آب مقطر حاوی 5/0 درصد CMC گاواژ شد.

جهت تعیین دوز دارو و پپتید، رت­ها دوبار در هفته وزن کشی می شدند. بعد از اتمام دوره تیمار، موش­ها با کلروفرم آسان کشی شدند و بیضه­ها با رعایت شرایط استریل از داخل شکم خارج گردید. برای اینکار، پوست ناحیه شکمی رت­ها توسط الکل اتانول 70 درصد استریل و سپس در ناحیه شکم برشی ایجاد شد. بعد از جدا کردن بافت های همبندی اطراف، بیضه ها از بدن خارج شدند و دم اپیدیدیم بیضه ها به داخل محیط کشت  mR1ECM جهت ارزیابی پارامترهای اسپرمی انتقال داده شد. در نهایت بیضه ی چپ رت ها جهت تثبیت و کارهای بافتی به محلول فرمالین 10 درصد منتقل گشت.

از کیت سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی تام (Navand Salamat,Urmia,Iran) برای بررسی ظرفیت آنتی اکسیدانی تام (Total antioxidant capacity) استفاده شد. این کیت، ظرفیت آنتی اکسیدانی بیومولکول­ها را، در نمونه های مختلف، براساس توانایی احیاءکنندگی آهن دو ظرفیتی و با مکانیسم انتقال الکترون اندازه گیری می کند. مقدار 20 میکرولیتر از نمونه یا محلول استاندارد را با یک میلی­لیتر از محلول کار آماده شده مخلوط شد و پس از انجام ورتکس، در زمان ­های صفر و 4 دقیقه در طول موج 593 نانومتر در مقابل بلانک قرائت شد. و براساس پروتکل کیت دریافتی میزان TAC گزارش شد.

برای اندازه گیری قطر لوله های اسپرمی(STD) در بیضه و همچنین ضخامت لایه اپیتلیوم (ET)، نمونه های بافتی به مدت 10-7 روز در محلول فرمالین قرارداده شدند. پس از تثبیت نمونه ها مراحل مختلف پاساژ بافتی انجام داده شد. برای بررسی خصوصیات فیزیکی اجزاء سلولی و ارتباطات بافت­ها، برش­های مورد نظر با هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند. اما قبل از انجام رنگ آمیزی پارافین از مقطع روی اسلاید برداشته شده برای این منظور و آبدهی به بافت­ها، اسلاید ها به ترتیب از محلول های مربوطه عبور داده شدند و برای ارزیابی قطر لوله های منی ساز و همچنین ضخامت لایه اپیتلیوم از روش Soudamani در سال 2005 استفاده شد.

جهت تعیین درصد تحرک اسپرم ها، یک قطره از اسپرم های موجود در محیط کشت بر روی لام میکروسکوپی قرار داده شد و 10 میدان دید میکروسکوپی با درشت نمایی 400 برابر مورد بررسی قرارگرفت. سپس میانگین کل اسپرم­های متحرک در این 10 میدان دید به عنوان درصد تحرک ثبت گردید (28). برای ارزیابی درصد اسپرم های زنده، از رنگ آمیزی ائوزین-نگروزین استفاده شد و درصد اسپرم های زنده (بی رنگ) و مرده (نارنجی تا قرمز) براساس متد Wyrobek و همکاران در سال 1983 محاسبه گردید.

محاسبات آماری: برای مقایسه داده های حاصل از تیمارها در انتهای دوره با تیمار کنترل، از آنالیز واریانس یک طرفه (One-way ANOVA) برای داده های اندازه گیری شده و تست کروسکال والیس برای داده های شمارشی استفاده شد. قبل از اعمال تست­های مذکور ابتدا داده ها از نظر نرمال بودن (تست Kolmogorov–Smirnov) و همگنی واریانسها (test Levene) بررسی شدند. برای رسم گرافها از نرم افزارExcell  نسخه 2013 و برای بررسی تغییرات آماری در تیمارهای آزمایشی از نرم افزار آماری SPSS نسخه 21 استفاده شد.

نتایج

نمودار 1 نتایج بررسی ظرفیت کل آنتی اکسیدانی در بیضه­ها را نشان می دهد. براساس این نتایج استفاده از ترکیب پپتیدهای زیست فعال با سایمتیدین به طور معنی داری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی تام را در مقایسه با تیمار کنترل افزایش می دهد (05/0P<). همچنین این نتایج نشان داد که استفاده از سایمتیدین  به صورت مجرا در هر دو غلظت باعث افزایش معنی دار ظرفیت تام آنتی اکسیدانی نسبت به تیمار کنترل می شود (05/0P<).

 

 

نمودار 1- تأثیرات استفاده از سایمتیدین و پپتیدهای زیست فعال بر ظرفیت تام آنتی اکسیدانی در رت های نر نژاد ویستار

* نشان دهنده اختلاف معنی دار با تیمار کنترل در سطح اطمینان 95 درصد است

 

نمودار 2 تأثیرات استفاده از تیمارهای غذایی بر شاخصهای اسپرمی را در مقایسه با تیمار کنترل نشان می دهد. براساس نتایج به دست آمده استفاده از سایمتیدین و همچنین پپتیدهای زیست فعال به صورت مجزا باعث کاهش معنی دار زنده مانی اسپرمها نسبت به تیمار کنترل در رت های نر شد (05/0P<). در حالیکه استفاده از پپتیدهای زیست فعال همراه با سایمتیدین باعث افزیش معنی دار زنده مانی اسپرمها نسبت به تیمارهای سایمتیدین می شود (05/0P<). همچنین نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال به صورت مجزا و سایمتیدین در غلظت 40 میلی گرم باعث افزایش معنی دار تحرک اسپرمها می شود (05/0P<). در حالیکه استفاده همزمان از سایمتیدین با پپتیدها و همچنین غلظت بالای آن تأثیر معنی دار منفی بر تحرک اسپرمها نمی­گذارد.

 

 

نمودار 2- تأثیرات استفاده از سایمتیدین و پپتیدهای زیست فعال بر شاخصهای اسپرمی در رت های نر نژاد ویستار

* نشان دهنده اختلاف معنی دار با تیمار کنترل در سطح اطمینان 95 درصد است

 

نمودار 3، نتایج تاثیرات پپتیدهای زیست فعال به همراه سایمتیدین و بطور مجزا بر شاخصهای بافتی بیضه و مقایسه این تیمارها با تیمار کنترل را نشان می دهد. براساس این نتایج، غلظتهای متفاوت سایمتیدین و همچنین پپتیدهای زیست فعال به طور معنی داری میزان شاخص STD را در بافت بیضه را، نسبت به تیمار کنترل کاهش دادند (05/0P<). همچنین بر اساس این نتایج تغذیه با تیمارهای مجزای پپتیدهای زیست فعال و همچنین سایمتیدین میزان ET را به طور معنی داری نسبت به تیمار کنترل کاهش داد (05/0P<). در حالیکه استفاده از پپتیدهای زیست فعال در تیمارهای سایمتدین میزان این شاخص را به طور معنی داری نسبت به تیمارهای سامتیدین افزایش داد (05/0P<).

 

 

نمودار 3- تأثیرات استفاده از سایمتیدین و پپتیدهای زیست فعال بر قطر لوله های اسپرماتوژنز (STD) (راست) و ضخامت لایه اپیتلیوم (ET) (چپ) در رت های نر نژاد ویستار (* نشان دهنده اختلاف معنی دار با تیمار کنترل در سطح اطمینان 95 درصد است)

 

شکل1- مقطع عرضی بافت بیضه در گروه های کنترل (A)، پپتیدزیست فعال (B)، سایمتیدین40 (C)، سایمتیدین120 (D) سایمتیدین40+پپتید (E)، سایمتیدین120 +پپتید (F)- (رنگ آمیزی H&E، بزرگنمایی10´)

 

 

شکل2- تصاویر مربوط به رنگ آمیزی ائوزین-نگروزین جهت ارزیابی زنده مانی اسپرم- اسپرم مرده (DS)، اسپرم زنده (LS)- (بزرگنمایی1000´).

بحث

امروزه برای کاهش یا تعدیل تأثیرات سوء داروهایی مانند سایمتیدین بر شاخصهای تولیدمثلی، از آنتی اکسیدانتهای طبیعی مانند ویتامین B12 (11)، ویتامین C (26) و میکروالمنتهایی مانند روی و سلنیوم (17) استفاده می کنند.

امروزه به تبع افزایش مصرف غذاهای دریایی، استفاده از پپتیدهای زیست فعال با منشأ دریایی به عنوان یک فراورده مهم و یک آنتی اکسیدانت طبیعی در تحقیقات مختلف گزارش شده است. این فراورده ها از نظر ساختاری از 2 تا 22 اسید آمینه تشکیل شده اند برخی از این اسیدهای آمینه مانند تریپتوفان، تیروزین، متیونین، سیستئین، هیستامین و فنیل آلانین دارای خواص بالای آنتی اکسیدانی و فعالیت تمیز کنندگی (Scavenging activity) می­باشند (10 و 23). بنابراین وجود خاصیت احیاء کنندگی و دارا بودن اسیدهای آمینه آنتی اکسیدانی میتواند ظرفیت مقابله با استرس را در بدن جانداران افزایش دهد. تأثیرات آنتی اکسیدانی پپتیدهای مورد استفاده در این تحقیق در کاهش رادیکالهای آزاد در رت های تحت استرس بی حرکتی (1) و رت های تحت تیمار با آنتی بیوتیک افلوکساسین (2) به اثبات رسیده است.

در مطالعه­ی حاضر نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال به همراه داروی سایمتیدین در هر دو غلظت مورد مطالعه باعث افزایش معنی­دار میزان فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی تام (TAC) شد که نشان دهنده تأثیرات آنتی اکسیدانی این پپتیدها در کاهش اثرات مضر داروی سایمتیدین می باشد. طبق تحقیقات صورت گرفته توسط حیدری و همکاران در سال 1396 که در مورد تأثیرات پپتیدهای زیست فعال بر روی فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی کبد در رت های نر تحت استرس بی­حرکتی انجام شد نتایج آنها نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال باعث افزایش سطح TAC می شود. همچنین استفاده از پپتیدهای زیست فعال باعث بهبود تنش اکسیداتیو ناشی از استرس بی حرکتی شد و سیستم ایمنی را نیز در کبد تقویت نمود. طبق نتایج بلترام و همکاران در سال 2017، استفاده از ویتامین B12 می تواند اختلال در آنزیم های آنتی اکسیدانی بیضه ناشی از مصرف سایمتیدین از جمله افزایش سطح MDA و کاهش میزان فعالیت آنزیم های TACو CAT را بهبود ببخشد. نتایج این تحقیق با نتایج مطالعات بلترام و همکاران (2017) و حیدری و همکاران (1396) در خصوص کاهش تأثیرات سوء سایمتیدین و کاهش این اثرات بوسیله آنتی اکسیدانهای طبیعی همخوانی دارد. همچنین نتایج تحقیقات نشان داد که به طور عجیبی استفاده از غلظت بالای این دارو باعث افزایش معنی­دار در ظرفیت آنتی اکسیدانی تام می شود. به نظر می رسد غلظت بالای این ماده با تأثیر و مصرف کامل آنزیم های متابولیزه کننده کبدی، باعث کاهش ماده موثره سایمتیدین در خون و در نتیجه تأثیرات سوء کمتر در برخی از ارگانها از جمله بیضه می شود که نیاز به بررسی های بیشتر دارد.

النیلیو همکاران در سال2010 تأثیر استفاده از شیره ی گیاه سیاه دانه (Nigella sativa) به همراه سایمتیدین را بر روی سیستم تولید مثلی موش رت نر بررسی کردند و نتایج نشان داد که شیره ی این گیاه به عنوان یک آنتی اکسیدانت طبیعی آسیب های ناشی از سمیت مصرف طولانی مدت این دارو را بر تولید مثل جنس نر بهبود می دهد و باعث افزایش قطر لوله های اسپرماتوژنز (STD) و ضخامت لایه ی اپیتلیوم (ET) و پارامتر های اسپرمی از جمله تحرک اسپرم ها می شود. همچنین بلترام و همکاران در سال 2011 تاثیر ویتامین B12 را بر سایمتیدین در سیستم تولید مثلی رت نر بررسی کردند و نتایج نشان داد که مکمل ویتامین B12 قادر به تحریک اسپرماتوژنز، احیای تعداد سلولهای سرتولی، طبیعی شدن اندازه ی لوله های اسپرماتوژنز و بهبود پارامترهای اسپرمی از جمله تحرک و زنده مانی اسپرم ها نسبت به تیمارهای سایمتیدین می‍شود. همچنین نتایج آنها نشان داد که استفاده از این شیره گیاهی اثرات مخرب سایمتیدین بر ضخامت لایه اپیتلیوم را کم می‍کند. همچنین آپریوکو و همکاران در سال 2014 تأثیر ویتامین  Cبه عنوان یک آنتی اکسیدان طبیعی را روی اثرات مخرب سایمتیدین بر بیضه در موش صحرایی را بررسی کرد و نتایج آنها نشان داد که سایمتیدین بطور وابسته به دوز باعث کاهش معنی دار در تعداد و حرکت و زنده مانی اسپرم ها می شود. براساس این نتایج، مصرف ویتامین C باعث افزایش تعداد و حرکت اسپرم­ها می شود. آنووامنو همکاران در سال 2019 تأثیر عصاره ی استون (C. Longa) را برسمیت ناشی از سایمتیدین بر محور هیپوفیز-بیضه بررسی کردن و نتایج تحقیق آنها نشان داد که این عصاره بخاطر داشتن خاصیت آنتی اکسیدانی خود توانست سمیت شیمیایی ناشی از مصرف داروی سایمتیدین را برطرف سازد و میزان شاخص های اسپرمی از جمله حرکت اسپرم های بالغ را بهبود ببخشد. نتایج این مطالعه نشان داد که تیمار با داروی سایمتیدین به مدت 45 روز متوالی باعث اختلال در میزان شاخص های اسپرمی از جمله زنده مانی و حرکت اسپرمهای بالغ می شود. بر اساس این نتایج، در تیمارهایی که از پپتیدهای زیست فعال استفاده شده بود میزان شاخصهای فوق الذکر بهبود یافته بودند که نشان دهنده تأثیرات آنتی اکسیدانی این مواد در کاهش اثرات سوء سایمتیدین بر شاخصهای اسپرمی بود. نتایج این تحقیق با نتایج مطالعات النیلی و همکاران (2010)، بلترام  و همکاران (2011)، آپریوکو و همکاران (2014) و آنووامن و همکاران (2019) در خصوص کاهش تأثیرات سوء سایمتیدین بوسیله ی آنتی اکسیدانت های طبیعی همخوانی دارد.

طبق نتایج آزمایشات آپریوکو و همکاران در سال 2014، سایمتیدین باعث تغییرات معنی دار در بافت شناسی بیضه و کاهش معنی دار ضخامت اپیتلیوم لوله های سمینی فر و کاهش بلوغ سلول های اسپرماتوژنیک می شود و ویتامین C باعث بهبود اختلال در عملکرد و شکل لوله های اسپرماتوزنز می شود. همچنین براساس نتایج بلترام و همکاران در سال 2017، ویتامین B12 می تواند آسیب های بافتی بیضه ناشی از مصرف سایمتیدین از جمله افزایش قطر، فضای حفره لومن و کاهش سلول های سرتولی و دیگر شاخص های بافتی را بهبود ببخشد. السعد در سال 2018 تغییرات میکروسکوپیک و فوق ساختاری ناشی از سایمتیدین و اثر ویتامین B12 به عنوان یک عامل محافظ در بیضه های موش را مورد ارزیابی قرارداد. نتایج در تیمارهای آزمایشی با سایمتیدین همراه با ویتامین B12 به مدت 52 روز افزایش قابل توجهی در قطر لوله های منی ساز را نشان داد و حاکی از این بود که ویتامین B12 دارای اثر محافظتی علیه اثرات مخرب سایمتیدین بر شاخص های بافتی است. در مطالعه ی حاضر نتایج نشان داد که استفاده از پپتیدهای زیست فعال به همراه سایمتیدین باعث افزایش معنی دار قطر لوله های منی ساز (STD) و ضخامت لایه اپیتلیوم (ET) نسب به تیمار هایی که از این ماده استفاده نکرده اند می شود. به نظر می رسد پپتیدهای زیست فعال با استفاده از خاصیت آنتی اکسیدانی خود که در مطالعات قبلی به اثبات رسیده است رادیکالهای آزاد حاصل از عملکرد سایمتیدین در بیضه را تعدیل و شرایط را برای عملکرد مناسب سلولهای منی ساز فراهم کرده اند. نتایج این تحقیق با مطالعات پیشین (9، 13 و 18) در خصوص تأثیرات مثبت سایر آنتی اکسیدانت های طبیعی بر شاخصهای بافتی بیضه همخوانی دارد.

نتایج این تحقیق نشان داد که پپتیدهای زیست فعال استخراج شده از سس ساروغ که در جنوب کشور به عنوان یک فراورده غذایی مورد استفاده قرار می گیرد می تواند تا حدودی تأثیرات منفی ناشی از مصرف سایمتیدین را بر بافت بیضه و همچنین شاخصهای اسپرمی کاهش دهد و توان باروری در رت های نر را با توجه به نتایج این تحقیق افزایش دهد. تحقیقات بیشتر در مورد مکانیسم های دقیق این تأثیرات در پژوهشهای آینده مورد تاکید است.

1 - حیدری، ش.، حسین نجدگرامی، ا.، و نیکو، م.، 1395. تأثیر مخلوط پپتیدهای زیست فعال ماهی ساردین بر ظرفیت آنتی اکسیدانی سرم، پراکسیداسیون چربی­ها و فراسنجه های خونی در موش های بزرگ آزمایشگاهی ویستار تحت استرس بی حرکتی، مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)، جلد30، شماره 3، صفحه 288-279.
2 - زارع، ز.، حسین نجدگرامی، ا.، و نیکو، م.، 1398، بررسی تأثیرات پپتیدهای زیست فعال بر آنزیم های آنتی اکسیدانی بیضه و سمیت تولید مثلی حاصل از آنتی بیوتیک افلوکساسین در رت نر، پایان نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه ارومیه، صفحه 409-399.
3- Abd-Allah, A. R. A., & Aly, H. (2000). Adverse testicular effects of some quinolone members in rats. Pharmacological research, 41(2), 211-219.
4-Al-Nailey, KG Ch . (2010). Study of the protective effect of Nigella sativa against Cimetidine induced reproductive toxicity in male mice. Al-Qadisiyah Journal of Veterinary Medicine Sciences, 9, 55-62.
5-Aprioku, J., Ibeachu, C., & Ijeomah, M. (2014). Protective Effect Of Ascorbic Acid On Cimetidine-Induced Reproductive Toxicity In Male Wistar Rats. Journal of Pharmacology and Toxicology, 9(1), 46-54.  
6-Arihara, K. (2006). Functional properties of bioactive peptides derived from meat proteins. Advanced technologies for meat processing, 245-274.
7-Beltrame, F. L., & Sasso-Cerri, E. (2011). Vitamin B12 supplement exerts a beneficial effect on the seminiferous epithelium of cimetidine-treated rats. Cells Tissues Organs.193
8-Beltrame, F. L., & Sasso-Cerri, E. (2017). Vitamin B12-induced spermatogenesis recovery in cimetidine-treated rats: effect on the spermatogonia number and sperm concentration. Asian journal of andrology, 19(5), 567.  
9-Chung, K. W., Dressler, J. B., Halterman, M. W., & Allison, J. E. (1984). Structural and functional abnormality of ectopic testes in rats. Life Sciences, 34(20), 1953-1957.
10-Davalos, & Miguel. (2004). Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis. Journal of Food Protection, 67, 1939-1944.
11-Ebadimanas, & Najafi. (2017). Protective effects if royal jellly on the histomorphologic oxidative stress and sperm parameters in Ofloxacin treated rat. Comparative clinical pathology.
12-Elsaed, W. M., Bedeer, R. F., & Eladl, M. A. (2018). Ameliorative effect of vitamin B12 on seminiferous epithelium of cimetidine-treated rats: a histopathological, immunohistochemical and ultrastructural study. Anatomy & cell biology, 51(1), 52-61.
13-Erdmann, K., Cheung, B. W., & Schröder, H. (2008). The possible roles of food-derived bioactive peptides in reducing the risk of cardiovascular disease. The Journal of nutritional biochemistry, 19(10), 643-654.
14-Fawcett, D. W., Neaves, W. B., & Flores, M. N. (1973). Comparative observations on intertubular lymphatics and the organization of the interstitial tissue of the mammalian testis. Biology of reproduction, 9(5), 500-532.
15-Franca, L. R., Parreira, G. G., Gates, R. J., & Russell, L. D. (1998). Hormonal regulation of spermatogenesis in the hypophysectomized rat: quantitation of germ‐cell population and effect of elimination of residual testosterone after long‐term hypophysectomy. Journal of Andrology, 19(3), 335-340.
16-Giri, A., & Ohshima, T. (2012). Bioactive marine peptides: Nutraceutical value and novel approaches Advances in food and nutrition research (Vol. 65, pp. 73-105): Elsevier.
17-Goel, A., Dani, V., & Dhawan, D. (2005). Protective effects of zinc on lipid peroxidation, antioxidant enzymes and hepatic histoarchitecture in chlorpyrifos-induced toxicity. Chemico-Biological Interactions, 156(2-3), 131-140.
18-Gornal, A., Bardawill, C., & David, M. (1949). Protein–Biuret colorimetric method. J. Biol. Chem, 177, 751.
19-Hajihashemil. (2017). effects ofcobalamin (vitamin B12) on gentamicin induced nephrotoxicity in rat. Drug research(stuttg), 67, 710.
20-Khajehei. (2009). Randomised double-blind trial of the effect of vitamin C on dyspareunia and vaginal discharge in women receiving doxycycline and triple sulfa for chlamydial cervicitis. Australian and New Zealand Journal of Obstetrics and Gynaecology, 49, 525.
21- Kurohmaru, M., Hikim, A. P. S., Mayerhofer, A., Bartke, A., and Russell, L. D., 1990. Golden hamster myoid cells during active and inactive states of spermatogenesis: correlation of testosterone levels with structure, American Journal of Anatomy, 188(3), PP: 319-327.
22-Lassoued, I., Mora, L., Nasri, R., Jridi, M., Toldrá, F., Aristoy, M. C., & Nasri, M. (2015). Characterization and comparative assessment of antioxidant and ACE inhibitory activities of thornback ray gelatin hydrolysates. Journal of functional foods, 13, 225-238.
23-Li, Y., & Yu, J. (2015). Research progress in structure-activity relationship of bioactive peptides. Journal of medicinal food, 18(2), 147-156.
24-Manali, P. (2011). Evaluation of vitamin E and N-acetyl cysteine in gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Renal Failure, 10, 1171-1188.
25-Onwuemene1, N., Eseigbe Imafidon, CH., Oladele Ayoka1, A., 2019. Curcuma longa normalized cimetidine‐induced pituitary‐testicular dysfunction: Relevance in nutraceutical therapy. Animal Model Exp Med, 2, 191-200.
26-Raji, Y., Kunle-Alabi, O. T., Olaleye, S., Gbadegesin, M., Awobajo, F., Osonuga, O., Odukanimi, A., Salami, S., Bolarinwa, A. F. (2007). Impact of α-tocopherol on metronidazole and tetracycline-induced alterations in reproductive activities of male albino rats. J Bio Sci, 7(1), 41-46.
27-Russell, L. D., Ettlin, R. A., Hikim, A. P. S., & Clegg, E. D. (1993). Histological and histopathological evaluation of the testis. International journal of andrology, 16(1), 83-83.
28-Selvakumar, E., Prahalathan, C., Sudharsan, P. T., & Varalakshmi, P. (2006). Chemoprotective effect of lipoic acid against cyclophosphamide-induced changes in the rat sperm. Toxicology, 217(1), 71-78.
29-Shahidi, F., & Zhong, Y. (2008). Bioactive peptides. Journal of AOAC International, 91(4), 914-931.
30-Shuai, W., Yong-rui, B., Yun-Peng, D., Xian-Sheng, M., & Ting-Guo, K. (2011). Evaluation of gastric ulcer model based on gray-scale image analysis. African Journal of Microbiology Research, 5(11), 1285-1290.
31-Soudamani, S., Malini, T., & Balasubramanian, K. (2005). Effects of streptozotocin-diabetes and insulin replacement on the epididymis of prepubertal rats: histological and histomorphometric studies. Endocrine research, 31(2), 81-98.
32-Taheri A, S. F. K., Jacobsen C, Baron CP. (2014). Antioxidant activities and functional properties of protein and peptide fraction isolated from salted herring brin. Food Chemistry., 142, 318-326.
33-Wyrobek, A. J., Gordon, L. A., Burkhart, J. G., Francis, M. W., Kapp Jr, R. W., Letz, G., Malling, H. V., Tophan, J. C.,  Whorton, M. D. (1983). An evaluation of the mouse sperm morphology test and other sperm tests in nonhuman mammals: A report of the US Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, 115(1), 1-72.