بررسی اثر هم افزایی عصاره Artemisia absinthium و Taxol روی سلول های سرطانی معده (رده سلولی AGS) و تغییرات سطح بیان ژن های آپوپتوزی و متاستازی

فیروزه فروغی¹، جواد بهارآرا ^1،2* و خدیجه نژاد شاهرخ آبادی¹

¹ ایران، مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد، گروه زیست شناسی

² ایران، مشهد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد، مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری

تاریخ دریافت: 20/3/1400            تاریخ پذیرش:24/6/1400

چکیده

سرطان معده دومین علّت مرگ ناشی از سرطان در جهان به شمار می­رود. Artemisia absinthium از گونه­های مهم گیاهان جنس Artemisia است که دارای خواص ضد التهابی و ضد ویروسی می­باشد. در مطالعه حاضر توانایی عصاره متانولی A. absinthium به تنهایی و در ترکیب با تاکسول بر روی القای آپوپتوز و مهار مهاجرت سلولی در رده سلولی AGS (دودمان سرطان معده انسانی) بررسی شده است. برای بررسی اثر سیتوتوکسیک کاربرد توأم عصاره A. absinthium با تاکسول بر روی تکثیر سلول­های AGS از آزمون MTT استفاده شد؛ جهت بررسی آپوپتوز در سلول­های تحت تیمار از رنگ آمیزی DAPI و آنالیز فلوسایتومری و برای بررسی اثر ضد تهاجمی از تست مهاجرت سلولی استفاده شد؛ تغییرات در میزان بیان ژن­های آپوپتوزی "p53 – Caspase-3,9" و متاستازی "MMP-2,9" با تکنیک Real-time PCR بررسی شد. داده­های کمی حاصل توسط آزمون آماری "ANOVA" در سطح معنی داری "p< 0.05" تحلیل گردید. نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که ترکیب عصاره A. absinthium با تاکسول تکثیر سلول­های سرطانی AGS را به صورت وابسته به غلظت مهار می­کند، مشاهدات مورفولوژیک حاصل از روش DAPI و نتایج فلوسایتومتری نشان دهنده افزایش درصد سلول­های آپوپتوتیک در گروه­های تیماری بود؛ نتایج تست مهاجرت سلولی کاهش پتانسیل تهاجمی سلول­های AGS را نشان داد. نتایج Real-time PCR بیان­گر افزایش بیان ژن­های آپوپتوزی و کاهش ژن­های متاستازی در گروه­های تیماری (p< 0.05) بود. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که کاربرد توأم عصاره A. absinthium با تاکسول، تکثیر سلول­های رده AGS را مهار می­کند و باعث القای آپوپتوز و مهار توانایی مهاجرت در این سلول­ها می­شود.

واژه­های کلیدی: سرطان معده؛ Artemisia absinthium؛ تاکسول؛ آپوپتوز؛ متاستاز

* نویسنده مسئول، تلفن:  05138437092 ، پست الکترونیکی: baharara78@gmail.com

مقدمه

مسیرهای سلولی و مولکولی در انواع مختلف سرطان ها متفاوت هستند، امّا همه انواع سرطان دارای ویژگی های مشابه می باشند، که به عنوان نشانه های اصلی سرطان شناخته می شوند؛ سلول های سرطانی توانایی متاستاز، آنژیوژنز (رگ زایی)، تهاجم و حمله به سلول ها و بافت های مجاور را دارند؛ این سلول ها سیگنال های رشد را به صورت خود مختار تولید می کنند و به آن ها پاسخ می دهند و از طرفی به سیگنال های مهاری و آپوپتوتیک رسیده به سلول سرطانی پاسخ نمی دهند؛ این عملکرد در سلول های سرطانی منجر به رشد نا محدود و تکثیر بی رویه سلول ها می شود (12). این ویژگی های منحصر به فرد سلول های سرطانی باعث پخش شدن سلول ها در سراسر بدن و آسیب رساندن به بافت ها و دشوارتر شدن روند درمان می شوند (12). بعد از بیماری های قلبی-عروقی، سرطان دومین علّت اصلی مرگ و میر در سراسر جهان است و در ایران نیز سومین عامل مرگ و میر به حساب می آید (4 و 5)؛ همچنین تخمین زده می شود در سال 2035 تعداد موارد گزارش ابتلا به سرطان، در حدود 70درصد افزایش داشته باشد (3).

در شرایط پاتولوژیک، به ویژه سرطان، سلول ها توانایی خود را برای مرگ ناشی از آپوپتوز از دست می دهند که این امر منجر به تکثیر بی رویه سلول های سرطانی می شود؛ سلول های سرطانی غالباً دارای بیان بیش از حد بسیاری از پروتئین هایی هستند که نقش مهمی در مقاومت در برابر فعال شدن آبشار آپوپتوتیک دارند، مکانیسم های مختلف باعث می شود سلول ها از مرگ برنامه ریزی شده سلولی فرار کنند و در مقابل مولکول های ضد آپوپتوزی را بیش از حد بیان کنند (18). در نتیجه امروزه بسیاری از استراتژی های درمانی بر اساس راه اندازی مجدد مرگ سلولی برنامه ریزی شده یا آپوپتوز در سلول های سرطانی استوار است (6).

متاستاز فرآیندی است که در طی آن سلول های سرطانی از تومور اولیه منتشر شده و در محل دیگری غیر از محل تومور اولیه رشد می کنند؛ جابه جایی سلول های سرطانی به قسمت های دیگر بدن (متاستاز)، دلیل اصلی مرگ و میرهای ناشی از سرطان (حدود 90درصدِ مرگ ناشی از سرطان) است (18). متاستاز شامل مراحل جدایی، مهاجرت، تهاجم و چسبندگی است و توسط مسیرهای مختلف سیگنالینگ تنظیم شده و تحت تأثیر ماتریکس خارج سلولی اطراف قرار دارد؛ جهش های ایجاد شده در سلول های سرطانی می توانند، فعالیت آنزیم های دخیل در تهاجم و مولکول های درگیر در اتصالات سلول به سلول و سلول به ماده زمینه ای خارج سلولی را تغییر دهند، که این امر به سلول های سرطانی این امکان را می دهد که بتوانند از مکان اولیه خود حرکت کرده و به سایر نقاط بدن مهاجرت کنند (18).

سرطان معده یک بیماری با علّت پیچیده است که شامل تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی متعدد است؛ در حال حاضر شواهدی وجود دارد که جهش در تعدادی از ژن ها با افزایش خطر ابتلا به سرطان معده مرتبط است؛ سرطان معده در جهان به عنوان چهارمین سرطان شایع و دومین عامل مرگ و میر ناشی از ابتلا به سرطان شناخته شده است (4 و 5)؛ این سرطان اولین عامل مرگ و میر ناشی از سرطان در ایران می باشد؛ سرطان معده بیشترین بروز را در مردان و سومین رتبه را در میان زنان پس از سرطان های سینه و کولون (روده بزرگ) دارد (4). با وجود پیدایش تکنیک های پیشرفته در عمل های جراحی سرطان معده، هنوز هم سرطانی کُشنده و خطرناک به حساب می آید، حدود ٩٠درصد از تومورهای معده بدخیم می باشند؛ همچنین این نوع سرطان مقاومت بالایی نسبت به داروهای شیمی­درمانی ایجاد می کند، در نتیجه استراتژی­های درمانی مؤثر واقع نمی­شوند و نتایج مورد انتظار بالینی حاصل نمی­شوند (16).

تاکسول از رایج ترین داروهای مورد استفاده در شیمی درمانی می باشد؛ تاکسول (با نام عمومی پاکلیتاکسل) یک ترکیب دی ترپنی با ساختاری پیچیده می باشد، که فعالیت ضد توموری قابل توجهی دارد؛ تاکسول یک ترکیب ضد سرطانی با منشاء گیاهی می باشد که از پوست درخت سرخدار با نام علمی"Taxus berevitolia. L" به دست می آید (1). تاکسول از دپلیمریزه شدن میکروتوبول ها جلوگیری می کند در نتیجه باعث می شود که تجمعات توبولین به صورت یک ساختار پایدار درآیند که باعث ایجاد ثبات در میکروتوبول ها و ناکارآمدی آن ها می شود، که این امر در نهایت باعث توقف چرخه سلولی در اواخر فاز G2/M و القاء آپوپتوز در سلول های سرطانی می شود (1 و 14).

گیاهان طیف گسترده ای از ترکیبات شیمیایی را تولید می کنند که به این ترکیبات متابولیت ثانویه گفته می شود؛ آلکالوئیدها، ترپنوئیدها، فلاونوئیدها، رنگدانه ها و تانن ها مهم ترین این ترکیبات هستند؛ این متابولیت های ثانویه دارای اثرات بیولوژیکی متنوعی مانند اثرات ضد التهابی، ضد سرطانی و غیره می باشند؛ اعتقاد بر این است که اثرات ضد سرطانی گیاهان با سرکوب آنزیم های تحریک کننده سرطان، ترمیم DNA، تحریک تولید آنزیم های ضد تومور در سلول، افزایش ایمنی بدن و القای اثرات آنتی اکسیدانی ایجاد می شود (10)؛ از این رو به کارگیری ترکیبات طبیعی همچون گیاهان دارویی به منظور مهار فرآیند تومورزایی و القای آپوپتوز در سلول های سرطانی؛ امروزه به عنوان یک استراتژی جدید برای مقابله با سرطان است که دارای اثرات جانبی و هزینه کمتری می باشند مطرح شده است (10).

گیاهان جنس Artemisia (دِرمنه) متعلق به خانواده Compositae (Asteraceae) (خانواده کاسنی­ ها) یکی از پرکاربردترین گیاهان دارویی می باشد؛ که از حدود 500 گونه در سراسر جهان تشکیل شده است، در ایران 34 گونه شناخته شده از Artemisia وجود دارد؛ A. absinthium از جمله گونه های مهم این جنس است (13 و 19). گیاهان جنس Artemisia و ترکیبات فعال حاصل از آن؛ به عنوان داروهای ضد سرطانی، ضد مالاریا، آنتی اکسیدانی، سیتوتوکسیک، ضد اسپاسم، ضد التهابی، ضد میکروبی و غیره بررسی شده اند؛ تحقیقات نشان داده است که عصاره برخی از گونه های Artemisia دارای فعالیت سیتوتوکسیکی و اثر آپوپتوزی در شرایط آزمایشگاهی در برابر رده های سلولی سرطانی و مدل های حیوانی سرطانی می باشد و در مقابل دارای سمیت کم و حتی بی تأثیر در برابر سلول های طبیعی می باشد (13 و 19).

در این راستا؛ Shafi و همکاران در سال 2012؛ به بررسی نقش عصاره A. absinthium در مهار تکثیر سلولی و القاء آپوپتوز در سلول های سرطانی سینه؛ دودمان های MDA-MB-231 و MCF-7 پرداختند، نتایج این مطالعات نشان دهنده اثرات ضد تکثیری عصاره A. absinthium بر روی سلول های سرطانی و فعال شدن مسیرهای آپوپتوزی در هر دو رده سلولی بود (17).  Choi و  Kimدر سال 2013؛ اثر عصاره متانولی هشت گونه مختلف Artemisia را بر روند تکثیر سلول های سرطانی سینه انسانی رده MCF-7 بررسی کردند و نشان دادند که عصاره تمام هشت گونه Artemisia باعث کاهش تکثیر سلول های سرطانی می شود (2). در سال 2018؛ Lian و همکاران فعالیت ضد سرطانی عصاره گیاه "Artemisia vulgaris (mugwort)" در برابر رده سلولی HCT-15 (سرطان کولون انسانی) بررسی کردند و نشان دادند که عصاره این گیاه به صورت وابسته به غلظت دارای اثر سمیت بر روی سلول های سرطانی می باشد و باعث مهار رشد این سلول ها می شود (11).

هدف از این پژوهش تجربی؛ بررسی اثر هم افزایی عصاره A. absinthium و تاکسول بر روی سلول های سرطانی معده انسانی (رده سلولی AGS) و تغییرات سطح بیان ژن های آپوپتوزی "p53 - Caspase 3 - Caspase 9" و متاستازی "MMP-2 – MMP-9" می باشد.

مواد و روشها

تهیه و کشت سلول های رده AGS: رده سلولی AGS (سلول های سرطانی معده انسانی) از انستیتو پاستور ایران (NCBICode: C131) تهیه شد و در محیط کشت RPMI  "BIO-IDEA; Iran" حاوی 10درصد FBS "Gibco; USA" و یک درصد آنتی بیوتیک استرپتومایسین-پنی سیلین "BIO-IDEA; Iran"؛ در فلاسک های مخصوص کشت سلولی؛ کشت داده شد.

تهیه عصاره متانولی گیاه A. absinthium : گیاه A. absinthium (FUMH) با کد شناسایی 45952 از هرباریوم دانشگاه فردوسی مشهد تهیه شد؛ برای تهیه عصاره متانولی A. absinthium ابتدا اندام های هوایی گیاه خشک و سپس پودر شد، سپس به ازای هر یک گرم از پودر گیاه؛ 10 میلی لیتر متانول اضافه شد و به مدّت 72 ساعت در شرایط تاریکی و در دمای اتاق قرار داده شد؛ در طی این مدّت مخلوط روزی 3 بار به خوبی هم زده شد؛ پس از گذشت 72 ساعت مخلوط حاصل با استفاده از کاغذ واتمن صاف شد و در نهایت عصاره گیری توسط دستگاه "Rotary Evaporator" انجام شد؛ برای تهیه استوک اصلی جهت تیمار سلول ها، 001/0 گرم از عصاره A. absinthium وزن شد و در 50 میکرولیتر دی ‌متیل سولفوکسید (DMSO) "CARLO ERBA; France" حل شد، سپس با محیط کشت به حجم یک میلی لیتر رسانده شد؛ جهت ساخت غلظت های تیماری از استوک اصلی از فرمول N1V1=N2V2 استفاده شد.

تهیه محیط تیماری تاکسول: جهت ساخت غلظت های تیماری از استوک اصلی تاکسول "Neshat Darou; Iran" از فرمول N1V1=N2V2 استفاده شد.

آزمون MTT جهت تعیین سمیت سلولی: به منظور بررسی تأثیر عصاره متانولی A. absinthium و تاکسول بر روی تکثیر سلول های AGS از آزمون MTT  استفاده شد؛ برای این کار ابتدا تعداد 10³×4 عدد از سلول ها؛ بعد از شمارش توسط روش رنگ آمیزی تریپان بلو "BIO-IDEA; Iran"؛ در یک پلیت 96 خانه کشت داده شد، بعد از گذشت 24 ساعت از کشت سلول ها؛ سلول های AGS با دی ‌متیل سولفوکسید "DMSO" (حلال عصاره A. absinthium) به عنوان گروه شاهد آزمایشگاهی (sham) و غلظت های 50، 100، 150، 200، 250، 300، 350، 400، 450 و 500 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium و غلظت های 50/2، 5، 10، 50/12، 15، 20، 25 و 30 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول تیمار شدند؛ بعد گذشت زمان 24 ساعت از تیمار سلول ها، مقدار 10 میکرولیتر از محلول MTT  "Sigma-Aldrich; USA" به محیط سلول ها اضافه شد، سپس پلیت کشت سلول ها برای مدّت 3 تا 4 ساعت درون انکوباتور قرار داده شد؛ سپس، مایع رویی سلول ها را خارج شد و مقدار 80 میکرولیتر؛ دی ‌متیل سولفوکسید (DMSO) به هر چاهک اضافه شد؛ در نهایت پلیت مربوطه به دستگاه اسپکتروفتومتر "EPOCH" منتقل شد و میزان جذب نوری نمونه ها در 570 نانومتر قرائت شد. درصد سلول های زنده توسط فرمول زیر محاسبه شد:

100× میانگین جذب نمونه کنترل / میانگین جذب نمونه تیمار = درصد سلول های زنده

آزمون MTT برای بررسی اثر کاربرد توأم عصاره A. absinthium و تاکسول

برای این آزمون نیز، بعد از کشت سلول های رده AGS، سلول ها برای بررسی اثر هم افزایی عصاره A. absinthium و تاکسول، به صورت هم زمان با غلظت های 150، 200 و 250 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium به همراه غلظت های 50/2، 5 و 10 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول تیمار شدند و بعد از گذشت زمان 24 ساعت از تیمار میزان بقای سلول ها با روش MTT بررسی شد.

بعد از مشخص شدن نتایج حاصل از آزمون MTT تنها از غلظت های "IC₅₀"  گروه های تیماری؛ یعنی غلظت 300 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium؛ غلظت 50/12 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول و غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium به همراه غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول؛ در سایر روش های آزمایشگاهی استفاده شد.

رنگ آمیزی هسته ای DAPI: برای رنگ آمیزی هسته سلول ها، بررسی آپوپتوز، بررسی میزان تراکم و یا قطعه قطعه شدن کروماتین در هسته سلول های تیمار شده و مقایسه آن با گروه کنترل از روش رنگ آمیزی DAPI "Sigma-Aldrich; USA" استفاده شد؛ برای این کار، در ابتدا یک کاور اسلیپ استریل در کف هر چاهک پلیت 6 خانه قرار داده شد، سپس تعداد 10⁵×4  عدد از سلول های AGS بر روی کاور اسلیپ ها کشت داده شدند؛ بعد از گذشت 24 ساعت از کشت سلولی و چسبیدن سلول ها به کاور اسلیپ ها به آرامی از گوشه هر چاهکِ پلیت؛ محیط کشت کامل برای گروه کنترل و محیط های تیماری برای گروه های تیماری اضافه شد، بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار؛ محیط رویی تمامی گروه ها برداشته شد و مقدار یک میلی لیتر متانول، به عنوان فیکساتور سلولی به پلیت اضافه شد و در نهایت سلول ها تحت اثر رنگ DAPI قرار گرفتند و تغییرات ایجاد شده در مورفولوژی سلول ها توسط میکروسکوپ فلورسنت بررسی شد.

آزمونAnnexin V-FITC : از این آزمون به منظور تعیین مرگ سلولی استفاده شد؛ جهت انجام این آزمون از  کیت "Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit (ab14085); Abcam; UK " استفاده شد به این صورت که ابتدا تعداد 10⁵×4  عدد از سلول های AGS در پلیت 6 خانه کشت شدند و بعد از گذشت 24 ساعت از کشت سلول ها؛ سلول ها با غلظت 300 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium، غلظت 50/12 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول از و  غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره A. absinthium به همراه غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر تاکسول تیمار شدند، بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار؛ سلول ها توسط تریپسین "BIO-IDEA; Iran" از کف پلیت جدا و به درون میکروتیوپ 2 میلی لیتری منتقل شدند و سپس سانتریفوژ انجام شد، با خارج کردن محیط رویی، طبق پروتکل کیت به هر نمونه 500 میکرولیتر Binding Buffer 1X اضافه شد و سپس 5 میکرولیتر آزمونAnnexin V-FITC  و 5 میکرولیتر پروپیدیوم یداید به هر نمونه اضافه شد؛ در نهایت نمونه ها به مدت 5 دقیقه در تاریکی انکوبه شدند و سپس نمونه های به دست آمده با دستگاه فلوسایتومتری مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

تست مهاجرت سلولی: این آزمون برای ارزیابی اثر ضد متاستازی غلظت های مؤثر گروه های تیماری انجام شد؛ برای بررسی میزان مهاجرت سلول های سرطانی رده AGS در گروه های تیماری تعداد 10⁵×4  عدد از سلول های AGS در پلیت 6 خانه کشت داده شدند و پس از رسیدن تراکم سلول ها به حدود 80درصد؛ توسط نوک پیپیت خراشی (به صورت خط عمودی در راستای قطر پلیت) در کف هر چاهک پلیت ایجاد شد و پس از آن سلول ها به مدّت 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند؛ پس از گذشت این زمان تحرک، مهاجرت سلول ها و همچنین میزان پر شدن خراش در گروه های تیماری با گروه کنترل به صورت کیفی در زیر میکروسکوپ معکوس مورد بررسی قرار گرفت توسط و عکس برداری (از لحظه صفر (قبل از تیمار سلول ها) و بعد از گذشت 24 ساعت از تیمار سلول ها) انجام شد.

تکنیک Real-time PCR: مراحل استخراج RNA طبق پروتکل کیت "Pars tous" صورت گرفت و برای اطمینان از غلظت مناسب RNA استخراج شده، میزان غلظت RNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر "EPOCH"سنجیده شد؛ در ادامه سنتز cDNA طبق پروتکل کیت "Pars tous" صورت گرفت و در نهایت تغییرات در میزان بیان ژن های آپوپتوزی "p53 - Caspase 3 - Caspase 9" و متاستازی "MMP-2 – MMP-9" در سلول های AGS؛ در گروه های تیماری؛ توسط دستگاه " Bio-Rad CFX96 RT-PCRs" و نرم افزار "Bio-Rad CFX Manager" بررسی شد.

توالی پرایمرهای مورد استفاده در تکنیک Rael-time PCR به شرح زیر است:

جدول 1- توالی پرایمرهای مورد استفاده در تکنیک Rael-time PCR

تجزیه و تحلیل آماری: داده های آماری حاصل از این مطالعه، در نرم افزار "SPSS (Version 26)" و به کمک آزمون آماری واریانس یک طرفه "ANOVA" در سطح معنی داری "p< 0.05" تجزیه و تحلیل شدند. با استفاده از نرم افزار Excel رسم شده اند. برای حصول اطمینان از نتایج این پژوهش تجربی؛ تمام آزمایشات به صورت سه بار تکرار انجام شد.

نتایج

آزمون MTT: نتایج آزمون MTT نشان داد که میزان زنده بودن سلول ها به صورت وابسته به غلظت در گروه های تیماری کاهش می یابد، به این صورت که با افزایش غلظت عصاره A. absinthium و تاکسول درصد زیست پذیری سلول ها کاهش می یابد؛ همچنین نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که، استفاده توأم از عصاره A. absinthium و تاکسول اثر بیشتری بر روند کاهش تکثیر سلول های سرطانی رده AGS نسبت به زمانی که از هر کدام به تنهایی استفاده کردیم؛ دارد. با تعیین غلظت مهاری "IC₅₀" مشخص شد که این میزان برای عصاره A. absinthium غلظت 300 میکروگرم بر میلی لیتر، برای تاکسول غلظت 50/12 میکروگرم بر میلی لیتر و غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium به همراه غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول برای کاربرد توأم؛ در زمان در 24 ساعت می باشد.

نمودار 1- مقایسه میانگین درصد زنده ماندن نمونه های تحت تیمار با عصاره  A. absinthiumدر مقایسه با نمونه کنترل در زمان 24 ساعت (^***001/0>p) (^*05/0>p)

نمودار 2- مقایسه میانگین درصد زنده ماندن نمونه های تحت تیمار با تاکسول در مقایسه با نمونه کنترل در زمان 24 ساعت (^***001/0>p)

نمودار 3- مقایسه میانگین درصد زنده ماندن نمونه های تحت تیمار توأم عصاره A. absinthium به همراه تاکسول در مقایسه با نمونه کنترل در زمان 24 ساعت (^***001/0>p)

رنگ آمیزی DAPI: همان طور که در شکل شماره یک مشاهده می شود، نتایج حاصل از رنگ آمیزی DAPI نشان می دهد که در هسته سلول های AGS که تحت تیمار با غلظت های "IC₅₀" از عصاره A. absinthium و تاکسول و نیز ترکیب توأم عصاره A. absinthium و تاکسول؛ در زمان 24 ساعت قرار گرفتند؛ نسبت به هسته سلول های گروه کنترل که هیچ گونه تیماری دریافت نکرده اند، تغییرات مورفولوژیکی دیده می شود، در گروه های تیماری هسته ها قطعه قطعه شده اند و شکل هسته ها از حالت نرمال خارج شده؛ که می تواند نشانه ای برای وقوع آپوپتوز در این سلول ها باشد، همان طور که در شکل یک مشاهده می شود بیشترین آسیب سلولی و تغییرات مورفولوژیک در هسته ها زمانی اتفاق افتاده است که سلول ها با ترکیبی از عصاره A. absinthium  و تاکسول تیمار شده اند.

شکل 1- مشاهده هسته سلول ها توسط رنگ آمیزی DAPI بعد از گذشت 24 ساعت. (الف) گروه کنترل؛ (ب) تیمار با غلظت 300 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium؛ (ج) تیمار با غلظت 50/12 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول؛ (د) تیمار با غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره A. absinthium به همراه غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر تاکسول (نوک پیکان ها نشان دهنده سلول هایی می باشد که دچار آپوپتوز شده اند.) درشت نمایی تصاویر: 400X

تست Annexin V-FITC: برای انجام این تست، سلول های AGS؛ با غلظت های "IC₅₀"؛ در زمان 24 ساعت تیمار شدند؛ همان طور که در شکل شماره 2 مشاهده می شود؛ نتایج آزمون Annexin V-FITC نشان می دهد، درحالی که در گروه کنترل حدود 96درصد از سلول های AGS زنده می باشند، در گروه تیمار شده با عصاره A. absinthium در حدود 46درصد سلول ها دچار آپوپتوز ثانویه شده اند؛ همچنین در گروه تیماری تاکسول درصد سلول هایی که دچار آپوپتوز ثانویه شده اند در حدود 1/43درصد می باشد و در گروه تیماری توأم عصاره A. absinthium به همراه تاکسول شاهد بیشترین مرگ سلولی به صورت آپوپتوز ثانویه هستیم، به طوری که در این گروه، در 5/57درصد از سلول های سرطانی AGS آپوپتوز ثانویه رخ داده است.

شکل 2 - آنالیز فلوسایتومتری. (الف) گروه کنترل؛ (ب) تیمار با غلظت 300 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium؛ (ج) تیمار با غلظت 50/12 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول؛ (د) تیمار با غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر عصاره A. absinthium به همراه غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر تاکسول

تست مهاجرت سلولی: نتایج حاصل از این تست نشان داد که سلول های گروه کنترل دارای قدرت مهاجرت بیشتر و تهاجم سریع تری برای پر کردن ناحیه خراش نسبت به گروه های تیماری می باشند؛ بررسی های کیفی توسط عکس برداری نشان داد که تحرک سلول های سرطانی AGS در تمام گروه های تیماری در زمان 24 ساعت کاهش پیدا کرده بود؛ در گروه تیماری کاربرد توأم عصاره A. absinthium با غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر به همراه تاکسول با غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر، قدرت تحرک و تهاجم سلول ها برای پر کردن ناحیه خراش به طور قابل توجهی کاهش پیدا کرده بود.

شکل 3- بررسی روند مهاجرت سلول ها. (الف) سلول های AGS در لحظه ایجاد خراش (ساعت صفر)؛ (ب) سلول های گروه کنترل؛ (ج) سلول های تیمار شده با غلظت 300 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium؛ (د) سلول های تیمار شده با غلظت 50/12 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول؛ (د) سلول های تیمار شده با غلظت 150 میکروگرم بر میلی لیتر از عصاره A. absinthium به همراه غلظت 5 میکروگرم بر میلی لیتر از تاکسول. (پس از گذشت 24 ساعت از ایجاد خراش) درشت نمایی تصاویر: 100X

بررسی بیان ژن ها توسط تکنیک Real-time PCR: همان طور که در شکل شماره 4 مشاهده می شود، میزان بیان ژن های آپوپتوزی "Caspase 3,9, p53" در تمام گروه های تیماری نسبت به گروه کنترل افزایش داشته است؛ که این امر نشان دهنده القاء آپوپتوز در سلول های سرطانی معده انسانی رده  AGS نسبت به گروه کنترل می باشد؛ همچنین نتایج حاصل از تکنیک Real-time PCR نشان دهنده کاهش در میزان بیان ژن های متاستازی "MMP-2 – MMP-9" در گروه های تیماری نسبت به گروه کنترل بود. بیشترین افزایش بیان ژن های آپوپتوزی "Caspase 3,9, p53" و همچنین بیشترین کاهش بیان ژن های متاستازی "MMP-2 – MMP-9" در گروه تیمار شده با ترکیب توأم عصاره A. absinthium به همراه تاکسول دیده شده است؛ که این امر نشان دهنده توانایی این ترکیب در کاهش بیان ژن های متاستازی در سلول های سرطانی AGS می باشد؛ ژن های "MMP-2 – MMP-9" از مهمترین ماتریکس متالوپروتئینازهایی (MMPهایی) هستند که در فرآیند مهاجرت و تهاجم سلول های سرطانی دخالت دارند و کاهش بیان این ژن ها باعث مهار توانایی مهاجرت سلول های سرطانی و همچنین جلوگیری از متاستاز به بافت های دورتر می شود.

شکل 4- بررسی میزان تغییرات در بیان ژن های آپوپتوزی و ژن های متاستازی توسط تکنیک Real-time PCR (^*05/0>p). الف) بیان ژن Caspase-3؛ ب) بیان ژن Caspase-9؛ ج) بیان ژن p53؛ د) بیان ژن MMP-2؛ ه) بیان ژن MMP-9

بحث و نتیجه گیری

با توجه به شواهدی مبنی بر خاصیت ضد سرطانی گیاهان جنس Artemisia؛ در این پژوهش تجربی برای اولین بار اثر هم افزایی عصاره متانولی A. absinthium و تاکسول بر روی سلول های سرطانی معده انسانی (رده سلولی AGS) و تغییرات سطح بیان ژن های آپوپتوزی "p53 - Caspase 3 - Caspase 9" و متاستازی "MMP-2 – MMP-9" بررسی شد؛ جهت انجام این پژوهش بعد از تهیه عصاره متانولی A. absinthium؛ برای بررسی اثرات سیتوتوکسیک عصاره A. absinthium، تاکسول و نیز کاربرد توأم عصاره A. absinthium با تاکسول بر روی تکثیر سلول­ ها از آزمون MTT استفاده شد؛ برای بررسی آپوپتوز در سلول ­های تحت تیمار از رنگ آمیزی DAPI و آنالیز فلوسایتومری استفاده شد؛ همچنین برای ارزیابی اثر ضد متاستازی گروه های تیماری از تست مهاجرت سلولی استفاده شد و در نهایت تغییرات در میزان بیان ژن های آپوپتوزی "Caspase 3,9, p53" و ژن های متاستازی "MMP-2 – MMP-9" با تکنیک Real-time PCR بررسی شد.

نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که عصاره A. absinthium و تاکسول می توانند به صورت وابسته به غلظت منجر به کاهش زیست پذیری سلول­ های سرطانی رده AGS شوند. بهترین نتیجه زمانی به دست آمد که از کاربرد توأم عصاره A. absinthium و تاکسول جهت تیمار سلول ها استفاده شد؛ به این صورت که در این محیط تیماری تکثیر سلول ها به طور قابل توجهی و در سطح معنی داری (^***001/0>p) مهار شد. این نتایج بیان گر این است که ترکیب عصاره A. absinthium با تاکسول اثر بیشتری بر مهار تکثیر سلول ها دارد؛ که این امر با توجه به کاهش میزان غلظت "IC₅₀" نسبت به زمانی که از عصاره A. absinthium و تاکسول به تنهایی استفاده کردیم، قابل اثبات است.

در سال 2014؛ Gordanian و همکاران به بررسی اثرات سیتوتوکسیک عصاره پنج گونه مختلف Artemisia (از جمله A. absinthium) در برابر رده سرطانی MCF-7 پرداختند؛ نتایج حاصل از آزمون MTT نشان داد که عصاره پنج گونه مختلف Artemisia به صورت وابسته به غلظت باعث مهار تکثیر سلول های سرطانی سینه می شوند، همچنین نشان دادند که فعالیت سیتوتوکسیک گونه های A. absinthium و A. vulgaris از سایر گونه های دیگر بیشتر است (7)؛ نتایج حاصل از آزمون MTT اجرا شده در این پژوهش نیز نشان دهنده اثرات مهاری عصاره A. absinthium به صورت وابسته به غلظت بر روند تکثیر سلول های سرطانی رده AGS بود. در سال 2018 Kim و همکاران؛ اثرات سیتوتوکسیک و ضد تکثیری عصاره اتانولی برگ های گیاه Artemisia capillaris در برابر رده های سلولی سرطانی Huh7 و HepG2 را بررسی کردند و نشان دادند که عصاره A. capillaris تکثیر این سلول ها را به شدت سرکوب می کند و با افزایش سطح بیان کاسپاز-3 باعث القای آپوپتوز در سلول های Huh7 و HepG2 می شود (9)؛ که با تمامی نتایج حاصل از مطالعه حاضر همسو می باشد.

بررسی تغییرات مورفولوژیک هسته ها با رنگ آمیزی DAPI نشان داد که در گروه های تیماری نسبت به گروه کنترل، تغییرات مورفولوژیکی دیده می شود؛ همان طور که در شکل شماره یک هم مشخص می باشد در گروه های تیماری هسته ها قطعه قطعه شده اند و از حالت نرمال خارج شده اند، که این امر می تواند نشانه ای برای وقوع آپوپتوز در این سلول ها می باشد؛ بیشترین آسیب سلولی و تغییرات در هسته ها زمانی اتفاق افتاده است که سلول ها با ترکیبی از عصاره A. absinthium و تاکسول تیمار شده اند. همچنین نتایج تست Annexin V-FITC نشان داد، در حالی که درصد زنده بودن سلول های گروه کنترل در حدود 96درصد می باشد؛ این میزان در سلول های تیمار شده با عصاره A. absinthium، تاکسول و ترکیب توأم عصاره A. absinthium با تاکسول، به ترتیب به 48، 47 و 38 درصد کاهش داشته است؛ در نتیجه می توان بیان کرد که ترکیب عصاره A. absinthium به همراه تاکسول توانایی خوبی برای القای آپوپتوز در سلول های سرطانی معده انسانی رده AGS دارد.

در سال 2017 Kim و همکاران توانایی القای آپوپتوز عصاره Artemisia annua را در رده سلولی HCT116 (سرطان کولون) بررسی کردند و با استفاده از آزمون Annexin V-FITC نشان دادند که در سلول های تیمار شده با غلظت های مختلف عصاره A. annua درصد سلول های آپوپتوتیک افزایش می یابد و همچنین تیمار با عصاره A. annua می تواند بیان ژن آنتی آپوپتیک Bcl-2 را کاهش و بیان ژن آپوپتوزی BAX را افزایش دهد و در نهایت نتیجه گرفتند که عصاره A. annua دارای توانایی القای آپوپتوز در رده سلولی HCT116 می باشد (8)؛ تمامی نتایج تجربیات آزمایشگاهی حاصل از پژوهش حاضر نیز نشان دهنده توانایی عصاره A. absinthium در القای آپوپتوز در رده سلولی AGS بود.

نتایج Real-time PCR نشان داد که استفاده از ترکیب عصاره A. absinthium و تاکسول به صورت هم زمان می تواند باعث افزایش سطح بیان ژن های آپوپتوزی "p53 - Caspase 3 - Caspase 9" و کاهش بیان ژن های متاستازی "MMP-2 – MMP-9" در سلول های سرطانی رده AGS (در سطح معنی داری ^*05/0p) تحت تیمار شود؛ با توجه به نتایج حاصل از Real-time PCR می توان بیان کرد که ترکیب توأم عصاره A. absinthium و تاکسول توانایی قابل توجهی در بالا بردن سطح بیان ژن های آپوپتوزی و همچنین کاهش بیان ژن های متاستازی دارد و در آینده می تواند با مطالعات و تحقیقات کامل تر؛ بیشتر مورد توجه قرار گیرد.

Tayarani-najaran و همکاران در سال 2016؛ به بررسی اثرات سیتوتوکسیک و آپوپتوتیک عصاره دی ‌کلرومتانی Artemisia biennis در برابر رده های سلولی K562 و HL-60 پرداختند و نشان دادند که عصاره A. biennis باعث مهار تکثیر سلول های سرطانی می شود و با افزایش سطح بیان ژن آپوپتوزی BAX باعث القای آپوپتوز در سلول های K562 و HL-60 می شود (20)؛ که با نتایج پژوهش حاضر که نشان دهنده توانایی عصاره A. absinthium در بالابردن سطح بیان ژن های آپوپتوزی هم راستا می باشد.

یافته های حاصل از این پژوهش تجربی نشان داد که کاربرد توأم عصاره A. absinthium و تاکسول تکثیر سلول های سرطانی معده رده AGS را به طور قابل توجهی مهار نموده و باعث القای آپوپتوز و کاهش قدرت تهاجم در این سلول ها می شود؛ لذا این ترکیب در آینده می تواند در مطالعات مربوط به درمان سرطان معده؛ مورد توجه و مطالعه بیشتری قرار گیرد.

سپاسگزاری

بدین وسیله از کلیه اساتید و کارشناسان مرکز تحقیقات بیولوژی کاربردی تکوین جانوری دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد که در اجرای این طرح همکاری داشتند تشکر می شود.