بررسی عصاره گیاه زیرفون (Tilia platyphyllos) بر تخریب حافظه کاری القاء شده

با اسکوپولامین در موش های بزرگ سفید آزمایشگاهی نر نژاد ویستار:

مشارکت مکانیسم‌های آنتی اکسیدانی

سیاوش خیاط عمرانی¹، فرهاد ولی زادگان¹، باقر سیدعلیپور^2* و احسان نظیفی³

¹ ایران، بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه علوم جانوری

² ایران، بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست سلولی و مولکولی

³ ایران، بابلسر، دانشگاه مازندران، دانشکده علوم پایه، گروه علوم گیاهی

تاریخ دریافت:             تاریخ پذیرش:

چکیده

اسکوپولامین با ایجاد استرس اکسیداتیو در سلول‌های مغز، به ویژه کورتکس و هیپوکامپ، سبب ایجاد اختلال در حافظه می‌شود. گیاهان دارویی با ترکیبات موثر مختلف می توانند اثرات آنتی اکسیدانی داشته باشند. هدف این مطالعه تاثیر عصاره متانولی گیاه زیرفون بر استرس اکسیداتیو و اختلال حافظه کاری القاء شده با اسکوپولامین در موش های نژاد نر ویستار می‌باشد. در این مطالعه تجربی، 36 موش نر ویستار به‌طور اتفاقی به 6 گروه 6 تایی تقسیم شدند. گروه کنترل، گروه اسکوپولامین (1 میلی گرم بر کیلوگرم)، گروه عصاره (300 میلی گرم بر کیلوگرم) و گروه های عصاره 100، 225 و 300 به همراه اسکوپولامین که عصاره ها را به صورت گاواژ و اسکوپولامین را به صورت داخل صفاقی به مدت 10 روز دریافت کردند. پس از آزمون رفتاری تست شناسایی شی جدید (Novel Object  Recognition Test) ، نمونه برداری از بافت هیپوکمپ و کورتکس برای سنجش فعالیت آنزیم‌های کاتالاز (CAT) ، سوپراکسید دیسموتاز (SOD) و استیل کولین استراز (AChE) انجام شد. نتایج ما نشان داد تزریق اسکوپولامین باعث کاهش شاخص تبعیض در NORT می‌شود. دوز 300  عصاره دارای بالاترین تاثیر بود، به‌طوری که حتی در تجویز آن به همراه اسکوپولامین نیز کاهش معنی‌داری(p<0.001) در تعداد خطاهای حافظه کاری ایجاد گردید. یافته های بیوشیمیایی در بافت­های هیپوکامپ و کورتکس نشان داد که اسکوپولامین فعالیت آنزیم­های آنتی‌اکسیدانی  CAT و  SOD را کاهش و فعالیت AChE را افزایش داد. تیمار با عصاره زیرفون سبب برگرداندن فعالیت آنزیم‌هایSOD  ،CAT و AChE شد. نتایج حاصل از این پژوهش حاکی از آن است که عصاره زیرفون دارای اثر تقویت کنندگی بر حافظه کاری بوده و اثر خود را عموما از طریق فعالیت آنتی اکسیدانی اعمال می‌کند.

واژه های کلیدی: آنتی‌اکسیدان، اسکوپولامین، حافظه کاری، زیرفون، کورتکس

* نویسنده مسئول، تلفن: 01135302405 ، پست الکترونیکی: b.seyedalipour@umz.ac.ir

مقدمه

حافظه توانایی ثبت، حفظ اطلاعات و بازیابی همان اطلاعات در صورت نیاز است در حالی که یادگیری فرآیندی است برای کسب اطلاعات جدید در مورد رویدادهایی که رخ داده است (8) حافظه کاری، کارکردی شناختی است که مسئول حفظ اطلاعات آنی، دستکاری و استفاده از آنها در فرآیند تفکر، ادراک و استدلال می‌باشد (35) قشر پیش‌پیشانی (PFC) به عنوان ساختاری شناخته شده است که به طور گسترده در فرآیندهای شناختی مثل تفکر، استدلال، تصمیم‌گیری و برنامه‌ریزی نقش دارد(38). جدیدترین مطالعات در زمینه­ی تصویربرداری مغزی که با استفاده از پرتونگاری مقطعی با پرتو پوزیترون (PET) و تصویرسازی تشدید مغناطیسی کارکردی (fMRI)روی انسان انجام گرفته نشان دهنده­ی افزایش جریان خون در قشر پیشانی در حین دوره­ی تاخیری آزمون­های مرتبط با حافظه­ی کاری است (21). شمار زیادی از نوروترانسمیترها برای عملکرد حافظه ضروری هستند. از جمله این نوروترانسمیترها می‌توان به  استیل کولین، دوپامین و گلوتامات اشاره کرد (22). انتقال عصبی دوپامین در قشر پیشانی برای حافظه‌ی کاری در انسان و جانوران اهمیت دارد. پژوهش انجام شده توسط برازوسکی برای نخستین بار نقش کاتکول آمین‌ها (دوپامین) را در حافظه‌ی کاری نشان داد. علاوه بر دوپامین، پژوهش‌های انجام شده روی میمون‌ها، رت‌ها و انسان نشان داد که سایر نوروترانسمیترهای تنظیم کننده بر حافظه‌ی کاری تاثیر می‌گذارند. برای مثال نوراپی نفرین از طریق آلفا-آدرنورسپتور و استیل کولین از طریق گیرنده‌های موسکارینی عمل می‌کنند (5). طبق شواهد بدست آمده از مطالعات اخیر، داروهای آنتی‌کولینرژیک حافظه و یادگیری را در مدل‌های مختلف یادگیری تخریب می‌نمایند. به گونه‌ای که آگونیست رسپتورهای کولینرژیک و یا مهارکننده‌های استیل کولین استراز اثر مثبت و تقویت کننده‌ای برحافظه دارند، در حالیکه آنتاگونیست رسپتورهای کولینرژیک نظیر اسکوپولامین باعث اختلال در حافظه می‌شوند (41). اسکوپولامین از نظر ساختاری شبیه به انتقال دهنده عصبی استیل کولین است و عملکرد خود را با مسدود کردن گیرنده‌های موسکارینی استیل کولین که منجر به اختلال عملکرد کولینرژیک و اختلال در یادگیری و حافظه می‌شود، انجام می‌دهد (28). وقوع استرس اکسیداتیو در هیپو کامپ بعد از تیمار با مورفین مشاهده شد که با کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدانی مانند کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز همراه بود. نتایج حاصل نشان دهنده حساسیت مغز به استرس اکسیداتیو القا شده با مورفین، است  (19). ترکیبات طبیعی سرشار از آنتی اکسیدان ها ممکن است مهمترین عامل در پیشگیری از بیماری های ناشی از استرس اکسیداتیو باشند. در همین راستا حاجی زاده و همکاران نشان دادند تیمار  عصاره سیانوباکتری فعالیت آنزیم های کاتالاز، سوپر اکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز قشر مغز را بطور معنی داری تغییر می دهد (17).

 بسیاری از مطالعات اخیر نشان داد که اختلال در حافظه مدل حیوانی ناشی از اسکوپولامین، با افزایش استرس اکسیداتیو در مغز و تغییر در آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی مغز مرتبط است (11). تولید بیش از حد ترکیبات اکسیدکننده همچون گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و یا عدم کارایی مکانیسم‌های دفاع آنتی‌اکسیدانی سبب آسیب بافتی می‌شود (33). در شرایط طبیعی، اغلب بین تولید رادیکال‌های آزاد از یک سو و سیستم دفاع آنتی‌اکسیدانی از سوی دیگر حالت تعادل وجود دارد (39). یکی از مکانیسم‌هایی که ممکن است در بهبود اختلال حافظه ناشی از اسکوپولامین توسط ترکیبات فلاونوئیدی موثر باشد، بهبود عملکرد سیستم کولینرژیک و مهار آنزیم استیل کولین استراز، توسط این ترکیبات می‌باشد (34). گیاه زیرفون ((Tilia platyphyllos متعلق به خانواده Tiliaceae است، که از چندین گونه تشکیل شده است، که در اروپا، آمریکای شمالی و آسیا توزیع شده است (16). گیاه زیرفون یک درخت برگ‌ریز بزرگ است. در ایران بیشتر در سفید­رود گیلان، کجور، مینودشت، جنگل گلستان، جنگل‌های کوهستانی تنکابن و همین‌طور بلوچستان و بندرعباس پراکندگی دارند (40). نام اروپایی آنLime tree و Linden tree و نام ایرانی آن زیرفون می باشد (36). از مواد مؤثره این گیاه می‌توان به فلاونوئیدهای مختلف مانند تیلیروزید، کوئرستین، ایزوکوئرستین، هایپروسید، روتنون، کاتچین و آمینواسیدهای مختلف شامل آلانین و سیستئین  اشاره کرد (4). فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهابی و ضدتوموری در گیاهانی از جمله زیرفون دیده می‌شود (6). گل و برگ زیرفون به دلیل داشتن مواد موثره از جمله فلاونوئیدها به‌عنوان آنتی‌اکسیدان طبیعی عمل می‌کنند (7). با توجه به نقش آنتی‌اکسیدانی گیاه زیرفون، در این تحقیق بر آن شدیم تا اثر عصاره گیاه زیرفون بر تخریب حافظه کاری و فعالیت آنزیم‌های کاتالاز، سوپراکسید دیسموتاز و استیل کولین استراز در کورتکس و هیپوکمپ القاء شده با اسکوپولامین در موش های بزرگ آزمایشگاهی نر بپردازیم.

مواد و روشها

طراحی آزمایش: این پژوهش در آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری گروه زیست شناسی دانشگاه مازندران انجام شد. دراین مطالعه تجربی  36 سر موش بزرگ آزمایشگاهی نر در محدوده وزنی 250-200 گرم و محدوده سنی 14-12 هفته از مرکز حیوانات دانشگاه علوم پزشکی بابل خریداری شد و در اتاق حیوانات دانشکده زیست شناسی در شرایط استاندارد 12 ساعت نور و  12 ساعت تاریکی در دمای 25 درجه سانتیگراد نگه­داری شدند و آب و غذای مخصوص حیوانات به میزان کافی در دسترس آنها قرارگرفت. آزمایشات یک هفته بعد از انتقال موش‌ها به آزمایشگاه به منظور سازگاری با محیط آزمایشگاه انجام گرفت. کلیه آزمایشات مطابق آیین نامه اخلاقی کمیته اخلاق زیستی دانشگاه مازندران و با کد اخلاق زیستی (IR.UMZ.REC.1400.041) انجام شد.

در این تحقیق حیوانات مورد آزمایش به 6 گروه 6 تایی به این شرح تقسیم شدند: 1- گروه کنترل، که سالین را بصورت درون صفاقی و به صورت گاواژ دریافت کردند. 2- گروه عصاره 300، که غلظت 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم عصاره گیاه زیرفون را به ­صورت گاواژ دریافت کردند و سالین را بصورت درون صفاقی دریافت کردند (19). 3- گروه اسکوپولامین (بیمار)، که اسکوپولامین با غلظت یک میلی‌گرم بر کیلوگرم را بصورت درون صفاقی و سالین را بصورت گاواژ دریافت کردند (30). 4- گروه عصاره 150 به‌علاوه اسکوپولامین که اسکوپولامین را بصورت درون صفاقی و عصاره گیاه زیرفون (150 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به ­صورت گاواژ دریافت کردند. 5-گروه عصاره 225 به‌علاوه اسکوپولامین که اسکوپولامین را بصورت درون صفاقی و عصاره گیاه زیرفون (225 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به ­صورت گاواژ دریافت کردند. 6- گروه عصاره 300 به‌علاوه اسکوپولامین که اسکوپولامین را بصورت درون صفاقی و عصاره گیاه زیرفون (300 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به ­صورت گاواژ دریافت کردند. تمام تیمارها به مدت 10 روز و در ساعت 8 الی 10 صبح انجام شدند. آخرین گاواژ برای هر حیوان 24 ساعت قبل از کالبدشکافی آنها بود. تمامی حیوانات مورد آزمایش به جز گروه کنترل، طی یک بازه زمانی 10 روزه، حلال ها و ترکیباتی که برای تیمار استفاده شدند را به صورت روزانه دریافت کردند. بعد از انجام تست رفتاری در روز یازدهم، بافت هیپوکامپ و کورتکس از بافت مغزی جدا و در نیتروژن مایع قرار داده شد و برای سنجش آنزیمی مورد استفاده قرار گرفت.

عصاره گیری: در این تحقیق، گل‌ها و برگ‌های درخت زیرفون (نمدار) در اوایل تیر ماه سال 1398 (از شهرستان تنکابن، استان مازندران، ایران) جمع‌آوری شد. گل‌ها و برگ‌ها در شرایط سایه خشک و با آسیاب الکتریکی پودر شدند. سپس 100 گرم از پودر گیاه با 500 میلی‌لیتر متانول به مدت 24 ساعت روی دستگاه شیکر با سرعت 100 دور بر دقیقه قرار گرفت. بعد از گذشت این زمان، عصاره حاصل به‌وسیله کاغذ صافی و قیف بوخنر طی دو مرحله صاف گردید و با استفاده از دستگاه تبخیرکننده چرخشی (LABFREEZ, RE-5PRO, TIWAN) در دمای 39 درجه سانتیگراد و تحت فشار خلا پایین تغلیظ شد. در نهایت عصاره تغلیظ شده با قرار دادن در دستگاه آون با دمای 39 درجه سانتیگراد خشک گردید. پودر خشک عصاره توزین و توسط نرمال سالین برای به دست آوردن غلظت‌های مختلف حل گردید.

تست رفتاری

تست شناسایی شئ جدید (Novel Object Recognition Test) : تست شناسایی شئ جدید یک آزمون رفتاری است که به بررسی جنبه‌های مختلف یادگیری و حافظه در موش‌ها می‌پردازد. این آزمون در سه روز کامل می‌شود:

روز عادت در این دوره موش در محیط قرار گرفته و آن را شناسایی می‌کند.

روز تمرین در این روز که ۲۴ ساعت بعد از روز عادت است، حیوان در محیط قبلی با دو شئ جدید هم شکل قرار می‌گیرد.

روز آزمون موش در محیط قبلی با دو شئ، یکی آشنا و دیگری جدید قرار می‌گیرد.

محیط این آزمون، محیطی هندسی (مربعی شکل) با ابعاد 40×60×60 سانتی‌متر و بدون هیچ شئ می‌باشد. در طول دوره تمرین موش‌ها اجازه دارند دو شئ را شناسایی کنند. جهت بررسی دقیق رفتارهای حیوان در طول مدت آزمایش، دوربینی دیجیتالی در بالای محفظه تعبیه شد. در روز آزمون، یکی از اشیاء دوره تمرین با یک شئ جدید جایگزین می‌شود. موش‌ها معمولا گرایش به شئ جدید دارند و اگر موش شئ آشنا را شناسایی کند، بیشتر زمانش را برای شناسایی شئ جدید صرف خواهد کرد. مداخلات درمانی می‌تواند قبل و بعد از تمرین یا پیش از به یاد آوردن آن چه یاد گرفته شده است، استفاده شود. پس از هر آزمایش، کف محیط آزمایش با الکل تمیز شد. به طور کلی می‌توان اشاره کرد که آزمون Novel Object یک آزمون کم استرس و کارآمد برای ارزیابی حافظه، تغییرات روان‌شناختی – عصبی به دنبال اعمال مداخلات زیستی و ژنتیکی در حیوان می‌باشد. همچنین، این آزمون به منظور ارزیابی شناختی به خصوص بازیابی حافظه کاری در مدل‌های حیوانی موش دارای اختلالات سیستم عصبی مرکزی مورد استفاده قرار می گیرد.  برای سنجش شاخص شناسایی از فرمول زیر استفاده شد (24).

تهیه، جدا سازی و هموژن سازی بافت: پس از پایان آخرین تست های رفتاری، به منظور تعیین سنجش فعالیت آنزیم های کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و استیل کولین استراز، موش های بزرگ سفید آزمایشگاهی نر نژاد ویستار با استفاده از کلروفرم بیهوش و ناحیه هیپوکامپ و کورتکس مغز جدا سازی شد. جهت هموژن‌سازی هر یک از بافت‌ها (کورتکس و هیپوکمپ) از نیتروژن مایع استفاده شد. ابتدا بافت مورد نظر را در تانک نیتروژن مایع قرار داده، سپس بافت را از تانک خارج کرده و به هاون چینی انتقال داده، با فاصله زمانی چندین بار ازت مایع روی بافت ریخته تا بافت سفت و شکننده باقی بماند. همزمان بافت را کوبیده، به طوریکه بافت کاملا خرد و پودری شکل شود. سپس بعد از تعیین وزن بافت هموژن شده آن را به لوله فالکون انتقال داده  و به ازای هر گرم از بافت 10 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 100 مولار با pH= 7/4 اضافه شد. سپس با سرعت 10000  دور بر دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. در نهایت مایع شفاف رویی برای سنجش فعالیت آنزیم‌های مورد نظر جدا‌سازی گردید و تا زمان انجام آزمایش نمونه ها در فریزر 20- نگهداری شد.

تست های بیوشیمیایی

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز در بافت کورتکس و هیپوکامپ: اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز به روش (Aebi) با استفاده از سوبسترای پراکسید هیدروژن انجام شد. واکنش در کوت  3 میلی‌لیتری انجام گرفت. حجم مخلوط واکنش شامل  980 میکرولیتر محلول  30 میلی‌مولار آب اکسیژنه و 2 میلی‌لیتر بافر فسفات سدیم 50 میلی‌مولار با (pH 7) و 20 میکرولیتر از نمونه آنزیم (سوپر ناتنت) بود. واکنش با افزودن سوبسترا شروع و تغییرات جذب در طول مدت 2 دقیقه در طول موج 240 نانومتر اندازه‌گیری شد. فعالیت آنزیم کاتالاز با استفاده از ضریب خاموشی (39.4 M^-1CM^-1) براساس قانون بیرلامبرت (A=ɛdc) محاسبه و به صورت واحد بر گرم بافت (U/g tissue) گزارش شد. بر طبق تعریف، یک واحد کاتالاز مقدار آنزیمی است که موجب تجزیه یک میکرومول H₂O₂ در مدت یک دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‎گراد شود (1).

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز در بافت کورتکس و هیپوکامپ : برای سنجش فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز از روش اتواکسیداسیون پیروگالل استفاده شد. بدین منظور از بافر تریس-هیدروکلرید  50 میلی‌مولار (pH 8.2) و EDTA یک میلی مولار و پیروگالول02/0میلی‌مولار استفاده گردید. حجم 2900 میلی‌لیتر از بافر تریس- هیدروکلرید حاوی EDTA  با  50 میکرولیتر سوپرناتنت مخلوط و سپس 50 میکرولیتر محلول پیروگالل به محلول فوق اضافه شد و سریعا جذب در 5 دقیقه با فاصله 30 ثانیه‌ای در طول موج 420 نانومتر خوانده شد. برای اندازه‌گیری شاهد از اتواکسیداسیون پیرو‌گالل به تنهایی استفاده شد و به جای آنزیم 50  میکرولیتر بافر اضافه گردید و جذب در طول موج 420 نانومتر خوانده شد و با استفاده از اعداد بدست آمده درصد فعالیت آنزیم محاسبه شد. میزان فعالیت به صورت درصد مهار‌کنندگی آنزیم بیان شد (25).

درصد مهار پیروگالول= (dA/dt_blank - dA/dt_sample)/dA/dt_blank

سنجش فعالیت آنزیم استیل کولین استراز در بافت‌های کورتکس و هیپوکمپ: اساس این روش اندازه‌گیری سرعت تولید تیوکولین به عنوان محصول کاتالیز آنزیمی با استفاده از سوبسترای استیل تیوکولین می‌باشد. حجم 10 میکرولیتر از نمونه آنزیم، 2950 میکرولیتر از بافر سدیم فسفات 50 میلی مولار (pH 7.5) به همراه 20 میکرولیتر از معرف 10 میلی‌مولار DTNB و در نهایت با 20 میکرولیتر استیل تیوکولین یداید با غلظت 75 میلی‌مولار مخلوط گردید. پس از افزودن سوبسترا، سرعت تولید تیوکولین با پیگیری واکنش آن با DTNB و تولید آنیون زردرنگ2 - نیترو -5- مرکاپتو بنزوئیک اسید در طول موج 412 نانومتر اندازه‌گیری شد. تغییرات جذب  توسط دستگاه اسپکتروفتومتر به مدت 5 دقیقه و هر 30 ثانیه یکبار خوانده و ثبت شد. روش سنجش نمونه شاهد نیز همانند نمونه دارای آنزیم است. تنها تفاوت اینکه نمونه شاهد فاقد آنزیم بوده و به جای آنزیم از بافر استفاده شد. فعالیت آنزیم بر اساس میکرومول بر دقیقه در هر گرم بافت (μmol/min/g) گزارش شد (12).

آنالیز آماری و تحلیل داده ها: پس از جمع‌آوری داده‌ها تجزیه و تحلیل با استفاده از نرم افزار آماری SPSS  نسخه 21انجام شد. برای بررسی وجود اختلاف بین گروه ها، از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و به دنبال آن از آزمون تعقیبی توکی استفاده شد. داده‌ها به صورت میانگین ±  انحراف معیار گزارش و اختلاف بین گروه‌ها باp<0.05  معنی‌دار تلقی شده است. برای آنالیز رفتاری و رسم نمودارها از نرم افزار PRISM و Excel استفاده گردید.

نتایج

اثر عصاره زیرفون بر اختلالات حافظه کاری القا شده با اسکوپولامین در تست شناسایی شئ جدید: شاخص شناسایی شئ جدید (شاخص تبعیض) در گروه بیمار کاهش معنی‌داری نسبت به گروه کنترل  نشان داد (P<0.001). گروه‌های اسکوپولامین تیمار شده با عصاره زیرفون در غلظت 150 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (P<0.05) و در غلظت‌های 225 و 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (P<0.001) افزایش معنی‌داری را نسبت به بیمار نشان دادند (شکل 1).

شکل 1- اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر اختلالات حافظه القاء شده با اسکوپولامین در آزمون شناسایی شئ جدید

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.01 ^**، p<0.001 ^*** در مقایسه با گروه کنترل

p<0.05 ⁺، p<0.001 ⁺⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین (بیمار)

اثر عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم کاتالاز در هیپوکمپ موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین: فعالیت آنزیم کاتالاز در هیپوکمپ گروه اسکوپولامین (بیمار) کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل نشان داد (p<0.001). فعالیت آنزیم کاتالاز در بافت هیپوکمپ گروه‌های اسکوپولامین تیمار شده با عصاره زیرفون در غلظت 225 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.05) و در غلظت‌های 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.01) افزایش معنی‌داری را نسبت به بیمار نشان داد (شکل 2).

شکل 2- اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم کاتالاز در هیپوکامپ موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.05 ^*، p<0.01 ^**، p<0.001 ^*** در مقایسه با گروه کنترل

p<0.05 ⁺، p<0.01 ⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین (بیمار)

اثر عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم کاتالاز در کورتکس موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین: فعالیت آنزیم کاتالاز در کورتکس گروه اسکوپولامین (بیمار) کاهش معنی داری نسبت به گروه کنترل نشان داد (p<0.001). فعالیت آنزیم کاتالاز در بافت کورتکس گروه‌های اسکوپولامین تیمار شده با عصاره زیرفون در غلظت 225 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.05) و در غلظت‌های 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.001) افزایش معنی‌داری را نسبت به بیمار نشان داد (شکل 3).

شکل 3- اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم کاتالاز در کورتکس موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.01 ^**، p<0.001 ^*** در مقایسه با گروه کنترل

p<0.05 ⁺، p<0.001 ⁺⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین (بیمار)

اثر عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم سوپر اکسید دیسموتاز (SOD) در هیپوکمپ موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین: فعالیت آنزیم SOD در هیپوکمپ گروه اسکوپولامین (بیمار) در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی داری نشان داد ( P<0.001). فعالیت آنزیم SOD در بافت هیپوکمپ گروه‌های اسکوپولامین تیمار شده با عصاره زیرفون در غلظت 225 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.01) و در غلظت‌های 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.001) افزایش معنی‌داری را نسبت به بیمار نشان داد (شکل 4).

اثر عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم SOD در کورتکس موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین: فعالیت آنزیم SOD در کورتکس گروه اسکوپولامین (بیمار) در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنی داری نشان داد ( P<0.001). فعالیت آنزیم SOD در بافت هیپوکمپ گروه‌های اسکوپولامین تیمار شده با عصاره زیرفون در غلظت 225 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.05) و در غلظت‌های 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در سطح (p<0.01) افزایش معنی‌داری را نسبت به بیمار نشان داد (شکل 5).

اثر عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم استیل کولین استراز (AChE) در هیپوکمپ موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین: فعالیت آنزیم AChE در هیپوکمپ گروه اسکوپولامین (بیمار) در مقایسه با گروه کنترل افزایش معنی داری نشان داد (P<0.01). تیمار گروه اسکوپولامین با غلظت‌های مختلف عصاره زیرفون، تنها در غلظت 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم کاهش معنی‌داری در مقایسه با گروه بیمار (P<0.01) مشاهده شد (شکل 6).

شکل 4- اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم SOD در هیپوکامپ موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.05 ^*، p<0.001 ^*** در مقایسه با گروه کنترل

p<0.01 ⁺⁺، p<0.001 ⁺⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین (بیمار)

شکل 5- اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم SOD در کورتکس موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.05 ^*، p<0.01 ^**، p<0.001 ^*** در مقایسه با گروه کنترل              p<0.05 ⁺، p<0.01 ⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین(بیمار)

شکل6- اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم AChE در هیپوکمپ موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.05 ^*، p<0.01 ^** در مقایسه با گروه کنترل                 p<0.01 ⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین(بیمار)

اثر عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم AChE در کورتکس موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین: فعالیت آنزیم AChE در کورتکس گروه اسکوپولامین( بیمار) تیمار شده با  عصاره زیرفون در غلظت 225 میلی‌گرم بر کیلوگرم کاهش معنی‌داری نسبت به گروه بیمار (P<0.01) نشان داد در حالی که همچنان افزایش معنی‌داری ( P<0.05 ) نسبت به گروه کنترل داشت. گروه بیمار تیمار شده با عصاره زیرفون با غلظت 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم در مقایسه با گروه بیمار کاهش معنی داری در فعالیت آنزیم AChE کورتکس ( P<0.001) نشان داد (شکل 7).

شکل 7. اثر تیمار عصاره گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم AChE در کورتکس موش های بزرگ آزمایشگاهی القاء شده با اسکوپولامین

گروه سالین + سالین (Control)، گروه عصاره  mg/kg300+  سالین (E300)، گروه اسکوپولامین + سالین (Sco)، گروه اسکوپولامین + عصاره  150 mg/kg(Sco+E150)، گروه اسکوپولامین + عصاره  225 mg/kg(Sco+E225)، گروه اسکوپولامین + عصاره  300 mg/kg(Sco+E300).

جهت آنالیز داده ها از آنالیز واریانس یک طرفه (آنوا) و برای مقایسه میانگین ها از تست تعقیبی توکی استفاده شد.

p<0.05 ^*، p<0.01 ^**، p<0.001 ^*** در مقایسه با گروه کنترل

p<0.01 ⁺⁺، p<0.001 ⁺⁺⁺ در مقایسه با گروه اسکوپولامین(بیمار)

بحث و نتیجه گیری

یادگیری یک پدیده عصبی است که طی آن موجودات زنده از طریق تمرین، رفتار خود را تغییر می دهند، در حالی که حافظه به روند ذخیره سازی آموخته­ها اطلاق می­شود (26).  از این رو یادگیری و حافظه از عالی ترین سطوح عملکردی سیستم عصبی مرکزی محسوب می شوند (13). علی رغم آنکه از دیرباز مطالعات و تحقیقات وسیعی بر روی حافظه صورت گرفته است، ولی از آنجایی که حافظه انواع بسیار گوناگونی دارد و مکانیسم های آن بخوبی شناخته نشده است، بنابراین همچنان جز مسائل مهم و مورد بحث و پژوهش است (37) . حافظه کاری مسئول پردازش و دست کاری اطلاعات در پروسه های شناختی بالاتر است. نشان داده شده که حافظه کاری در شمار گسترده ای از پروسه های شناختی مثل برنامه ریزی، حل مسئله و تمرین در مدرسه، خواندن و درک مفاهیم ریاضی، هوش نقش دارد (3). مطالعات بالینی قویا نقش کورتکس پیش پیشانی (PFC) را به عنوان مرکز اصلی پردازش فرایند های مرتبط با حافظه کاری تایید می کنند. آدرین اون و همکارانش نشان دادند در بیمارانی که کورتکس پیش پیشانی آن ها  آسیب دیده، اثرات اختلال در حافظه کاری را در  تست برج لندن از خود نشان داده اند (29). مطالعات واکین فوستر در قشر پیش پیشانی نشان دادکه در PFC چندین سیستم انتقال دهنده عصبی، به ویژه سیستم های دوپامینرژیک و کولینرژیک ارائه شده است (18). لیان رابینسون و همکارانش در سال 2011 نقش سیستم کولینرژیک بخصوص گیرنده های موسکارینی را در حافظه ادراکی، حافظه کاری و یادگیری تایید کردند (30). نشان داده شده است که آگونیست های سیستم کولینرژیک باعث تقویت یادگیری و حافظه می شوند ولی آنتاگونیست های آن باعث تخریب حافظه می شوند (9).

اسکوپولامین  یک آنتاگونیست کولینرژیک است که در انتقال استیل کولین در سیستم عصبی مرکزی اختلال ایجاد می‌کند (32). در پژوهش حاضر، از اسکوپولامین به منظور تخریب حافظه کاری در موش های بزرگ آزمایشگاهی نر استفاده شده است. در این پژوهش 10 روز پس از تزریق اسکوپولامین جهت ارزیابی عملکرد حافظه کاری و یادگیری موش ها از آزمون شناسایی شی جدید استفاده گردید. در نتایج بدست آمده از این آزمون مشاهده شد شاخص تبعیض در گروه بیمار نسبت به گروه کنترل کاهش یافته است که به خوبی اختلالات حافظه کاری را در موش های تیمار شده با اسکوپولامین را نشان می دهد. در همین راستا دودچنکو و همکارانش در سال 2004 به منظور بررسی وظایف مرتبط با حافظه کاری در جوندگان از تست رفتاری شی جدید استفاده کردند (10) . در مطالعه ی کوبایاشی و همکارانش در سال 2013 از آزمون شناسایی شی جدید برای سنجش حافظه کاری و یادگیری موش ها، استفاده شد. نتایج کار آنها نشان داد که شاخص تبعیض بعد از القای گابا در موشها کاهش می­یابد که نشان دهنده اختلال حافظه کاری در آنها می­باشد (23). آنالیز­های بیوشیمیایی در مطالعه حاضر نشان می­دهند که اسکوپولامین باعث کاهش فعالیت آنزیم­های آنتی اکسیدانی کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز و ایجاد استرس اکسیداتیو در بافت­های هیپوکامپ و کورتکس مغز موش­های گروه دریافت کننده شده است.  نتایج حاصل از پژوهش فان وهمکارانش در سال 2005 با بررسی تأثیر زنجیره قند الیگوساکارید اسیدی بر اختلال حافظه ناشی از اسکوپولامین در موش بزرگ آزمایشگاهی اینطور نشان می دهد که، اسکوپولامین در موش­های دریافت کننده آن موجب اختلال در حافظه، کاهش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی (سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز) و افزایش سطح مالون دی آلدئید در ناحیه هیپوکامپ شده است (15). ساکورای و همکارنش در سال 1998 بر پایه ایجاد حالت استرس اکسیداتیو از اسکوپولامین(دوز  mg/kg1) استفاده کردند. نتایج حاصل از کار آنها نشان داد اسکوپولامین به طور قابل توجهی سطوح استیل کولین استراز (AChE) و مالون دی آلدئید (MDA) را در قشر و هیپوکامپ افزایش می دهد، همچنین سطح آنزیم های آنتی اکسیدانی همانند SOD و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) در اثر تجویز اسکوپولامین کاهش می یابد (31). در این پژوهش به بررسی اثرات آنتی اکسیدانی عصاره گیاه زیرفون بر تخریب حافظه کاری القا شده با اسکوپولامین در موش های بزرگ آزمایشگاهی نر برای اولین بارپرداخته شده است.

ماتسودا و همکارانش در سال 2002 در بررسی اثر محافظ کبدی ، عصاره گیاه زیرفون (در دوز های25 و  100 میلی گرم بر کیلوگرم)  نشان دادن که ترکیبات مختلفی از جمله آلانین، آلفاپینن، اوژنول، موسیلاژ، اسیدفنولیک، پروآنتوسیانیدین، ترکیبات فنولی، الکل­های آروماتیک، آمینواسیدهایی مانند تیروزین و گلایسین، ترپینئول، توکوفرول در آن وجود دارد. با جداسازی هدایت شده با سنجش زیستی، شش گلیکوزید فلاونول مانند تیلروزوئید را از عصاره متانولی آن جدا کردند که خواص آنتی اکسیدانی بالایی را در برابر استرس اکسیداتیو نشان دادند (27). نتایج حاصل از درمان توسط عصاره ی زیرفون نشان داد، فلاونوئیدها مانندکورستین، ایزوکورستین، کاتچین و روتین و اسید های فنولیک مانند پروتوکاتکوئیک اسید و اپی کاتچین موجود در عصاره اتانولی گیاه زیرفون  مانع از کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در کورتکس و هیپوکامپ مغز موش می شود. همچنین، در روند افزایش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی در موشهای تیمار شده با زیرفون، دوز 300 اثرات افزایشی بهتری را نسبت به دوزهای 150 و 225 ازخود نشان می دهد.

بررسی های همتی و همکارانش در سال 2020  اثرات درمانی عصاره زیرفون (در دوزهای 50 ،100 ،200 و 400 میلی گرم برکیلوگرم) را بر آسیب بافت بیضه القا شده توسط کلرید کادمیوم در موشهای صحرایی نر بالغ نژاد ویستار نشان داده است. تیمار با عصاره اتانولی گیاه زیرفون با دوز 400 آثار ناشی از سمیت کلرید کادمیوم ایجاد شده در بافت بیضه را به میزان قابل توجهی کاهش می دهد. آنتی اکسیدان­های موجود در عصاره گیاه زیرفون با اثر محافظتی خود سطح رادیکال­های آزاد ناشی از کادمیوم را در بافت بیضه کاهش داد (20). همانطور که می­دانید، سیستم کولینرژیک نقش مهمی را در یادگیری و حافظه ایفا می­کند. بررسی­ها نشان داده­اند که اختلالات حافظه­ای که با سیستم کولینرژیک مغز در ارتباط هستند مانند اختلالات حافظه ناشی از مصرف داروی اسکوپولامین، را می­توان از طریق افزایش غلظت استیل­کولین در شکاف سیناپسی، درمان نمود. این عمل را می توان با استفاده از مهار کننده های استیل­کولین استراز (AChE) که از هیدرولیز استیل­کولین جلوگیری می­کنند، انجام داد (2). ترکیبات عصاره گیاه ختمی دارای خاصیت ضد التهابی، آنتی اکسیدانی و خاصیت مهار کنندگی آنزیم استیل کولین استراز می باشد و مطالعات نشان داد این ترکیبات سبب بهبود اختلالات حافظه اجتنابی درهیپو کامپ موش صحرایی نر نژاد ویستار می شوند (14). در مطالعه­ی پیش رو نیز فعالیت آنزیم استیل­کولین استراز در گروه دریافت کننده عصاره گیاه زیرفون به همراه دارو اسکوپولامین، کاهش معنی­داری را نسبت به گروه بیمار نشان داد. این نتایج نشان دهنده ی اثر مهاری ترکیبات موجود در گیاه زیرفون بر فعالیت آنزیم استیل کولین استراز می باشد.

در مطالعه حاضر به بررسی اثرات محافظت عصبی عصاره زیرفون در دوزهای مختلف، بر شاخص­های رفتاری، وضعیت آنتی­اکسیدانی در بافت کورتکس و هیپوکمپ پرداخته شد. نتایج حاصل از داده­های رفتاری نشان دهنده ی بهبود در اختلالات حافظه و یادگیری القا شده با اسکوپولامین در گروه درمان شده با عصاره زیرفون می­باشد. همچنین نتایج حاصل از شاخص های آنتی اکسیدانی در بافت کورتکس و هیپوکامپ حاکی از آن است که تیمار با عصاره زیرفون در غلظت های 225 و 300 موجب افزایش در میزان فعالیت آنزیم های CAT وSOD  می­گردد. عصاره زیرفون غنی از ترکیبات با خاصیت آنتی اکسیدانی است. همچنین نتایج نشان دهنده ی اثر مهاری عصاره زیرفون بر فعالیت آنزیم استیل­کولین استراز در دوز 300 می باشد. به طور کلی نتایج این پژوهش نشان می­دهد که مصرف عصاره زیرفون می­تواند به عنوان یک منبع طبیعی با خاصیت آنتی اکسیدانی قوی برای درمان اختلالات حافظه و یادگیری القا شده با اسکوپولامین باشد. بنابراین باتوجه­به خاصیت آنتی اکسیدانی و استفاده گسترده گل و برگ عصاره زیرفون در درمان بسیاری از بیماری­ها، بررسی بخش های دیگرگیاه و همچنین ماده موثره گیاه زیرفون و مطالعه مکانیسم های مولکولی در کاهش استرس اکسیداتیو ناشی از مصرف اسکوپولامین به سایر پژوهشگران علاقمند به این زمینه پیشنهاد می­گردد.

سپاسگزاری

بدینوسیله نویسندگان این مقاله از مجموعه علوم زیستی دانشگاه مازندران برای فراهم نمودن امکانات مورد نیاز و از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه مازندران به دلیل حمایتهای مالی کمال سپاسگزاری را دارند.