تغییرات کورتیزول و آنزیم های بیوشیمیایی در سلول های کبد تاسماهی استرلیاد (Acipenser ruthenus) تحت استرس دمایی در حضور القاکننده هایHSP

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان
سودا زارعی 1
حسین غفوری 1
لیلا وحدتی راد 1
تورج سهرابی 2
بهروز حیدری 1
1 گروه زیست شناسی، دانشگاه گیلان، رشت، ایران
2 انیستیتو تحقیقات بین‌المللی ماهیان خاویاری خزر، تحقیقات کشاورزی: سازمان آموزش و پرورش (AREEO)، رشت،
10.22034/jar.2024.2348
چکیده
مقدمه: کورتیزول یکی از مهمترین عوامل موثر در کنترل استرس است. از طرفی، مکانیسم‌ شناخته‌شده دیگری که از سلول‌ها در برابر استرس‌های گوناگون حفاظت می‌کند و با کورتیزول مرتبط می‌باشد پاسخ به شوک حرارتی است که منجر به القاء سنتز پروتئین‌‌های شوک حرارتی یا HSP می‌شود. با تقویت سیستم دفاعی ماهیان خاویاری در برابر استرس‌های محیطی مانند تنش دمایی، می‌توان ذخایر آن‌ها را حفظ کرد.

مواد و روش‌ها: در این مطالعه، سلول‌های بافت کبد ماهی خاویاری استرلیاد (Acipenser ruthenus) استخراج و در فلاسک کشت داده شد. از نوپال اندورانس (Pro-Tex®)، آمیگدالین و مشتق پیرازولی (SZ) به عنوان القاکننده‌های HSP (HSPi) استفاده شد. جهت زیست‌پذیری و تعیین دوز بهینه تست MTT (3- (4،5-دی متیل تیازول-2 یل)-2،5 دی فنیل تترازولیوم بروماید) صورت گرفت. فعالیت کورتیزول و آنزیم‌های بیوشیمیایی در سلول‌های کبد تحت تنش دمایی ( 18، 22 و °C 26) در حضور و عدم حضور ترکیبات HSPi آنالیز شد.

نتایج: سنجش MTT نشان داد سلول‌هایی که ترکیبات HSPi دریافت نمودند، موجب افزایش بقاء شدند. آن‌ها توانستند کورتیزول را به طور خاص به صورت جداگانه یا در ترکیب با استرس افزایش دهند. آمیگدالین فعالیت آنزیم‌های بیوشیمیایی را کاهش داد.

بحث و نتیجه‌گیری: فرار از آپوپتوز در شرایط استرس یک استراتژی اساسی برای بقای سلول می‌باشد. با توجه به نقش کورتیزول و ارتباط آن با HSP در شرایط استرس محیطی، می‌توان نتیجه گرفت که تیمار سلول‌ها با ترکیبات HSPi می‌تواند سلول‌ها را در برابر استرس مقاوم کرده و اثرات مضر ناشی از استرس را معکوس کند و در نهایت باعث افزایش بقاء شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله English

Changes in Cortisol and Biochemical Enzymes in Liver Cells of Sterlet Sturgeon (Acipenser ruthenus) under Temperature Stress in the Presence of HSP Inducers

نویسندگان English

sevda zarei 1
Hossein Ghafouri 1
leila vahdatiraad 1
tooraj sohrabi 2
behrooz heidari 1
1 Department of Biology, Faculty of Science, University of Guilan, Rasht, Iran
2 International Caspian Sturgeon Research Institute, Agricultural Research; Education and Extension Organization (AREEO), Rasht, Iran
چکیده English

Introduction: Cortisol is one of the most significant factors contributing to controlling stress. Additionally, another well-known mechanism for protecting cells against various stresses and linked to cortisol is the reaction to heat shock, which triggers the production of heat shock proteins (HSP). By strengthening sturgeon fish's defense system against environmental stress, such as temperature stress, their stocks can be preserved.

Materials and methods: In this study, sterlet sturgeon (Acipenser ruthenus) liver tissue cells were extracted and cultured in flasks. Nopal Endurance (Pro-Tex®), amygdalin, and pyrazole derivatives (SZ) were used as HSP inducers (HSPi). In order to determine the viability and optimal dose, MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) assay was performed. The activity of cortisol and biochemical enzymes was analyzed in liver cells under temperature stress (18, 22, and 26 °C) in the presence and absence of HSPi compounds.

Results: MTT assay showed that cells receiving HSPi compounds increased survival. They could increase cortisol levels alone or in combination with stress. Amygdalin reduced biochemical enzyme activity.

Discussion and conclusion: Escape from apoptosis under stress conditions is a basic strategy for cell survival. Considering the role of cortisol and its relationship with HSP in environmental stress conditions, it can be concluded that treating cells with HSPi compounds can make cells resistant to stress and the harmful effects caused by stress reverse and ultimately increase survival.

کلیدواژه‌ها English

Apoptosis
Amygdalin
Cell Stress
Heat Shock Protein
Sturgeon

تغییرات کورتیزول و آنزیم­های بیوشیمیایی در سلول­های کبد تاسماهی استرلیاد (Acipenser ruthenus) تحت استرس دمایی در حضور القاکننده­های HSP

سودا زارعی1، حسین غفوری1و2*، لیلا وحدتی­راد1، تورج سهرابی3 و بهروز حیدری1و2*

1 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، گروه زیست شناسی

2 ایران، رشت، دانشگاه گیلان، پژوهشکده حوضه آبی دریای خزر، گروه علوم دریایی

3 ایران، تهران، سازمان آموزش و تحقیقات کشاورزی (AREEO)، مؤسسه تحقیقاتی علوم شیلاتی کشور، انستیتو تحقیقات بین­المللی ماهیان خاویاری

تاریخ دریافت: 12/06/1402          تاریخ پذیرش: 27/09/1402

چکیده

کورتیزول یکی از مهمترین عوامل موثر در کنترل استرس است. از طرفی، مکانیسم­ شناخته­شده دیگری که از سلول­ها در برابر استرس­های گوناگون حفاظت می­کند و با کورتیزول مرتبط می­باشد، پاسخ به شوک حرارتی است که منجر به القاء سنتز پروتئین­های شوک حرارتی یا HSP می­شود. با تقویت سیستم دفاعی ماهیان خاویاری در برابر استرس­های محیطی مانند تنش دمایی، می­توان ذخایر آن­ها را حفظ کرد. در این مطالعه، سلول­های بافت کبد ماهی خاویاری استرلیاد (Acipenser ruthenus) استخراج و در فلاسک کشت داده شد. از نوپال اندورانس (Pro-Tex®)، آمیگدالین و مشتق پیرازولی (SZ) بعنوان القاکننده­های HSP (HSPi) استفاده شد. جهت زیست­پذیری و تعیین دوز بهینه تست MTT (3- (4،5-دی متیل تیازول-2 یل)-2،5 دی فنیل تترازولیوم بروماید) صورت گرفت. فعالیت کورتیزول و آنزیم­های بیوشیمیایی در سلول­های کبد تحت تنش دمایی ( 18، 22 و °C 26) در حضور و عدم حضور ترکیبات HSPi آنالیز شد. سنجش MTT نشان داد سلول­هایی که ترکیبات HSPi دریافت نمودند، موجب افزایش بقاء شدند. آن­ها توانستند کورتیزول را بطور خاص بصورت جداگانه یا در ترکیب با استرس افزایش دهند. آمیگدالین فعالیت آنزیم­های بیوشیمیایی را کاهش داد. فرار از آپوپتوز در شرایط استرس یک استراتژی اساسی برای بقای سلول می­باشد. با توجه به نقش کورتیزول و ارتباط آن با HSP در شرایط استرس محیطی، می‌توان نتیجه گرفت که تیمار سلول‌ها با ترکیبات HSPi می‌تواند سلول‌ها را در برابر استرس مقاوم کرده و اثرات مضر ناشی از استرس را معکوس کند و در نهایت باعث افزایش بقاء شود.

واژه­های کلیدی: آپوپتوز، آمیگدالین، استرس سلولی، پروتئین شوک حرارتی، ماهی خاویاری

* نویسندگان مسئول، پست الکترونیکی:   H.ghafoori@guilan.ac.ir و Bheidari@guilan.ac.ir

مقدمه

 

گرمایش جهانی و تغییرات آب و هوایی یکی از مشکلات زیست­محیطی جدی می­باشد. امنیت زیست­محیطی در دریای خزر از اهمیت­ بسیاری برخوردار است. این دریاچه بزرگ به دلیل ابعاد ژئوپلیتیکی و ژئواکونومیکی و ویژگی­های منحصر به فرد خود، بطور قابل توجهی در برابر چالش­های تغییرات آب و هوایی آسیب پذیر بوده است. در واقع، انزوای طبیعی دریای خزر شرایط گرمایش جهانی آن را منحصر به فرد می­کند (49). از سال 1982 تا 2019 میلادی دمای سطحی آب دریای خزر در ایران بین °C5 تا °C8 افزایش یافته است (32 و 50).

ماهیان خاویاری از ماهیان Anadromous بوده و جزء مهمترین گونه‌های دریای خزر می­باشند و جهت تخم­ریزی به رودخانه مهاجرت می­کنند (47)، ولی با عواملی همچون صید بی­رویه، کاهش زیستگاه و مکان تخم‌ریزی، آلودگی محیطی و هرگونه استرس (تغییرات دمایی حین مهاجرت بین آب­های لب­شیرین و لب­شور، شوری، pH، آلاینده­های صنعتی و سموم کشاورزی) مواجه هستند و مطابق اتحادیه بین­المللی حفاظت از طبیعت (IUCN: International Union for Conservation of Nature) 85% در خطر انقراض می­باشند و بهترین راه مقابله، تکثیر مصنوعی می­باشد (35 و 40). ماهی خاویاری استرلیاد (Sterlet)،Acipenser ruthenus ، یک ماهی آب­شیرین محسوب می­شود که در رودخانه­های بزرگ اوراسیا زندگی می­کند و یکی از ماهیان خاویاری بومی آسیا و اروپا می­باشد. نسبت به سایر گونه­های ماهیان خاویاری، کوچکترین عضو این خانواده بوده و وزن آن 20 کیلوگرم و طولش در نهایت بیش از یک متر نمی­باشد (48).

در ماهی­ها، مانند سایر موجودات گرمازا، دمای آب به طور قابل توجهی بر فرآیندهای متابولیکی و فیزیولوژیکی تأثیر می­گذارد و به عنوان "عامل اصلی اکولوژیکی" در نظر گرفته می­شود (23). زیرا افزایش یا کاهش دما از حد اپتیمم می‌تواند بر مکانیسم­های هموستازی گوناگون تأثیر گذارد. توانایی ماهی­ها برای تحمل شرایط دمایی مختلف تحت تأثیر عواملی مانند گونه، ژنتیک، سن، مراحل رشد، آمادگی فیزیولوژیکی و سابقه قبلی قرار گرفتن در معرض آن حرارت بستگی دارد. دما موجب تخریب اجزاء سلول می‌شود. شوک دمایی را یکی از مهم‌ترین عوامل استرس­زا در افزایش بیان پروتئین­های شوک حرارتی ( HSP: Heat shock proteins) و کورتیزول در حیوانات معرفی نمودند (36).

کورتیزول کورتیکواستروئید اصلی در ماهی­ها می­باشد و نقش اساسی برای مقابله با چالش­های محیطی دارد. تولید کورتیزول شامل محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- اینتررنالی (HPI: Hypothalamo–Pituitary–Interrenal) می­باشد. بطور خلاصه، تولید و آزادسازی کورتیزول در پاسخ به استرس در سلول­های بین کلیوی، واقع در رأس کلیه استخوانی رخ می­دهد و عمدتاً توسط هورمون آدرنوکورتیکوتروپیک (ACTH: Adrenocorticotropic hormone) کنترل می­گردد (4). در شرایط استرس کورتیزول تولید شده مکانیسم­های فیزیولوژیکی را فعال می­کند تا به ماهی اجازه دهد تا با عوامل استرس­زا مقابله کند (22). مشخص شده است که سطح کورتیزول در پاسخ به تغییرات حاد از جمله دما در بسیاری از عوامل زنده و غیر زنده افزایش می­یابد (3). همچنین هنگام مواجه ماهی با استرس دمایی و به دنبال آن تولید کورتیزول، تغییراتی در شاخص­های بیوشیمیایی کبد از جمله آسپارتات آمینوترانسفراز (AST)، آلانین آمینوترانسفراز (ALT)، آلکالین فسفاتاز (ALP) و لاکتات دهیدروژناز (LDH) رخ می­دهد (38).

در ماهی­ها، عوامل استرس­زا انواع واکنش­های استرس را در سطح سلولی فعال می­کنند. یکی از شناخته‌شده­ترین مکانیسم­هایی که سلول­ها را از تنش­های مختلف محافظت می­کند، پاسخ به شوک حرارتی است که منجر به افزایش تنظیم HSP می­شود (2 و 45). خانواده­ی HSP به طرق مختلف به تنش­های زیستی و غیرزیستی پاسخ می­دهند (26). رده‌های سلولی، کشت‌های اولیه سلول‌های مختلف و بافت‌های ماهی به‌ عنوان بیانگر HSP توصیف شده‌اند (44). مطالعات در مجموع نشان می‌دهند که بیان HSP در طیف گسترده‌ای از سلول‌ها و بافت‌های ماهی، توسط عوامل استرس‌زای بیولوژیکی مانند پاتوژن‌های عفونی و هم توسط عوامل استرس‌زای غیر­زنده مانند گرما، شوک سرما و آلاینده‌های محیطی تحت تأثیر قرار می­گیرد (25). همچنین مطالعات بسیاری ارتباط مستقیم بین HSP و کورتیزول را در شرایط استرس دمایی تأیید نموده­اند (11 و 25). ترکیبات بسیاری به صورت طبیعی یا سنتزی وجود دارند که به عنوان القاکننده­های HSP (HSPi: HSP inducer) شناخته شده و موجب افزایش بیان HSP می­گردند (37). یکی از این ترکیبات،Pro-Tex®  یک پیش­ساز مقاوم است که HSPs را در موجوداتی از جمله ماهیان خاویاری ایرانی القاء می­کند.Pro-Tex®  شکل محلول TEX-OE می­باشد و از Opuntia ficus indica  یا کاکتوس Nopal به دست می­آید (5). آمیگدالین (Amygdalin: AMG) HSPi دیگری هست که معمولا استفاده می­شود. بسیاری از گیاهان، از جمله زردآلو و آلو، حاوی این ترکیب طبیعی هستند (12). علاوه بر این، چندین مطالعه نشان داده­ است که ترکیبات مبتنی بر پیرازول می­تواند بیان HSP70 را با فعال کردن ژنHSF1 (Heat Shock Transcription Factor 1) تنظیم کند (14).

مطالعات اندکی در زمینه تاثیرات و پتانسیل ترکیبات HSPi در شرایط استرس در ماهی­ها خصوصا ماهیان خاویاری وجود دارد. مطالعه­ای توسط Vahdatiraad  و همکاران در سال 2023 انجام شد که در آن اثرات القایی ترکیب TEX-OE بر روی ماهی خاویاری گونه اوزون­برون (Acipenser stellatus) در مواجه با تنش شوری مورد بررسی قرار گرفت (46). همچنین در پژوهش دیگری اثرات القایی ترکیب TEX-OE بر بیان ژن HSP70 و پارامترهای پاسخ ایمنی در بچه تاسماهی ایرانی، Acipenser persicus، آلوده به Aeromonas hydrophila مورد مطالعه قرار گرفت (6).

رده سلولی تکنیک ارزشمندی برای مطالعه استرس، سم­شناسی، سرطان­زایی، تنظیم ژنتیکی و بیان می­باشد (31). به عنوان مثال، سلول­های کبدی عمدتاً مسئول تنظیم متابولیک و سم­زدایی هستند (43). سیستم­های کشت سلولی پتانسیل جایگزینی حیوان به عنوان سیستم­های مدل برای اندازه­گیری­های استرس را دارا می­باشند (20). هدف از مطالعه حاضر، بررسی پتانسیل HSPi در کاهش استرس ناشی از تغییرات دمایی در سلول‌های کبد ماهی خاویاری استرلیاد و افزایش بقاء می­باشد. به طور خاص، اثرات HSPi، از جمله Tex-OE و آمیگدالین، همراه با یک القاکننده HSPs مبتنی بر پیرانو- پیرانازول جدید سنتز شده به نام SZ، بر روی تغییرات آنزیم‌های بیوشیمیایی کبد و سطح کورتیزول ارزیابی خواهد شد. در نهایت هدف اصلی این پژوهش، ارائه­ی بینشی در مورد مکانیسم‌های نهفته در اثرات حفاظتی القای HSP و توسعه استراتژی‌های موثر برای کاهش استرس ناشی از تغییرات محیطی بر روی گونه‌های ماهیان خاویاری می­باشد.

مواد و روشها

سنتز 4،4- (1،4- فنیلن) بیس (5-آمینو-3-متیل-1،4- دی هیدروپیرانو [2،3-c] پیرازول-6-کربونیتریل؛ SZ): این ترکیب از واکنش mmol 2 پیرازولون، mmol 1/2 مالونیتریل و mmol 1 ترفتالدهید در حضور محلول 5 درصد سود (NaOH) به عنوان کاتالیزور در حلال اتانول و در شرایط رفلاکس سنتز شد (41). ساختار ترکیب سنتز شده با روش­های FT-IR و NMR تأیید گردید (داده­های تکمیلی- بخش 1). وزن مولکولی ترکیب سنتزی g/mol 427 بود.

جداسازی سلول از بافت کبد ماهی خاویاری استرلیاد: یک تاسماهی استرلیاد پرورشی به وزن 28/15 گرم و طول تقریبا 18 سانتی­متر از موسسه تحقیقات بین­المللی تاس­ماهیان خزر برای این مطالعه استفاده شد، سلول­های بافت کبد (داده­های تکمیلی- بخش 2) در محیط کشتL15  (تهیه شده از انستیتو پاستور ایران) حاوی سرم جنین گاو ( FBS: Fetal bovine serum) (تهیه شده از شرکت Sigma- Aldrich) با غلظت نهایی10%، در °C22 و 5 % CO2، کشت داده ­شدند. قبل از شروع کار، محیط L15 ناقص، در داخل حمام آب گرم °C 37 قرار داده شد. در زیر هود لامینار و در شرایط استریل به محیط ناقص، 10% FBS، 1% محلول پنی­سیلین/ استرپتومایسین (Pen-Strep: penicillin/streptomycin؛ تهیه شده از شرکت Sigma- Aldrich) و 1% آمفوتریسین B (Amphotericin B؛ تهیه شده از شرکت Sigma- Aldrich) اضافه شد تا محیط کامل تهیه گردد. سپس یک تکه از بافت جدا شده در شرایط کاملا استریل به محیط کشت کامل موجود در یک فالکون اضافه و به آرامی چند بار با پیپت مخلوط و محتوا به درون فلاسک T25 cm2 منتقل شد. روز بعد، محیط کشت درون فلاسک، باL15  کامل جدید، تعویض گردید. سلول­ها هر روزه از لحاظ آلودگی و همچنین رشد در زیر میکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفتند. پس از 15-10 روز، هنگامی که سلول­ها به اندازه 90-80% کف فلاسک را پوشش دادند و کاملا با یکدیگر تلاقی (Confluency) داشتند آماده تریپسینه شدن بودند. بدین منظور محیط کشت از فلاسک خارج  و سلول­های چسبیده به کف فلاسک، دو بار با بافر فسفات سالین (PBS: Phosphate-buffered saline, pH= 7.4) شستشو داده شدند. سپس بعد از اضافه کردن تریپسین-EDTA (25/0% تهیه شده از شرکت Sigma-Aldrich) به سلول­های تک­لایه در تمام فلاسک پخش گردید و فلاسک به مدت 3 دقیقه در انکوباتور °C22 قرار داده شد. در نهایت با زدن چند ضربه به دیواره فلاسک، سلول­های چسبیده به کف فلاسک کنده شدند. البته سلول­های چسپنده را می­توان با سل اسکرپر (cell scraper) بطور فیزیکی نیز جدا نمود. در مرحله بعد، محیطL15  کامل به فلاسک اضافه شد. سرم موجود در محیط کامل باعث غیرفعال شدن تریپسین می­شود. محیط کشت، با استفاده از پیپت پاستور، چندین بار مخلوط شد تا سلول­ها کاملا از یکدیگر جدا گردند. پس از سانتریفیوژ سلول­ها (rpm 3000 به مدت 5 دقیقه)، سوپرناتانت خالی و محیط کشت کامل به رسوب سلولی ته فالکون اضافه شد و با پیپت پاستور به آرامی هموژن گردید. تعداد سلول­ها با استفاده از لام نئوبار شمارش شدند. تعداد مناسبی از سلول­ها برای آزمایش­های بعدی به ظرف مورد نظر منتقل گردیدند (51 و 15).

تعیین دوز بهینۀ ترکیبات HSPi: ترکیب تجاری نوپال اندورانس (Nopal Endurance؛ تهیه شده از Manufactured for source naturals, INC, BOX 2118, SANTA CRUZ) به عنوان کنترل مثبت استفاده گردید. همچنین آمیگدالین (به صورت پودر ازSigma-Aldrich خریداری شد)، یک ترکیب شیمیایی طبیعی با شناسه پاب‌کم ۳۴۷۵۱ است، که جرم مولی آن g/mol ۴۲۹/۴۵۷ می‌باشد. غلظت­های مختلفی از ترکیب نوپال اندورانس، آمیگدالین و ترکیب سنتز شده (SZ) جهت تست MTT انتخاب گردید (51).

سنجش MTT، یک روش رنگ­سنجی کمی است که اساس آن بر پایهء احیای آنزیمی کریستال­های زرد رنگ محلول در آب و تشکیل کریستال ارغوانی رنگ و نامحلول فورمازان می­باشد. احیایMTT، بوسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی و تنها در سلول­های زنده رخ می­دهد. بلورهای فورمازان در حلال­های آلی چون ایزوپروپانول و دی متیل سولفوکساید (DMSO: Dimethyl sulfoxide؛ تهیه شده از شرکت Merck)، قابل حل می­باشند که با سنجش میزان جذب نوری آن با دستگاه اسپکتروفتومتر می­توان تعداد سلول­های زنده را تعیین نمود. در این روش، برخلاف سایر روش­ها­، مراحل شستشو و جمع­آوری سلول که اغلب باعث از دست رفتن تعدادی از سلول­ها و افزایش خطای کار می­شوند، حذف شده­اند و تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلولی تا خواندن نتایج با فوتومتر، در یک میکرو­پلیت انجام می­شوند. لذا تکرار­پذیری، دقت و حساسیت آزمایش، بالاست. روش کار بدین صورت است که سلول­های چسپنده پس از تریپسین کردن، تعداد cell/ml 105×5 شمارش نموده و در چاهک­­های پلیت­ 96 خانه­ای ریخته شد و با محیط کشت کامل مخلوط گردید و در شرایط انکوباتور که قبلا ذکر شد به مدت 24 ساعت انکوبه شد، پس از 24 ساعت، چاهک­ها تخلیه شدند و با غلظت­های مختلف نوپال اندورانس (صفر، 50، 100، 200، 400، 800 و mM 1600)، ترکیب آمیگدالین (صفر، 25/1، 5/2، 5، 10، 20، 40 و mM 80) و ترکیب سنتزی SZ (صفر، 5، 10، 20، 40، 80 و Mµ 160) بهمراه محیط کشت DMEM حاوی 1% FBS و آنتی­بیوتیک­ها تیمار و در انکوباتور °C 22 و 5 درصدCO2  نگهداری شدند. حجم نهایی در هر چاهک 200 میکرولیتر و هر غلظت سه بار تکرار شد. بعد از 24 ساعت، محتوای چاهک­ها خالی شدند و محیط کشت بدون FBS با µl 10 از محلول MTT (mg/ml 5) به درون هر چاهک اضافه گردید (حجم نهایی در هر چاهک µl 100 که 10% آن شامل محلول MTT و 90% محیط کشت بود). در گام بعد پس از 40/2 الی 4 ساعت انکوباسیون در دمای °C 22 محتوای چاهک­ها خالی شد. محصول فورمازان تولید شده به دلیل نامحلول بودن، با افزودن ماده حلالی مانند DMSO ( µl100)، به مدت 30 دقیقه بر روی شیکر قرار گرفت تا به حالت محلول درآید. در نهایت جذب نوری محلول، در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزا­ریدر قرائت و میزان زنده­مانی (طبق فرمول 1) محاسبه شد (27 و 24).

فرمول (1):

تیماربندی در استرس دمایی: برای انجام استرس دمایی ابتدا تعداد cell/ml 105×5، در چاهک­های پلیت 24 خانه­ای ریخته شد و پس از 24 ساعت، پس از تعویض محیط کشت (حاوی DMEM، 1% FBS، آمفوتریسین B 1% و Pen-Strep 1%)، در یکسری از چاهک­ها سلول­ها تنها با ترکیبات HSPi با دوز­های بهینه تعیین شده به مدت 24 ساعت در دمای °C 22 تیمار شدند. سپس، پس از تعویض محیط کشت تمام چاهک­ها (حاوی DMEM، 1% FBS، آمفوتریسین B 1% و Pen-Strep 1%)، یکسری در دمای °C 18، یکسری در دمای °C 22 و یکسری در دمای °C 26، 5 درصدCO2  و 95% رطوبت به مدت 24 ساعت نگهداری شدند. گروه­بندی بدین صورت بود: (1. شاهد (دمای  °C 22: T22)، 2. گروه­های سلولی که ترکیبات HSPi دریافت نمودند و در دمای °C 22 به مدت 24 ساعت انکوبه شدند: HSPi+T22)، (3. گروه دمایی °C 18: T18، 4. گروه­های سلولی که ابتدا ترکیبات HSPi دریافت نمودند و به مدت 24 ساعت در دمای °C 22 انکوبه شدند و پس از آن چاهک­ها تخلیه شد و با محیط کشت حاوی 1% FBS حاوی آنتی­بیوتیک­ها، در دمای °C 18 به مدت 24 ساعت قرار گرفتند: HSPi+T18)، ( 5. گروه دمایی °C 26: T26، 6. گروه­های سلولی که ابتدا ترکیبات HSPi دریافت نمودند و به مدت 24 ساعت در دمای °C 22 انکوبه شدند و پس از آن چاهک­ها تخلیه شد و با محیط کشت حاوی 1% FBS حاوی آنتی­بیوتیک­ها، در دمای °C 26 به مدت 24 ساعت قرار گرفتند: HSPi+T26). تمامی گروه­ها با 3 تکرار انجام شد. در نهایت، پس از انجام تیمار­ سلول­ها با تریپسین از کف فلاسک جدا و سانتریفیوژ ( rpm 3000 در 5 دقیقه) شد. رسوب سلول­ها جهت تست­های بعدی مورد استفاده قرار گرفت. حجم نهایی در هر چاهک 500 میکرو­لیتر بود.

سنجش پارامترهای متابولیک: سطوح کورتیزول با توجه به دستورالعمل­های توصیه شده سازنده کیت (Enzyme-Linked Immune Sorbent Assays; Nanjing, China) اندازه­گیری شد. تغییرات رنگ به روش اسپکتروفتومتری با دستگاه الایزاریدر (450 نانومتر) شناسایی شد (33).

فعالیت آنزیمی AST (EC 2.6.1.1)، ALT (EC 2.6.1.2)، ALP (EC 3.1.3.1) و (EC 1.1.1.27)LDH  در سلول­­های کبد مطابق پروتکل ارائه شده با کیت (MyBioSource, USA) بررسی شد (10).

از جمله روش­های تعیین غلظت پروتئین، روش بردفورد است که اساس آن تفاوت در جذب نور در طول موجnm 630 است (13). با افزایش غلظت پروتئین محلول، رنگ آبی حاصل بیشتر شده و میزان جذب نوری آن نیز افزایش می­یابد.

تجزیه و تحلیل­های آماری: نمودارها با استفاده از نرم­افزار GraphPad Prism 8 ترسیم گریده است. تجزیه و تحلیل­های آماری به کمک نرم‌افزار SPSS 23 انجام شد. ابتدا با استفاده از آزمونKolmogorov – Smirnov  نرمال بودن داده­ها تأیید گردید (sig ˃ 0.05). سپس تجزیه و تحلیل­ها با آزمون یک‌طرفه‌ی واریانس (One-way ANOVA) و تست کمکی دانکن انجام شدند. تمامی گروه­های تیماری با سه تکرار انجام شدند و داده‌ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (Mean± standard error of the mean; SEM) ارائه شدند (P < 0.0001). در نهایت تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA: principal component analysis) برای ارزیابی اجزای اصلی بین پارامترهای مورد مطالعه و تیمارهای مختلف برای استرس­ دمایی انجام شد. همچنین با همبستگی پیرسون ارتباط بین پارامترها بررسی گردید.

نتایج

بررسی زنده­مانی سلول­های کبد تحت تیمار با ترکیبات HSPi: سلول­های کبد با غلظت­های مختلفی از نوپال اندورانس (شکل 1)، آمیگدالین (شکل 2) و ترکیب سنتزی SZ (شکل 3) تیمار شدند (P < 0.0001). مقدار زنده­مانی در ترکیب نوپال اندورانس در دوزهای mM 50 و 100 مشابه گروه شاهد (100%) بود ولی در دوز mM 1600 (33/80%) 20% مرگ سلولی مشاهده شد (P < 0.0001). آمیگدالین و ترکیب سنتزی SZ با افزایش دوز، مقدار زنده­مانی را در مقایسه با گروه شاهد افزایش دادند و سمیتی روی سلول­های تیماری نداشتند (P < 0.0001). طبق نتایج به دست آمده از تست MTT، غلظت mM 800 (67/90% بقاء) از ترکیب نوپال اندورانس (N800)، غلظت mM 80 (33/144%) از ترکیب آمیگدالین (A80) و غلظت µM 80 (66/129%) از ترکیب SZ (SZ80) به عنوان دوزهای بهینۀ HSPi انتخاب شدند و جهت انجام آزمایش­های بعدی این دوزها استفاده گردیدند.

ارزیابی زیست­پذیری سلول­های کبد در تنش دمایی در حضور و عدم حضور دوزهای بهینه ترکیبات HSPi: سلول­های کبد تحت تیمار در دمای °C 22 به عنوان گروه شاهد (T22) و دماهای °C 18 (T18) و °C 26 (T26) گروه استرس در نظر گرفته شدند و در حضور و غیاب ترکیبات HSPi با دوزهای بهینه آن­ها تیمار شدند (شکل 4: P < 0.0001).

 

شکل 1- بررسی زنده­مانی ترکیب نوپال اندورانس (Tex-OE) در سلول­های کبد استرلیاد. در غلظت mM 800، 90% سلول­ها زنده بودند. هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار داشتند.

 

شکل 2- ارزیابی زنده­مانی ترکیب آمیگدالین در سلول­های کبد استرلیاد. با افزایش دوز مقدار زنده­مانی افزایش چشمگیری داشت. هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار نشان دادند.

شکل 3- مقایسه زیست­پذیری ترکیب سنتزی SZ در سلول­های کبد. با افزایش دوز زنده­مانی نیز افزایش پیدا کرد. هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار دارند.

بقای سلولی در دمای °C 18 (66/97) نزدیک به گروه شاهد (100%) بود ولی در دمای °C 26 (90%)، 10 % مرگ سلولی مشاهده شد. سلول­هایی که ابتدا HSPi را دریافت نمودند و سپس در معرض استرس دمایی قرار گرفتند افزایش چشم­گیری در زنده­مانی سلول­ها داشتند. بیشترین بقاء مربوط به گروه­هایی بود که آمیگدالین دریافت کرده بودند (127%A80+T18: ، 132% A80+T22: و 117% A80+T26:).

تغییرات کورتیزول: سطوح کورتیزول در سلول­های کبد تیماری با دوز­های بهینه HSPi در سه دمای 18، 22 و °C 26 نوساناتی داشت (شکل 5).

 

 

 

شکل 4- مقایسه زنده­مانی سلول­های کبد در حضور ترکیبات HSPi تحت استرس دمایی. دوازده گروه در نظر گرفته شد: 1. گروه شاهد بدون تیمار در دمای °C 22 (T22)، گروه­های حاوی HSPi در دمای °C 22 شامل: ( 2. mM 80 آمیگدالین (A80+T22)، 3. µM80 SZ (SZ80+T22)، 4. mM 800 نوپال اندورانس (N800+T22))، 5. سلول­های بدون تیمار HSPi در دمای °C 18(T18)، گروه­های حاوی HSPi ابتدا در دمای °C 22 انکوبه شدند پس از 24 ساعت، به دمای °C 18 منتقل شدند شامل: ( 6. mM 80 آمیگدالین (A80+T18)، 7. µM80 SZ (SZ80+T18)، 8. mM 800 نوپال اندورانس (N800+T18))، 9. سلول‌های بدون تیمار HSPi در دمای °C 26 (T26)، گروه‌های حاوی HSPi در دمای °C 22 انکوبه شدند، پس از 24 ساعت، آنها به دمای °C 26 منتقل شدند شامل: ( 10. mM 80 آمیگدالین (A80+T26)، 11. µM80 SZ (SZ80+T26)، 12. mM 800 نوپال اندورانس (N800+T26)). حضور القاکننده­های HSP موجب کاهش استرس و افزایش زنده­مانی در سلول­های کبد گردید. بهترین عملکرد در حضور آمیگدالین مشاهده شد (P˂0.0001). هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار داشتند.

 

در مقایسه با گروه شاهد (گروه T22) سطح فعالیت در گروه­های T26 و T18 (بدون ترکیبات HSPi) بالا بود. سطوح تغییرات کورتیزول در گروه­های دریافت­کننده ترکیبات HSPi در هر سه دمای مورد مطالعه متفاوت بود. به طور کلی سلول­هایی که ابتدا ترکیبات HSPi دریافت کردند و سپس در معرض تنش­های دمایی قرار گرفتند افزایش چشمگیری در فعالیت کورتیزول نسبت به گروه­هایی که بدون ترکیبات HSPi بودند، نشان دادند (P < 0.0001). گروه­های تیماری در دمای °C 26 نسبت به دو دمای دیگر فعالیت کورتیزول بیشتری داشتند. تغییرات در گروه­های دمای °C 18 اندکی بالاتر از گروه­های دمای °C 22 بود (P < 0.0001). تغییرات آمیگدالین (A80+T18) و نوپال اندورانس (N800+T18) در دمای °C 18 مشابه بود ولی ترکیب سنتزی (SZ80+T18) فعالیت کمتری نشان داد. الگوی تغییرات گروه­های دریافت کننده HSPi در دمای °C 22 نیز مشابه دمای °C 18 بود. گروه­های دریافت کننده HSPi در دمای °C 26 تغییرات مشابهی نسبت به هم داشتند (P < 0.0001).

 

 

شکل 5- فعالیت ویژه تغییرات هورمون کورتیزول در سلول­های کبدی تیمار شده با القاکننده­ها در استرس دمایی. SZ80، A80 و N800 به عنوان ترکیبات HSPi در نظر گرفته شدند. در حضور القاکننده­ها فعالیت کورتیزول در دمای °C 26 بیشترین مقدار بود. هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار نشان دادند.

 

 

بررسی آنزیم­های بیوشیمیایی: فعالیت آنزیم­های AST، ALT، ALP و LDH در سلول­های تحت تیمار تغییرات دمایی در حضور و عدم حضور ترکیبات HSPi ارزیابی شد (جدول 1: P < 0.0001). الگوی تغییرات هر چهار آنزیم مشابه بود. کمترین سطح فعالیت در گروه­هایی که در دمای °C 22 تیمار شدند (دمای شاهد) مشاهده شد. گروه­هایی که در دماهای 18 و °C 26 (در حضور و عدم حضور ترکیبات HSPi) تیمار شدند در مقایسه با گروه­های قرار گرفته در دمای °C 22 سطوح فعالیت آنزیمی بالاتری داشتند. در مقایسه با گروه شاهد (T22)، بیشترین سطح فعالیت آنزیمی در گروه T26 مشاهده شد (209/2 :AST، 565/1 :ALT، 791/2 :ALP و U/g 35/11 :LDH). در بین گروه­های دریافت­کننده ترکیبات HSPi (در هر سه دمای مورد مطالعه)، بیشترین سطح فعالیت در گروه­های دریافت­کننده ترکیب SZ80 مشاهده شد. بطور کلی سلول­هایی که ابتدا آمیگدالین (A80) دریافت نمودند و سپس در معرض استرس دمایی قرار گرفتند سطوح فعالیت آنزیمی کمتری نسبت به سایر ترکیبات HSPi داشتند. ترکیب نوپال اندورانس (N800) تغییراتی نزدیک به آمیگدالین (A80) نشان داد ولی اندکی از آن بالاتر بود (P < 0.0001).

تغییرات پروتئین تام نیز در گروه­های تیماری بررسی شد (شکل 6: P < 0.0001). بیشترین مقدار پروتئین در گروه­های N800+T18 و N800+T22 مشاهده گردید. الگوی تغییرات بین گروه­های تیماری در دماهای 18 و °C 22 مشابه بود. سطح پروتئین در گروه­های °C 26 مشابه یکدیگر و بالاتر از گروه­های تیماری در دمای 18 و °C 22 قرار داشت (P < 0.0001).

 

 

جدول 1- فعالیت ویژه آنزیم­های بیوشیمیایی در سلول­های کبد گونه استرلیاد تحت تیمار دمایی. بیشترین سطح فعالیت آنزیم در دمای °C­26 مشاهده شد. هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار نشان دادند.

Groups*

 

Analysis of Biochemical parameters (Unit per g total protein)

 

AST (U/g)

ALT (U/g)

ALP (U/g)

LDH (U/g)

T18 (stress)

 

1.717 ± 0.082c

1.140 ± 0.099c

2.083 ± 0.048b

8.155 ± 0.504d

 

A80 + T18

 

1.126 ± 0.071g

0.852 ± 0.040e

1.814 ± 0.083cd

7.223 ± 0.364ef

 

SZ80 + T18

 

1.535 ± 0.063d

1.266 ± 0.085b

2.034 ± 0.100b

8.874 ± 0.402c

 

N800 + T18

 

1.340 ± 0.066ef

1.042 ± 0.046d

1.997 ± 0.076b

7.690 ± 0.234e

 

T22 (Control)

 

0.995 ± 0.059h

0.617 ± 0.071g

1.283 ± 0.054g

5.524 ± 0.405g

 

A80 + T22

 

1.037 ± 0.055h

0.733 ± 0.096f

1.339 ± 0.054f

6.865 ± 0.345f

 

SZ80 + T22

 

1.597 ± 0.092d

1.232 ± 0.080b

2.055 ± 0.078b

7.920 ± 0.200e

 

N800 + T22

 

0.983 ± 0.071h

0.846 ± 0.053e

1.870 ± 0.086cd

7.230 ± 0.349ef

 

T26 (stress)

 

2.209 ± 0.123a

1.565 ± 0.051a

2.791 ± 0.079a

11.35 ± 0.529a

 

A80 + T26

 

1.299 ± 0.066f

0.737 ± 0.079f

1.614 ± 0.053e

7.400 ± 0.665e

 

SZ80 + T26

 

2.048 ± 0.092b

1.281 ± 0.081b

1.988 ± 0.075c

9.950 ± 0.196b

 

N800 + T26

 

1.424 ± 0.097e

0.855 ± 0.049e

1.652 ± 0.096d

8.357 ± 0.494cd

 

*دوازده گروه در نظر گرفته شدند: 1. گروه شاهد بدون تیمار در دمای °C 22 (T22)، گروه­های حاوی HSPi در دمای °C 22 شامل: ( 2. mM 80 آمیگدالین (A80+T22)، 3. µM80 SZ (SZ80+T22)، 4. mM 800 نوپال اندورانس (N800+T22))، 5. سلول­های بدون تیمار در دمای °C 18(T18)، گروه­های حاوی HSPi ابتدا در دمای °C 22 انکوبه شدند پس از 24 ساعت، به دمای °C 18 منتقل شدند شامل: ( 6. mM 80 آمیگدالین (A80+T18)، 7. µM80 SZ (SZ80+T18)، 8. mM 800 نوپال اندورانس (N800+T18))، 9. سلول‌ها بدون تیمار در دمای °C 26 (T26)، گروه‌های حاوی HSPi در دمای °C 22 انکوبه شدند، پس از 24 ساعت، آن­ها به دمای °C 26 منتقل شدند شامل: ( 10. mM 80 آمیگدالین (A80+T26)، 11. µM80 SZ (SZ80+T26)، 12. mM 800 نوپال اندورانس (N800+T26)).

 

 

جدول 2- ارزیابی همبستگی پیرسون بین پارامترهای سنجش ­شده در استرس دمایی. آنزیم­های بیوشیمیایی با هم دارای همبستگی مثبت بودند.

 

 

Viability

Cortisol

AST

ALT

ALP

LDH

Total protein

Viability

 

1

 

 

 

 

 

 

Cortisol

 

0.236

1

 

 

 

 

 

AST

 

-0.258

-0.064

1

 

 

 

 

ALT

 

-0.291

-0.129

0.827**

1

 

 

 

ALP

 

-0.387*

-0.116

0.758**

0.824**

1

 

 

LDH

 

-0.273

0.118

0.846**

0.773**

0.749**

1

 

Total protein

 

-0.427**

0.359*

0.076

0.057

0.138

0.098

1

         * در سطح کمتر از 05/0 معنی­دار است (2-tailed). ** در سطح کمتر 01/0 معنی­دار است (2-tailed).

 

شکل 6- سطح تغییرات پروتئین تام در سلول­های کبد تحت تیمار دمایی. گروه­های N800+ T18 و N800+ T22 بیشترین مقدار پروتئین تام را داشتند. هر ستون نشان­دهنده میانگین داده‌ها ± خطای استاندارد میانگین می­باشد. ستون­ها دارای حداقل یک حرف مشترک با آزمون دانکن در سطح کمتر از (P ˂ 0.0001) تفاوت معنی­دار نشان دادند.

 

تجزیه و تحلیل مولفه­های اصلی (PCA) در استرس دمایی: تجزیه مولفه­ی اصلی برمبنای 7 متغیر و 36 تیمار انجام شد. مولفه­های اصلی اول، دوم و سوم بترتیب 98/50، 08/20 و 60/16 درصد از تغییرات را بیان نمودند. متغیر­هایی با امتیاز بالاتر از 6/0 در مولفه­های اول، دوم و سوم برای تفسیر مورد استفاده قرار­گرفت. تمامی متغیرهای اندازه­گیری شده در استرس دمایی در مولفه اول نقش مهمی در تعیین ارتباط بین تیمارها و متغیرهای مورد آزمون داشتند (شکل 7). ارتباط و همبستگی متغیرها با آزمون همبستگی پیرسون بررسی شد (جدول 2). آنزیم­های بیوشیمیایی (AST، ALT، ALP و LDH) با همدیگر دارای همبستگی مثبتی بودند (P < 0.01). از طرفی زنده­مانی با آنزیم ALP (P < 0.05) و پروتئین تام (P < 0.01) همبستگی مثبت نشان داد. کورتیزول با پروتئین تام دارای همبستگی مثبت بود (P < 0.05).

 

شکل 7- تجزیه و تحلیل مولفه­های اصلی در استرس دمایی. مولفه­های اصلی اول، دوم و سوم در مجموع 67/87% از تغییرات را بیان نمودند. تمامی متغیرهای اندازه­گیری شده در استرس دمایی در مولفه اول نقش مهمی در تعیین ارتباط بین تیمارها و متغیرهای مورد آزمون داشتند.

بحث و نتیجه گیری

یکی از بهترین مکانیسم­های شناخته­شده که از سلول­ها در برابر استرس­های گوناگون حفاظت می­کند پاسخ به شوک حرارتی است که منجر به القای سنتز پروتئین­­های شوک حرارتی یا HSP می­شود (34 و 39). سلول‌های سالم وقتی با استرسی به چالش کشیده می‌شوند، فعالیت فاکتور شوک حرارتی ۱ (HSF1) را تنظیم می‌کنند تا از ساختار و عملکرد پروتئین طبیعی آن محافظت کنند. HSF1 بیان گروهی از شوک حرارتی القایی (HSPs) مانند HSP70 و HSP90 را تحریک می­کند تا پروتئین‌های آسیب‌دیده را به ساختار اصلی خود بازگرداند یا حذف پروتئین‌ها را تحریک می­نماید (29). همچنین مطالعات گذشته ارتباط بین HSP70 و فاکتور 2 مربوط به فاکتور هسته ای اریتروئید 2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2: Nrf2)، را که وظیفه­ی آن کمک به تنظیم کار پروتئین­های آنتی­اکسیدانی است و می­تواند به محافظت در برابر استرس خصوصا آسیب اکسیداتیو کمک کند، تأیید کرده­اند (30). در مطالعه حاضر، تأثیر Tex-OE، آمیگدالین و SZ مبتنی بر پیرانو- پیرانازول جدید سنتز شده به عنوان القاکننده‌های HSP در کاهش اثرات منفی دما و زنده­مانی سلول‌های کبد تاسماهی استرلیاد ارزیابی شد. با استفاده از روش MTT، مشخص شد که دمای °C 26 در مقایسه با دماهای 22 و °C 18 می­تواند بر زنده­مانی سلول­های استرلیاد تا حدودی تأثیر منفی بگذارد و منجر به مرگ سلولی گردد. در یک پژوهشی، گونه pikeperch  (Sander lucioperca) تحت تنش دمایی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج کلی نشان داد که آبشش‌های pikeperch به تنش گرمایی حساس بوده و pikeperch از طریق تنظیم سیستم آنتی‌اکسیدانی و بیان ژن‌های HSP و ژن‌های دخیل در متابولیسم انرژی به استرس گرمایی پاسخ داده و اثرات تنش دمایی را بهبود می­بخشند (16). ترکیبات طبیعی یا مصنوعی به عنوان ترکیبات HSPi وجود دارند که می­توانند بیان HSP را افزایش دهند. آن­ها فاکتورهای رونویسی شوک حرارتی (HSFs) را فعال می­کنند و موجب القاء و افزایش بیان HSP می­شوند (37). چندین مطالعه گزارش کرده­اند که Tex-OE بیان HSP70 و HSP90 را در ماهی و صدف افزایش می­دهد (6، 9 و 46). همچنین طبق مطالعات گذشته با این­که ترکیبات آمیگدالین (1) و مشتقات پیرازولی (41) خاصیت ضد­سرطانی دارند با این حال، هیچ مطالعه­ای در رابطه با اثر آمیگدالین و ترکیبات مشتق شده از پیرانوپیرانازول بر بیان HSP در ماهیان خاویاری وجود ندارد.

یکی از راهکارهای حفظ جمعیت ماهیان در حال انقراض، تکثیر و پرورش آن­ها در مراکز پرورشگاهی و رهاسازی آن­ها به آب شیرین است (19). چالشی که در این رویکرد وجود دارد این است که ماهی­ها در شرایط بهینه در مراکز تکثیر می­یابند اما پس از رهاسازی در معرض مختلف شرایط فیزیکی و شیمیایی آب قرار می­گیرند (21). بنابراین، اولین جنبه استفاده از HSPi ممکن است بتواند به غلبه بر این چالش کمک کند. با این حال، جنبه دوم که در آن استرس­ها با HSPi­ها در آزمایش‌ها ترکیب شود و تیمار صورت گیرد، در از بین بردن سمیت­ها و کاهش استرس بسیار مهم می­باشد. با توجه به نقش HSPها در شرایط استرس، ترکیبات HSPi در رده­­ی سلولی جدا شده از کبد استرلیاد توانست اثرات محافظتی در برابر تغییرات دمایی (18، 22 و °C 26) داشته باشد. سنجش MTT نشان داد که A80 و SZ80 می­توانند زنده­مانی سلول را افزایش دهند، اما N800 اندکی آن را کاهش داد. همچنین سلول­هایی که ابتدا ترکیبات HSPi دریافت نمودند و سپس در معرض تغییرات دمایی ( 18، 22 و °C 26) قرار گرفتند، موجب افزایش زنده­مانی شدند.

 تغییر در دمای آب بر فیزیولوژی ماهی بی­تأثیر نیست و دمای بالا و پایین برای ماهی می­تواند استرس تلقی شده و بطور جدی بر عملکرد و فعالیت کورتیزول اثر گذاشته و بر سلامت ماهی تأثیر منفی بگذارد (28 و 42). تغییرات سریع حرارتی باعث ایجاد یکسری پاسخ­های فیزیولوژیکی از جمله فعال شدن محور استرس و تولید کورتیزول در ماهی می­گردد (4). همچنین در مطالعه­ای که بر روی ما­هی­های آمازون تحت تنش دمایی صورت گرفت، مشاهده شد که دماهای بالا هموستاز را مختل می­کنند و ماهی را در معرض استرس اکسیداتیو قرار می­دهند (7). همچنین ارتباط مثبت بین بیان HSP و کورتیزول در شرایط استرس سلولی اثبات شده است (11، 25 و 51). نتایج مطالعه کنونی بر روی سلول­های کبدی ماهی استرلیاد نشان داد هر سه ترکیب HSPi مورد مطالعه در دمای °C 26 در سلول­های کبد، موجب افزایش سطوح کورتیزول می­شوند.

سطوح تنش ماهی را می­توان با فعالیت آنزیم­های بیوشیمیایی (AST، ALT، ALP و LDH) نشان داد (8). مطالعه­ای بر روی گربه­ماهی زرد هیبرید (Pelteobagrus fulvidraco × P. vachelli) تحت تنش دمایی انجام شد. نتایج مطالعه نشان داد که تعداد گلبول­های قرمز، تعداد گلبول­های سفید، سطوح هموگلوبین و مقادیر هماتوکریت پس از قرار گرفتن در معرض استرس گرمایی به‌طور معنی‌داری افزایش می­یابد که نشان­دهنده افزایش متابولیسم سلولی است. همچنین فعالیت­های آنزیمی AST، ALT، ALP و LDH نیز افزایش یافت که نشان­دهنده نیاز به مقابله با استرس و آسیب سلولی بود (18). در مطالعه دیگری که روی ماهی pufferfish (Takifugu obscurus) تحت استرس دمایی صورت گرفت. تنش حرارتی توانست به طور قابل توجهی سطوح AST، ALT، LDH، گلوگز و تری­گلیسیرید را افزایش دهد، در حالی که سطح ALP بطور قابل توجهی کاهش داد. علاوه بر این، استرس حرارتی همچنین تعداد کل سلول‌های خونی را کاهش داد، زنده‌مانی سلول را مهار کرد و متعاقباً منجر به آسیب DNA و آپوپتوز شد (17). نتایج مطالعه حاضر حاکی از این بود که دمای °C 26 فعالیت آنزیم­های AST، ALT، ALP و LDH را در سلول­های کبد تحت تاثیر قرار می­دهد و موجب افزایش فعالیت آن­ها می­شود. بالعکس، سلول­هایی که ابتدا با ترکیبات آمیگدالین و Tex-OE تیمار شدند و سپس تحت استرس دمایی قرار گرفتند، منجر به کاهش فعالیت آنزیم­های مذکور شده و شرایط استرسی را تا حدودی به شاهد نزدیک کردند. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل همبستگی و مولفه­های اصلی یک رابطه نسبتا قوی بین آنزیم­های بیوشیمیایی در سلول­های کبد را نشان داد، که بیشتر نشان­دهنده اهمیت این آنزیم­ها در شرایط استرس می­باشد. با توجه به آنالیز PCA که برای شناسایی موثرترین درمان تنش دمایی استفاده گردید، ترکیبات Tex-OE و خصوصا آمیگدالین در شرایط تغییرات دمایی (بویژه °C 26)، تنش گرمایی را کنترل نموده و توانستند شرایط سلول را به سطوح طبیعی بازگردانند. 

نتایج مطالعه حاضر نشان می­دهد که ترکیبات HSPi می‌توانند به طور مثبت فعالیت کورتیزول را در سلول تحت تنش دمایی ماهی استرلیاد تعدیل کنند. علاوه بر این، آن­ها توانستند فعالیت آنزیم­های بیوشیمیایی را بهبود ببخشند، در نهایت میزان بقای سلول­ها را در شرایط آزمایشگاهی افزایش دهند. در نتیجه، القاکننده­های HSP ممکن است یک راه قدرتمند و قابل اعتماد برای افزایش مقاومت سلول­های استرلیاد قبل از قرار گرفتن در تنش دما و معکوس کردن اثرات مضر آن باشند. با این حال، به منظور اعمال کافی این رویکرد و توصیف اثرات آن‌ها بر وضعیت سلامت گونه‌ها و همچنین در ترکیب با سایر استرس­ها نیاز به بررسی و مطالعه بیشتر دارند.

سپاسگزاری

تأمین مالی این مطالعه توسط پژوهشکده حوضه آبی دریای خزر (شماره گرنت 961113100001) صورت گرفت. همچنین نویسندگان از حمایت­های دانشگاه گیلان در انجام این پژوهش کمال تشکر را دارند.

 

 

 

 

اطلاعات تکمیلی

1- سنتز 4،4- (1،4- فنیلن) بیس (5-آمینو-3-متیل-1،4- دی هیدروپیرانو [2،3-c] پیرازول-6-کربونیتریل)

این ترکیب از واکنش 2 میلی­مول پیرازولون، 1/2 میلی­مول مالونیتریل و 1 میلی­مول ترفتالدهید در حضور محلول 5 درصد سود (NaOH) به عنوان کاتالیزور در حلال اتانول و در شرایط رفلاکس سنتز شد. جهت کامل شدن واکنش بالن را در حمام آب سرد قرار داده و آب مقطر سرد به داخل آن اضافه شد، سپس رسوب به دست آمده توسط کاغذ صافی، صاف و سپس در آون خشک گردید. ترکیب شیمیایی جهت خالص­سازی بیش تر در حلال اتانول تبلور مجدد یافت. ساختار این ترکیب توسط طیف­های FT-IR ( Fourier transform infrared؛ نمودار 1)، H-NMR ( نمودار 2) و C-NMR ( نمودار 3) با استفاده از ( TMS: trimethylsilane) به عنوان استاندارد داخلی، تائید شد. وزن مولکولی آن gr/mol 427 می­باشد. مراحل آماده سازی نمونه جهت NMR به طور خلاصه بدین صورت است: نمونه­­ی جامد (کریستال) و لوله­ی mm 5، حدود  mg20 از نمونه در ml 6/0 حلال ( اینجا DMSO) حل می­شود. حدود 1/0% از TMS (تترا متیل سیلان) به عنوان استاندارد داخلی به نمونه اضافه می­شود. نمونه از طریق سیست پاستور که کاملا خشک و تمیز است به لوله منتقل می­شود. حدود ml 2/0 حلال دتره به نمونه اضافه شود به طوری­که در نهایت عمق نمونه در داخل تیوپ cm 4-3 باشد. درب نمونه را گذاشته آن را با پارافیلم سیلد می­کنیم. باید درب، پارافیلم و برچسب متقارن بر روی لوله باشند در غیر این صورت بر روی طیف تأثیر می­گذارند سپس مرحله Shim کردن نمونه جهت بهبود پارامترها را داریم و محل جدید برای جمع­آوری نمونه ایجاد می­کنیم.

 

نمودار 1- طیف FT-IR ترکیب (SZ).FT-IR (KBr, Cm-1) ν max: 3390 (NH); 3302 (NH2); 3168 (ArCH); 2923-2956 (Alkyl CH); 2186 (CN); 1645, 1597 (Ar C=C).

نمودار 3- طیف C- NMR ترکیب SZ.13C- NMR (100 MHz, DMSO-d6): d (ppm) 10.18, 36.42, 57.67, 98.18, 121.28, 128.12, 136.07, 143.24, 155.18, 129.01, 161.30.

نمودار 2- طیف H- NMR ترکیب SZ.H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (PPM); 1.75 (S, 6H, CH3), 4.58 (s, 2H,CH), 6.87 (s, 4H, NH2), 7.12 (s, 4H, ArH), 12.1 (s, NH).

2- استخراج سلول­های کبد از گونه استرلیاد: مراحل استخراج در شکل 8 نشان داده شده است.

شکل 8- الف و ب) یک قطعه تاس­ماهی ایرانی گونه استرلیاد پرورشی به وزن 28/15 گرم و اندازه تقریبا 18 سانتی­متر برای این مطالعه استفاده شد. پ) بافت کبد تکه تکه شده در فلاسک کشت سلولی T25 حاوی FBS 20%. ج) سلول­های کبد در حال جدا شدن از بافت کبد روز پنجم. د) سلول­های کاملا یک­دست با مورفولوژی گرد و چسبیده به کف فلاسک روز پانزدهم. تصاویر با میکروسکوپ اینورت با بزرگنمایی ×20 تهیه شده است.

  • Adam, A. M. A. (2019). An in vitro study of amygdalin alone and complexed with Se (IV), Au (III), Ru (III), and V (III) ions: Structure, morphology, and pharmacology. Journal of Molecular Structure, 1195, 43-57. doi: 10.1016/j.molstruc.2019.05.097.
  • Akbary Moghaddam, V., Kasmaeifar, V., Mahmoodi, Z., Ghafouri, H., Saberi, O., & Mohammadi, A. (2021). A Novel Sulfamethoxazole Derivative as an Inhibitory Agent against HSP70: A Combination of Computational with in vitro International Journal of Biological Macromolecules, 189, 194–205. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2021.08.128.
  • Alfonso, S., Gesto, M., & Sadoul, B. (2021). Temperature increase and its effects on fish stress physiology in the context of global warming. Journal of Fish Biology, 98 (6), 1496-1508. doi: 10.1111/jfb.14599.
  • Alfonso, S., Houdelet, C., Bessa, E., Geffroy, B., & Sadoul, B. (2023). Water temperature explains part of the variation in basal plasma cortisol level within and between fish species. Journal of Fish Biology. doi: 10.1111/jfb.15342.
  • Baharloei, M., Heidari, B., Zamani, H., Ghafouri, H., & Hadavi, M. (2021). Effects of heat shock protein inducer on Hsp70 gene expression and immune parameters during Streptococcus iniae infection in a Persian sturgeon fry. In Veterinary Research Forum, 12 (4):473–79. doi: 10.30466/vrf.2019.115181.2740.
  • Baharloei, M., Heidari, B., Zamani, H., & Hadavi, M. (2020). Effects of Pro‐Tex® on the expression of Hsp70 gene and immune response parameters in the Persian sturgeon fingerlings, Acipenser persicus, infected with Aeromonas hydrophila. Journal of Applied Ichthyology, 36 (4), 393-401. doi: 10.1111/jai.14045.
  • Baldissera, M. D., Souza, C. F., Barroso, D. C., Falk, R. B., Wagner, R., Baldisserotto, B., & Val, A. L. (2020). Disturbance of oxidant/antioxidant status and impairment on fillet fatty acid profiles in Brycon amazonicus subjected to acute heat stress. Fish physiology and biochemistry, 46, 1857-1866. doi: 10.1007/s10695-020-00835-3.
  • Banaee, M., Sureda, A., Mirvaghefi, A. R., & Ahmadi, K. (2013). Biochemical and histological changes in the liver tissue of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to sub-lethal concentrations of diazinon. Fish physiology and biochemistry, 39, 489-501. doi: 10.1007/s10695-012-9714-1.
  • Baruah, K., Norouzitallab, P., Linayati, L., Sorgeloos, P., & Bossier, P. (2014). Reactive oxygen species generated by a heat shock protein (Hsp) inducing product contributes to Hsp70 production and Hsp70-mediated protective immunity in Artemia franciscana against pathogenic vibrios. Developmental & Comparative Immunology, 46 (2), 470-479. doi: 10.1016/j.dci.2014.06.004.
  • Barulin, N. V. (2015). Serum enzyme response of captive sturgeon brookstock Acipenser baerii Brandt 1869 females and two hybrids (bester= female Huso huso Linnaeus, 1758 × male Acipenser ruthenus Linneaus, 1758, and RsSs= gueldenstaedtii Brandt 1833 × A. baerii Brandt 1869) to hormonal stimulation for spawning induction. Journal of applied ichthyology, 31, 2-6. doi: 10.1111/jai.12898.
  • Basu, N., Nakano, T., Grau, E. G., & Iwama, G. K. (2001). The effects of cortisol on heat shock protein 70 levels in two fish species. General and comparative endocrinology, 124 (1), 97-105. doi: 10.1006/gcen.2001.7688.
  • Bolarinwa, I. F., Orfila, C., & Morgan, M. R. (2014). Amygdalin content of seeds, kernels and food products commercially-available in the UK. Food chemistry, 152, 133-139. doi: 10.1016/j.foodchem.2013.11.002.
  • Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72 (1-2), 248-254. doi: 10.1016/0003-2697(76)90527-3.
  • Brough, P. A., Barril, X., Beswick, M., Dymock, B. W., Drysdale, M. J., Wright, L., & Workman, P. (2005). 3- (5-Chloro-2, 4-dihydroxyphenyl)-pyrazole- 4 -carboxamides as inhibitors of the Hsp90 molecular chaperone. Bioorganic & medicinal chemistry letters, 15 (23), 5197-5201. doi: 10.1016/j.bmcl.2005.08.091.
  • Butler, M. (2004). Animal cell culture and technology. Taylor & Francis.
  • Chen, Y., Liu, E., Li, C., Pan, C., Zhao, X., Wang, Y., & Ling, Q. (2021). Effects of heat stress on histopathology, antioxidant enzymes, and transcriptomic profiles in gills of pikeperch Sander lucioperca. Aquaculture, 534, 736277. doi: 10.1016/j.aquaculture.2020.736277.
  • Cheng, C. H., Guo, Z. X., Luo, S. W., & Wang, A. L. (2018). Effects of high temperature on biochemical parameters, oxidative stress, DNA damage and apoptosis of pufferfish (Takifugu obscurus). Ecotoxicology and environmental safety, 150, 190-198. doi: 10.1016/j.ecoenv.2017.12.045.
  • Dagoudo, M., Mutebi, E. T., Qiang, J., Tao, Y. F., Zhu, H. J., Ngoepe, T. K., & Xu, P. (2023). Effects of acute heat stress on haemato-biochemical parameters, oxidative resistance ability, and immune responses of hybrid yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco × vachelli) juveniles. Veterinary Research Communications, 1-13. doi: 10.1007/s11259-022-10062-1.
  • Damania, R., & Bulte, E. H. (2001). The Economics of Captive Breeding and Endangered Species Conservation. doi: 10.1016/j.ecolecon.2006.07.007.
  • Fischer, M., Belanger, S. E., Berckmans, P., Bernhard, M. J., Bláha, L., Coman Schmid, D. E., ... & Schirmer, K. (2019). Repeatability and reproducibility of the RTgill-W1 cell line assay for predicting fish acute toxicity. Toxicological Sciences, 169 (2), 353-364. doi: 10.1093/toxsci/kfz057.
  • Føre, M., Frank, K., Norton, T., Svendsen, E., Alfredsen, J. A., Dempster, T., ... & Berckmans, D. (2018). Precision fish farming: A new framework to improve production in aquaculture. biosystems engineering, 173, 176-193. doi: 10.1016/j.biosystemseng.2017.10.014.
  • Goikoetxea, A., Sadoul, B., Blondeau-Bidet, E., Aerts, J., Blanc, M. O., Parrinello, H., ... & Geffroy, B. (2021). Genetic pathways underpinning hormonal stress responses in fish exposed to short-and long-term warm ocean temperatures. Ecological Indicators, 120, 106937. doi: 10.1016/j.ecolind.2020.106937.
  • Grecu, I., Docan, A., Dediu, L., Antache, A., Crețu, M., & Maereanu, M. (2019). Haematological response of Acipenser stellatus juveniles in cold shock stress. stress, 27, 1-718.
  • Hasanzadeh, F., Ghafouri, H., Ahmadi, S., Zarei, S., Aghamaali, M. R., & Mohammadi, A. (2021). Inhibition of NF-кB Expression in LPS-Induced RAW264. 7 Macrophage Cells by a Thiazolidinone Derivative (TZD-OCH2 CH3). Avicenna Journal of Medical Biochemistry, 9 (2), 48-53. doi: 10.34172/ajmb.2021.09.
  • Iwama, G. K., Thomas, P. T., Forsyth, R. B., & Vijayan, M. M. (1998). Heat shock protein expression in fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries, 8, 35-56. doi: 10.1023/A:1008812500650.
  • Jahangirizadeh, Z., Ghafouri, H., Sajedi, R. H., Sarikhan, S., Taghdir, M., & Sariri, R. (2018). Molecular cloning, prokaryotic expression, purification, structural studies and functional implications of Heat Shock Protein 70 (Hsp70) from Rutilus frisii kutum. International journal of biological macromolecules, 108, 798-807. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.10.174.
  • Jamalzadeh, L., GHAFOORI, H., Sariri, R., Rabuti, H., Nasirzade, J., Hasani, H., & Aghamaali, M. R. (2016). Cytotoxic effects of some common organic solvents on MCF-7, RAW-264.7 and human umbilical vein endothelial cells. doi: 10.17795/ajmb-33453.
  • Kim, J. H., Jeong, E. H., Jeon, Y. H., Kim, S. K., & Hur, Y. B. (2021). Salinity-mediated changes in hematological parameters, stress, antioxidant responses, and acetylcholinesterase of juvenile olive flounders (Paralichthys olivaceus). Environmental Toxicology and Pharmacology, 83, 103597. doi: 10.1016/j.etap.2021.103597.
  • Kim, J. H., Kim, S. K., & Hur, Y. B. (2019). Temperature-mediated changes in stress responses, acetylcholinesterase, and immune responses of juvenile olive flounder Paralichthys olivaceus in a bio-floc environment. Aquaculture, 506, 453-458. doi: 10.1016/j.aquaculture.2019.03.045.
  • Kumar, S., Moniruzzaman, M., Chakraborty, A., Sarbajna, A., & Chakraborty, S. B. (2021). Crosstalk between heat shock proteins, NRF2, NF-κB and different endogenous antioxidants during lead-induced hepatotoxicity in Puntius ticto. Aquatic Toxicology, 233, 105771. doi: 10.1016/j.aquatox.2021.105771.
  • Lakra, W. S., Swaminathan, T. R., & Joy, K. P. (2011). Development, characterization, conservation and storage of fish cell lines: a review. Fish physiology and biochemistry, 37, 1-20. doi: 10.1007/s10695-010-9411-x.
  • Leroy, S. A., Lahijani, H. A., Crétaux, J. F., Aladin, N. V., & Plotnikov, I. S. (2020). Past and current changes in the largest lake of the world: The Caspian Sea. Large asian lakes in a changing world: Natural state and human impact, 65-107. doi: 10.1007/978-3-030-42254-7_3.
  • Long, L., Zhang, H., Ni, Q., Liu, H., Wu, F., & Wang, X. (2019). Effects of stocking density on growth, stress, and immune responses of juvenile Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) in a recirculating aquaculture system. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology, 219, 25-34. doi: 10.1016/j.cbpc.2019.02.002.
  • Mahanty, A., Mohanty, S., & Mohanty, B. P. (2017). Dietary supplementation of curcumin augments heat stress tolerance through upregulation of nrf-2-mediated antioxidative enzymes and hsps in Puntius sophore. Fish physiology and biochemistry, 43, 1131-1141. doi: 10.1007/s10695-017-0358-z.
  • Mandal, P., Cai, L., Tu, Z., Johnson, D., & Huang, Y. (2016). Effects of acute temperature change on the metabolism and swimming ability of juvenile sterlet sturgeon (Acipenser ruthenus, Linnaeus 1758). Journal of Applied Ichthyology, 32 (2), 267-271. doi: 10.1111/jai.13033.
  • Mohanty, B. P., Mahanty, A., Mitra, T., Parija, S. C., & Mohanty, S. (2018). Heat shock proteins in stress in teleosts. Regulation of heat shock protein responses, 71-94. doi: 10.1007/978-3-319-74715-6_4.
  • Otaka, M., Yamamoto, S., Ogasawara, K., Takaoka, Y., Noguchi, S., Miyazaki, T., ... & Itoh, H. (2007). The induction mechanism of the molecular chaperone HSP70 in the gastric mucosa by Geranylgeranylacetone (HSP-inducer). Biochemical and biophysical research communications, 353 (2), 399-404. doi: 10.1016/j.bbrc.2006.12.031.
  • Pelusio, N. F., Scicchitano, D., Parma, L., Dondi, F., Brini, E., D’Amico, F., ... & Bonaldo, A. (2021). Interaction between dietary lipid level and seasonal temperature changes in gilthead sea bream Sparus aurata: effects on growth, fat deposition, plasma biochemistry, digestive enzyme activity, and gut bacterial community. Frontiers in Marine Science, 8, 664701. doi: 10.3389/fmars.2021.664701.
  • Pirali, M., Taheri, M., Zarei, S., Majidi, M., & Ghafouri, H. (2020). Artesunate, as a HSP70 ATPase activity inhibitor, induces apoptosis in breast cancer cells. International Journal of Biological Macromolecules, 164, 3369-3375. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.08.198.
  • Prokopchuk, G., Dzyuba, B., Rodina, M., & Cosson, J. (2016). Control of sturgeon sperm motility: Antagonism between K+ ions concentration and osmolality. Animal reproduction science, 164, 82-89. doi: 10.1016/j.anireprosci.2015.11.015.
  • Shahriyari-Nejad, H., Pourmohsen, N., Ghafouri, H., Zareie, S., Sharifi, R., & Mahmoodi, N. (2020). Synthesis of Pirano-Based Piranazole-based Compounds to Induce Apoptosis by Reducing the Expression of Anti-Apoptotic Protein B2 Cell Lymphoma Protein in the MCF-7 Human Breast Cancer Cell Category. Armaghane Danesh, 25(1), 40-54. doi: 10.52547/armaghanj.25.1.40.
  • Singh, S. P., Ahmad, T., Sharma, J., & Chakrabarti, R. (2021). Effect of temperature on food consumption, immune system, antioxidant enzymes, and heat shock protein 70 of Channa punctata. Fish Physiology and Biochemistry, 47, 79-91. doi: 10.1007/s10695-020-00896-4.
  • Stapp, L. S., Kreiss, C. M., Pörtner, H. O., & Lannig, G. (2015). Differential impacts of elevated CO2 and acidosis on the energy budget of gill and liver cells from Atlantic cod, Gadus morhua. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 187, 160-167. doi: 10.1016/j.cbpa.2015.05.009.
  • Tarazi, S., Ahmadi, S., Ostvar, N., Ghafouri, H., Sarikhan, S., Mahmoodi, Z., & Sariri, R. (2021). Enhanced soluble expression of glutathione S-transferase Mu from Rutilus kutum by co-expression with Hsp70 and introducing a novel inhibitor for its activity. Process Biochemistry, 111, 261-266. doi: 10.1016/j.procbio.2021.10.003.
  • Vahdani, F., Ghafouri, H., Sarikhan, S., & Khodarahmi, R. (2019). Molecular cloning, expression, and functional characterization of 70-kDa heat shock protein, DnaK, from Bacillus halodurans. International journal of biological macromolecules, 137, 151-159. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2019.06.217.
  • Vahdatiraad, L., Heidari, B., Zarei, S., Sohrabi, T., & Ghafouri, H. (2023). Biological responses of stellate sturgeon fingerlings (Acipenser stellatus) immersed in HSP inducer to salinity changes. Marine Environmental Research, 191, 106145. doi: 10.1016/j.marenvres.2023.106145.
  • Vavrek, M. J., Murray, A. M., & Bell, P. R. (2014). An early Late Cretaceous (Cenomanian) sturgeon (Acipenseriformes) from the Dunvegan Formation, northwestern Alberta, Canada. Canadian Journal of Earth Sciences, 51 (7), 677-681. doi: 10.1139/cjes-2014-0052.
  • Wegner, A., Ostaszewska, T., & Rożek, W. (2009). The ontogenetic development of the digestive tract and accessory glands of sterlet (Acipenser ruthenus) larvae during endogenous feeding. Reviews in fish biology and fisheries, 19, 431-444. doi: 10.1007/s11160-009-9111-8.
  • Yazdanpanah Dero, Q., Yari, E., & Charrahy, Z. (2020). Global warming, environmental security and its geo-economic dimensions case study: Caspian Sea level changes on the balance of transit channels. Journal of Environmental Health Science and Engineering, 18, 541-557. doi: 10.1007/s40201-020-00481-0.
  • Zakerinejad, R., Movahedi, S., & Jahanian, E. (2022). Investigation of Sea Surface Temperature Changes in the Oman Sea and the Persian Gulf Using Satellite Images and Its Comparison with the Caspian Sea Spatial Planning Trend. , 12 (4), 65-80. doi: 10.22108/sppl.2023.134287.1665.
  • Zarei, S., Ghafouri, H., Vahdatiraad, L., Moghaddam, V. A., Sohrabi, T., & Heidari, B. (2023). Using Heat Shock Protein (HSP) Inducers as an Approach to Increase the Viability of Sterlet (Pisces; Acipenseridae; Acipenser ruthenus) Cells against Environmental Diazinon Toxicity. Journal of Hazardous Materials, 133194. doi: 1016/j.jhazmat.2023.133194.
مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 37، شماره 2
تابستان 1403
صفحه 104-118

  • تاریخ دریافت 12 شهریور 1402
  • تاریخ بازنگری 20 آذر 1402
  • تاریخ پذیرش 27 آذر 1402