تاثیر ترکیبی رژیم‌های نوری و جیره­های غذایی جلبکی بر رشد و تولید در آنتن منشعب آب شیرین  Ceriodaphnia quadrangula

دلارام تقوی، امیدوار فرهادیان^*، نصرالله محبوبی صوفیانی و یزدان کیوانی

دانشگاه صنعتی اصفهان، دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات

تاریخ دریافت: 26/10/90             تاریخ پذیرش: 25/5/91

چکیده

یکی از آنتن منشعب‌های آب شیرین گونه Ceriodaphnia quadrangula است. این گونه را می­توان به عنوان یکی از مناسب‌ترین غذاهای زنده در نظر گرفت­، زیرا دامنه تحمل وسیعی به خصوصیات دمایی و نوری آب و همچنین پرورش با استفاده از جلبک‌های میکروسکوپی دارد. این تحقیق با هدف تاثیر رژیم­های مختلف نوری و جیره‌های جلبکی به طور ترکیبی بر میزان رشد و تولید در C. quadrangula انجام شد. تیمارهای آزمایشی شامل 4 رژیم نوری­:  4L:4D­(4 ساعت نور: 4 ساعت تاریکی)، 6L:6D ، 8L:8D و12L:12D و2 جیره جداگانه جلبک سبز Scenedesmus quadricauda و
Chlorella vulgaris بود که به صورت یک طرح کاملاً تصادفی با 6 تکرار انجام شد. نتایج نشان داد که تراکم جمعیت، میزان رشد ویژه و زمان دوبرابر شدن جمعیتC. quadrangula در تیمارهای مختلف آزمایش شده تفاوت معنی­داری دارد (05/0>P). میانگین بالاترین تراکم آنتن منشعبC. quadrangula تغذیه شده با جلبک S. quadricauda در تیمارهای 4L: 4D، 6L:6D، 8L:8D و 12L:12D به ترتیب 9/50 ± 1000 (میانگین± خطای استاندارد)، 3/57 ± 4/571، 3/62 ± 5/690 و 7/ 58± 1000  فرد در لیتر در حالیکه این تیمارها با جلبک  C. vulgaris به ترتیب برابر0/46± 9/1642، 2/72 ± 9/2261، 0/75 ± 8/1023 و3/80 ± 1/2619 فرد در لیتر در دوره آزمایش  به دست آمد. همچنین میانگین میزان رشد ویژه بدست آمده در تیمارهای مختلف دامنه‌ای از 04/0 تا 11/0 در روز داشت. این تحقیق مبینان است که C. quadrangula قابلیت پرورش در رژیم‌های مختلف نوری و همچنین جیره‌های جلبکی را دارد اما می‌توان با استفاده از ترکیب شرایط پرورش 12L:12D و جلبک C. vulgaris مناسب‌ترین عملکرد را فراهم نمود.

واژه‌های کلیدی: زئوپلانکتون، شرایط محیطی، Ceriodaphnia ، جلبک‌های میکروسکوپی

* نویسنده مسئول، تلفن: 03133913564، پست الکترونیکی: omfarhad@cc.iut.ac.ir

مقدمه

غذاهای زنده به دلیل داشتن پارامترهای ضروری برای افزایش رشد، بقاء بیشتر و افزایش سطح ایمنی موجودات دارای اهمیت هستند (9 و 11). مطالعات بسیاری در ارتباط با اثر دما، شوری، تغذیه و غیره بر زئوپلانکتونها در ارتباط با جنبه‌های مختلف زیست­شناسی آن­ها صورت گرفته و نتایج مختلف و قابل توجهی به دست آمده است. یکی از مهم‌ترین این عوامل اثر نور و جیره غذایی جلبکی و یا ترکیبی از این عوامل است (1و 2). نور به عنوان یکی از فاکتورهای مهم در تولیدمثل زئوپلانکتونها (8، 26و33) است بطوریکه بعضی از آنها به نور حساس­­­اند و این حقیقت دانشمندان را بر آن داشته که به تحقیق بر روی ارتباط حساسیت زئوپلانکتونها به نور و ویژگی‌های آن بپردازند (20). از سوی دیگر، جلبک‌های میکروسکوپی (Microalgae) غذای اصلی زئوپلانکتون­ها هستند. کیفیت غذایی این جلبک‌ها به­وسیله اندازه سلول، قابلیت هضم دیواره سلولی، سمیت و ترکیبات تشکیل­دهنده جلبک تعیین­ می­گردد (13). کشت­های آزمایشگاهی گونه­های زئوپلانکتونی، به­ویژه کلادوسرها و روتیفرها، عموماً توسط جلبک­های سبز Chlorophycea نظیر گونه‌های
Chlorella vulgaris وScenedesmus acutus انجام شده است (29). از نقطه نظر کیفیت، اگر چه گونه‌های جنسChlorella  و Scenedesmus دارای سطوح نسبتاً مشابهی از اسیدهای چرب اشباع نشده، به خصوصω3 وω6 هستند، اما به­طور کلی گونه‌های جنس Scenedesmus از لحاظ چربی­ها، پروتئین­ها، نیتروژن، و سطوح فسفر غنی­تر است (4).

آنتن منشعب‌ها به لحاظ قابلیت دسترسی در اکوسیستم‌های آبی، وجود اندازه‌های متفاوت، سرعت تکثیر و تولید بالا، ارزش غذایی بسیار بالا، محتوی بالای آنزیم‌های گوارشی و انرژی بالا، قابلیت پرورش ارزان، تحمل بالای آنتن منشعب‌ها به تغییرات محیطی از قبیل دما و فتوپریود باعث شده تا آن‌ها به عنوان یکی از زئوپلانکتون های پرطرفدار برای مطالعات بیولوژیکی و آبزی پروری مورد استفاده قرار گیرد (3، 18و40). پارامترهای محیطی شامل دما، تغذیه،  شوری، دوره‌های نوری، طیف نور از مهم‌ترین عوامل تاثیرگذار بر عادات و رفتارهای موجودات آبزی از جمله زئوپلانکتون­ها می‌باشند. هرگونه تغییر در یکی از این عوامل سبب تغییرات بسیار چشمگیر در این موجودات می‌گردد. از میان این عوامل نور و غذا از فاکتورهایی هستند که می­توانند بر بیولوژی و فیزیولوژی زئوپلانکتون­ها به طور انفرادی و بر اکولوژی آن‌ها در جمعیت‌ها مؤثر باشند. با توجه به اینکه مطالعه خصوصیات فردی و جمعیتی بسیاری از موجودات در طبیعت تابع تاثیرات متقابل بسیاری از پارامترهای محیطی و زیستی است­، از این رو مطالعه در شرایط آزمایشگاهی و کنترل شده به عنوان یکی از مهم‌ترین روش‌ها در بررسی موجودات از جایگاه ویژه‌ای برخوردار است. جنس Ceriodaphnia از آنتن منشعب‌هایی خانواده Daphnidae است که پراکنش جهانی دارد و تقریباً همه گونه­های این جنس در محدوده‌ای از آسیا، اروپا و آمریکای جنوبی پراکنش دارند (6). گونه‌های این جنس نقش بسیار مهمی در تغذیه لاروآبزیان و افزایش میزان بقاء و رشد آن‌ها دارد. برای مثال گونهCeriodaphnia quadrangula از جمله گونه‌هایی است که معمولا در آبگیرها و استخرهای پرورش ماهی به طور همزیست با سایر اعضاء زئوپلانکتونهای آب شیرین وجود دارد. خصوصیاتی از جمله تحمل شرایط دمایی و نوری و پرورش با انواع غذاهای جلبکی و غیرجلبکی و همچنین اندازه مناسب این گونه را به عنوان یکی از مهم‌ترین غذاهای زنده در آبزی پروری مطرح کرده است (3و18). در این خصوص مطالعات در مورد تاثیرات متقابل عوامل محیطی و تغذیه‌ای به طور توائم در شرایط آزمایشگاهی بر رشد و تولید زئوپلانکتونها و به خصوص آنتن منشعب‌ها کمتر انجام شده است و حجم بسیاری از منابع به مطالعات عوامل به صورت انفرادی اختصاص یافته است. این تحقیق با هدف تعیین میزان رشد و تولید در آنتن منشعب آب شیرین
C. quadrangula تحت رژیم‌های مختلف نوری غیرطبیعی (27و28) در ترکیب با غذاهای جلبکی به منظور افزایش تولید و بهره­وری از این غذای زنده انجام شد. به عبارت دیگر در این پژوهش این فرضیه را که تغییر در تعداد پالس های نوری در هر 24 ساعت موجب کوتاه­تر شدن فواصل تولیدمثل می شود با تاکید بر تراکم جمعیت
C. quadrangula مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روشها 

روش آزمایشگاهی کشت جلبک­ها: جلبک­های سبز Scenedesmus quadricauda و C. vulgaris در ارلن­های 2 لیتری با استفاده از محیط کشت BBM (Bold’s Basal Medium) بر طبق ترکیبات بیان ­شده توسط Nichols و Bold در سال 1965 کشت یافتند (25) (تصویر1- الف). شرایط پرورش این گونه­های جلبکی شامل آب شیرین فیل‌تر و اتوکلاو شده، دمای Cº1±23، دوره نوری 12:12 ساعت تاریکی:روشنایی، شدت نور 60 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه، pH  آغازین 9/6 و اکسیژن محلول بالای 5 میلی­گرم در لیتر بود. جلبک­ها در فاز رشد سریع از طریق سانتریفیوژ کردن مورد برداشت قرار گرفت. برای برداشت جلبک­ها، از دستگاه سانتریفیوژ (مدلCenturion Scientific Ltd) با سرعت 3000 دور در دقیقه برای مدت 5 دقیقه جهت متراکم کردن جلبک­ها استفاده گردید. جلبک­ها بعد از سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتی­گراد نگهداری ­شدند تا جهت تغذیهC. quadrangula مورد استفاده قرار گیرند. تراکم کشت­های جلبکی و مقادیر جلبک جهت تغذیهC. quadrangula و کنترل میزان آن­ها در دوره آزمایش، با استفاده از لام هموسایتومتر (mm2/0× mm0625/0) و میکروسکوپ اینورت (مدل Ceti Belgium) بر اساس روش1975) Chakroff (Martinez & (22) بعد از اینکه به نمونه­ها محلول لوگول آیودین (1/0 میلی­لیتر در 3 میلی­لیتر نمونه) اضافه­گردید، تعیین شد.

روش تهیه استوک اولیه C. quadrangula: به منظور تهیه استوک اولیه آنتن منشعبC. quadrangula تخم‌های نهان­زی (Ephipium) این گونه که دارای رنگ کاهی تا متمایل به زرد کم رنگ بود بر اساس کلید شناسایی (36 و 38) و دارای ابعاد 35/0- 27/0 میلی­متر، مدور و دارای یک تخم بود در فصل زمستان از سطح دریاچه سد حنا واقع در 20 کیلومتری شهرستان سمیرم، استان اصفهان در سال 1389 جمع­آوری و سپس به آزمایشگاه گروه شیلات دانشگاه صنعتی اصفهان انتقال داده ­شد. در ابتدا تخم‌های نهان­زی­های C.quadrangula در آزمایشگاه پس از فراهم نمودن شرایط مناسب تفریح گردید (500 میلی­گرم سیست در 1 لیتر آب فیل‌تر و اتوکلاو شده)، سپس این گونه از سایر نمونه‌ها جداسازی و خالص سازی شد. پس از آن  در ظروف 10 لیتری در دمای Cº 2±22 همراه با هوادهی ملایم ذخیره­سازی گردید (14، 21، 23، 32و 39).
C. quadrangula با استفاده از مخلوطی از جیره دو نوع جلبک S. quadricauda و C. vulgaris به صورت روزانه غذادهی شد و اجازه داده شد تا 50 مرتبه در جمعیت تجدید نسل انجام­شد. برای اطمینان از شناسایی این گونه نمونه­برداری از ماده­های پارتنوژنتیک خالص سازی شده توسط کلید شناسایی Fernando در سال 2002 صورت گرفت (12). بر این اساس این گونه با نداشتن رستروم، خار دمی و همچنین داشتن یک سینوس (تورفتگی) گردنی از سایر آنتن منشعب ها متمایز می­شود. 

تیمارها و روش انجام آزمایش: در این تحقیق تیمارهای از ترکیب 4 رژیم نوری شامل 4L:4D (4 ساعت نور:4 ساعت تاریکی)، 6L:6D، 8L:8D و12L:12D و2 جیره جلبک سبز S. quadricauda وC. Vulgaris  به منظور پرورش آنتن­منشعب آب شیرین C. quadrangula به صورت آزمایش فاکتوریل در قالب یک طرح کاملاً تصادفی مورد بررسی قرار گرفت. به منظور آماده سازی دوره‌های نوری مناسب در تیمارها، چهار اتاقک مناسبی به ابعاد مساوی و شرایط کاملاً یکسان ساخته شد و با لامپ فلورسنت با نور مهتابی تجهیز گردید تا در تمام اتاقک‌ها شدت نور مناسب 60 میکرومول فوتون بر متر­مربع بر­ثانیه ثابت تنظیم شود (تصویر1- ب). سقف، دیوارها با پلاستیک مشکی پوشانده­ شد تا از ورود نور به فضای داخل اتاقک­ها جلوگیری گردد. به منظور تغییرات تنظیم شده زمانی در هریک از تیمارها ( مثلاً 4 ساعت نور و سپس 4 ساعت تاریکی در تیمار4L:4D) از 4 عدد ساعت فرمان (تنظیم شده با ساعت فرمانFur Aussen-geeignet  مدل IP44 ، ساخت آلمان) هر کدام به طور اختصاصی برای یک تیمار در تمام دوره آزمایش استفاده شد. پس از تنظیم شرایط مطلوب اتاقک‌ها در هریک از تیمارهای آزمایشی، تعداد 200 فرد از آنتن منشعب
 C. quadrangula در هر لیتر از ظروف آزمایشگاهی (قطر= 18 سانتی متر، ارتفاع= 30 سانتی­متر) هر کدام با 6 تکرار به طور تصادفی از استوک آماده شده
C. quadrangula مورد جداسازی قرار گرفت. سپس­، ظروف آماده شده به طور تصادفی بین اتاقک‌های متفاوت به لحاظ رژیم‌های نوری به طور همزمان توزیع شد (تصویر 1-ج ، د). آب مورد استفاده جهت نگهداری و انجام آزمایشات از آب شهر پس از فیل‌تر کردن و اتوکلاوه نمودن (دمای 121 درجه سانتی­گراد به مدت 15 دقیقه) تامین شد. آب مورد استفاده دارای سختی کل 135 میلی­گرم در لیتر از کربنات کلسیم و عاری از هرآلودگی شیمیایی و غیره بود. به منظور اطمینان از عدم وجود کلر در آب از هوادهی به مدت لااقل 5 ساعت استفاده گردید و از محلول یدید پتاسیم و چسب نشاسته برای اطمینان بیشتر از آب مورد استفاده قبل اتوکلاوه نمودن استفاده گردید. پس از قرار گرفتن ظروف آزمایشی در شرایط نوری تیمار شده، کار تغذیه به وسیله جلبک‌های متراکم شده و آماده شده از قبل با لحاظ نمودن تصادفی بودن در هر اتاقک با استفاده از جلبک‌هایS. quadricauda وC. Vulgaris  به ­ترتیب با غلظت‌های10⁴×45 سلول در هر میلی­لیتر و10⁶×6/1 سلول در هر میلی­لیتر در آغاز آزمایش انجام ­شد (23، 32و 39). مقدار تعویض آب 20 درصد قبل از غذادهی بود که هر 3 روز یکبار انجام می­شد. تراکم جمعیت C. quadrangula در هر واحد آزمایشی هر دو روز یکبار تعیین گردید و میزان غذادهی بر اساس تراکم جمعیت  C. quadrangulaو همچنین غلظت جلبک‌ها در ظروف آزمایش مورد کنترل قرار گرفت تا اطمینان حاصل شود که میزان غذا دهی در محدود مازاد نیاز (ad libitum) جمعیت باشد آزمایش برای یک دوره 30 روزه تنظیم گردید و تلاش گردید تا شرایط آزمایش در طی دوره آزمایش شامل شامل دمای آب  Cº 2±22 درجه سانتی­گراد، شدت نور 60 میکرومول­فوتون­بر­متر­مربع بر­ثانیه، pH آغازین1/7 و اکسیژن محلول بیش از5 میلی­گرم در لیتر تا سر حد امکان ثابت نگه داشته شود. در تمام طول آزمایش از هواده جهت چرخش آب و تامین اکسیژن مورد نیاز استفاده گردید. اکسیژن محلول و دما با استفاده از اکسیژن­متر دارای دماسنج (YSI 57) و pH با استفاده از pH متر دیجیتال (Schottgerate مدل666221، ساخت آلمان) اندازه­گیری­شد.

 در دوره آزمایش و پرورش شمارش C. quadrangula با نمونه­برداری از واحدهای آزمایشی در شرایط حداقل نور هر دو روز یکبار انجام شد و سپس با استفاده از لام باگاروف (Bogorov’s chamber) تراکم جمعیت تخمیین زده شد. میزان رشد ویژه جمعیت (SGR) براساس (1984) Ikeda & Omori با استفاده از فرمول  زیر محاسبه ­شد (2و26). در این رابطه SGR میزان رشد ویژه جمعیت برحسب در روز، N0 و Nt به ترتیب تراکم جمعیت در آغاز و پایان دوره پرورش می­باشد. همچنین زمان دو برابر شدن جمعیت (Dt) از فرمول (1986) & Al-Khars James  محاسبه گردید (2، 13 و 15). در این فرمول Dt زمان دو برابر شدن جمعیت و SGR میزان رشد ویژه می­باشد.

تجزیه و تحلیل داده ها و آنالیز آماری : به منظور تجزیه و تحلیل‌های آماری ، داده­ها با آنالیز واریانس دو طرفه بررسی گردید. تفاوت بین میانگین­ها با استفاده از آزمون چند دامنه دانکن با هم مقایسه­گردید (Zar, 1984) (41). تمام آنالیز­ها در سطح معنی­دار05/0 با استفاده از نرم­افزار آماری SPSS, version 16 (35) انجام­شد.

نتایج

نتایج حاصل از آنالیز واریانس دو طرفه اثر رژیم­های مختلف نوری و جیره­های جلبکی در جدول 1 ارائه ­شده­است. نتایج نشان داد که تیمارهای مختلف از رژیم‌های نوری وجیره­های جلبکی بر تراکم جمعیت، میزان رشد ویژه و زمان دو برابر شدن جمعیت C. quadrangula تفاوت معنی­داری دارند (05/0>P). میانگین بالاترین تراکم آنتن منشعب C. quadrangula تغذیه شده با جلبک S.quadricauda در رژیم‌های نوری 4L: 4D (4 ساعت نور: 4 ساعت تاریکی)، 6L:6D، 8L:8Dو 12L:12D به ترتیب 9/50 ± 1000 (میانگین± خطای استاندارد)، 3/57 ± 4/571، 3/62 ± 5/690 و 7/ 58± 1000 فرد در لیتر در حالیکه این رژیم‌ها با جلبک C. vulgaris به ترتیب برابر 0/ 46± 9/1642، 2/72 ± 9/2261، 0/75 ± 8/1023 و 3/80 ± 1/2619  فرد در لیتر در دوره آزمایش به دست آمد (شکل 1- A). میانگین میزان رشد ویژه محاسبه شده در رژیم‌های نوری 4L: 4D (4 ساعت نور: 4 ساعت تاریکی)، 6L:6D، 8L:8Dو 12L:12D به ترتیب با جلبک S.­­­quadricauda برابر 00/0 ± 07/0، 00/0 ± 04/0، 00/ 0 ± 06/0 و 00/0 ± 07/0 در روز بود در حالی که در تغذیه با C.­vulgaris به ترتیب برابر با 00/0 ± 09/0، 00/0±10/0، 00/0±07/0 و 00/0±11/0 در روز به دست آمد (شکل1 –B). همچنین زمان دو برابر شدن جمعیت در رژیم­های نوری یاد شده تغذیه شده توسط جلبک سبز
S. quadrangula به ترتیب 3/0 ± 5/9، 5/1 ± 7/16، 1/1 ± 9/12 و 4/0 ± 4/10 و در C. quadrangula تغذیه شده با C. vulgaris برابر 1/0 ± 9/7، 1/0 ± 9/6، 4/0 ± 5/9 و 1/0 ± 5/6 به دست آمد (شکل 1 -C)، که بیانگر کوتاه بودن این دوره با جلبک C. vulgaris است. میانگین تراکم جمعیت در روزهای مختلف از پرورش
 C. quadrangulaدر شکل2- A و 2- B برای تیمارهای مختلف آزمایشی ارائه شده است. دینامیک جمعیت در تمامی تیمارها روند مشابهی در دو هفته نخست (حدود14 روز) نشان دادند در حالیکه پس از آن (به طور متوسط بین روزهای 16 تا 24) جمعیت یک جهش ناگهانی داشت و اوج افزایش تراکم رخ داد.

جدول 1- آنالیز واریانس دوطرفه رژیم­های نوری (4L:4D ، 6L:6D ، 8L:8D و 12L:12D) و جیره­های جلبکی (quadricauda S. و
 C. vulgaris) بر فاکتورهای مختلف در جمعیت آنتن­منشعب آب شیرین C. quadrangula.

* در سطح 05/0 دارای اختلاف معنی­داری (05/0>P) و ns: فاقد اختلاف معنی­دار (05/0<P)

تصویر 1-  تصویر بخش هایی از مراحل انجام کار، کشت های جلبکی (الف)، اتاقک مناسب نوری (ب) ، کشت های انجام شده در این تحقیق (ج، د) .

شکل 1-  میانگین  (± خطای استاندارد) تراکم جمعیت (A) ، میزان رشد ویژه (B) ، و زمان دوبرابر شدن  جمعیت(C) در آنتن منشعب آب شیرین Ceriodaphnia quadrangula پرورش یافته  از ترکیب رژیم های نوری مختلف و رژیم های مختلف تغذیه جلبکی.  ستونهای دارای لااقل یک حرف مشابه اختلاف معنی داری در سطح 05/0 با هم ندارند.

شکل 2-  میانگین  (± خطای استاندارد) تراکم جمعیت (فرد در لیتر) در روزهای مختلف پرورش  آنتن منشعب آب شیرین Ceriodaphnia quadrangula  در رژیم های مختلف نوری و رژیم های مختلف تغذیه جلبکی.