نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 دانش آموخته کارشناسی ارشد زابل، پژوهشکده تالاب بین المللی هامون و دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات
2 عضو هیات علمی پزوهشکده تالاب بین المللی هامون دانشگاه زابل
3 عضو هیات علمی دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار، دانشکده علوم دریایی، گروه بهداشت و بیماری های آبزیان
چکیده
روتیفرها به واسطه طول عمر کوتاه، زادآوری بالا و نرخ بالای رشد جمعیت، برای آزمایشات سمیت مزمن مطلوب میباشند.جیوه یکی از فلزات سنگینی است که برای موجودات آبزی بویژه زئوپلانکتونهای آب شیرین که روتیفرها گروه مهمی از آنها هستند، بسیار سمی است.در این تحقیق سطح پاسخ جمعیتروتیفر Brachionuscalyciflorusنسبت به شش غلظت مختلف از جیوه (0، 0005/0، 001/0، 002/0، 004/0 و 008/0 میلیگرم درلیتر) با سه تکرار به ازای هر غلظت طی مدت 12 روز مورد بررسی قرار گرفت. تراکم و نرخ رشد ویژه روتیفرهابه طور روزانه در تیمار شاهد و تیمارهای حاوی جیوه محاسبه شد.نتایج نشان داد که جمعیت روتیفرها با افزایش غلظت جیوه در محیط کشت به طور معنیداری (05/0>P) کاهش یافت. بیشترین تراکم (07/0±87/45 فرد درمیلیلیتر) در روز دوازدهم مربوط به تیمار شاهد و کمترین تراکم (03/0±02/6 فرد درمیلیلیتر) مربوط به تیمار حاوی غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر جیوهبدست آمد. همچنین نرخ رشد ویژه روتیفرها با افزایش غلظت این فلز به طور معنیداری (05/0>P) کاهش یافت و از 35/0 در تیمار شاهد به 16/0 در غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر فلز جیوه رسید.نتایج این تحقیق نشان داد که روتیفرB. calyciflorus نسبت به فلز جیوه به شدت حساس میباشد.
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
The effect of heavy metal mercury (Hg) on the population growth of freshwater rotifer Brachionus calyciflorus
نویسندگان [English]
چکیده [English]
Rotifers due to their relatively short lifespan, high fecundity and high rate of population increase are ideal for chronic toxicity tests. Mercury is one of the heavy metals highly toxic to aquatic organismsparticulary freshwater zooplankton of which rotifers are an important group. In peresentstudy, population response of rotifer B. calyciflorus to six different concentrations of mercury (0.0005, 0.001, 0.002, 0.004, and 0.008 mgL-1) with three replicates per concentration was studied for 12 days. Rotifer density and specific growth rate was calculated daily in the control and treatments containing mercury. Result showed that, rotifer population growth decreased significantly (p< 0.05) with increasing Hg concentration in the medium. The maximum density in twelve day belongs to control (45.87±0.07ind/ml) and minimum density belongs to treatments containing concentration of 0.008 mg L-1mercury (6.02±0.03ind/ml). Also, the rotifer specific growth rate decreased significantly (p< 0.05) (from 0.35 in control group to 0.16 in concentration of 0.008 mg L-1) with increasing concentration of this metal. Results of this study showed that rotifers B. calyciflorus are severely sensitive to heavy metal mercury.
کلیدواژهها [English]
اثر فلز سنگین جیوه (Hg) بر رشد و تراکم جمعیت روتیفر آب شیرین
Brachionus calyciflorus
مصیب سیدی آب الوان1، احمد قرایی1* و مصطفی غفاری2
1 زابل، دانشگاه زابل، پژوهشکده تالاب بین المللی هامون و دانشکده منابع طبیعی، گروه شیلات
3 چابهار، دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار، دانشکده علوم دریایی، گروه بهداشت و بیماری های آبزیان
تاریخ دریافت: 10/6/92 تاریخ پذیرش: 26/1/93
چکیده
روتیفرها به واسطه طول عمر کوتاه، زادآوری بالا و نرخ بالای رشد جمعیت، برای آزمایشات سمیت مزمن در محیطهای آبی مطلوب میباشند. جیوه یکی از فلزات سنگینی است که برای موجودات آبزی بویژه زئوپلانکتونهای آب شیرین که روتیفرها گروه مهمی از آنها هستند، بسیار سمی است. در این تحقیق سطح پاسخ جمعیت روتیفر Brachionus calyciflorus نسبت به شش غلظت مختلف از جیوه (0، 0005/0، 001/0، 002/0، 004/0 و 008/0 میلیگرم درلیتر) با سه تکرار به ازای هر غلظت طی مدت 12 روز مورد بررسی قرار گرفت. تراکم و نرخ رشد ویژه روتیفرها به طور روزانه در تیمار شاهد و تیمارهای حاوی جیوه محاسبه شد. نتایج نشان داد که جمعیت روتیفرها با افزایش غلظت جیوه در محیط کشت به طور معنیداری (05/0>P) کاهش یافت. بیشترین تراکم (07/0±87/45 عدد درمیلیلیتر) در روز دوازدهم مربوط به تیمار شاهد و کمترین تراکم (03/0±02/6 عدد درمیلیلیتر) مربوط به تیمار حاوی غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر جیوه بدست آمد. همچنین نرخ رشد ویژه روتیفرها با افزایش غلظت این فلز به طور معنیداری (05/0>P) کاهش یافت و از 35/0 در تیمار شاهد به 16/0 در غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر فلز جیوه رسید. نتایج این تحقیق نشان داد که روتیفر B. calyciflorus نسبت به فلز جیوه به شدت حساس میباشد.
واژه های کلیدی: روتیفر Brachionus calyciflorus، جیوه، نرخ رشد ویژه، تراکم جمعیت
* نویسنده مسئول، تلفن: 05422251521 ، پست الکترونیکی: agharaei551@gmail.com
مقدمه
روتیفرها از گروههای زئوپلانکتونی عمده آبهای شیرین و اکوسیستمهای ساحلی دریایی در سراسر جهان بوده و موجودات مناسبی برای بررسی تأثیرات مواد آلاینده از جمله فلزات سنگین، ترکیبات ارگانوفسفره و آفتکشها به شمار میروند. این موجودات زنده پلانکتونی با توجه به اندازه کوچک و مناسب، کیفیت بالای مواد مغذی و رفتارهای ویژه، به طور انبوه برای تغذیه لارو ماهیان کشت داده میشوند (12، 35). غذا به فرم پلانکتونی منبع مهمی برای انباشتگی فلزات سنگین در بدن ماهیان میباشد (21) و بدین طریق پلانکتونها بواسطه انباشتگی زیستی، موجب افزایش مواد آلاینده در زنجیره غذایی میشوند (20). روتیفرها بویژه B. calyciflorus و Brachionus patulus از جمله موجودات پلانکتونی هستند که به طور قابل توجهی به منظور ارزیابی سمیت در محیطهای آبی مورد استفاده قرار میگیرند (34).
برخی فلزات سنگین از قبیل: روی، جیوه و کادمیوم برای فعالیتهای زیستی موجودات زنده سودمند نیستند و در غلظتهای خیلی پایین (میکروگرم در لیتر) برای ارگانیسمها سمی هستند (15). اگر چه گفته شده که میزان جیوه در طبیعت خیلی ناچیز است، با این حال مقادیر قابل توجهی از آن در سراسر جهان گزارش شده است (7). انتشار جیوه تا حدود زیادی به واسطه استخراج معادن، کارخانجات ساخت تجهیزات الکتریکی و صنایع چاپ میباشد همچنین این فلز یکی از معدود فلزاتی است که میتواند در بافتهای موجودات زنده ذخیره شود و باعث تجمع زیستی شود. جیوه به آسانی در بدن موجودات زنده از حالت ترکیب معدنی و دارای سمیت کم، به صورت ترکیبات آلی با سمیت بالا تغییر شکل میدهد(18). در این راستا، با توجه به اهمیت منابع آبی چاهنیمههای سیستان بواسطه حضور گونههای منحصر به فرد موجودات آبزی از جمله ماهی سفیدک سیستان (8) و حضور گونه های متعدد روتیفرها از جمله گونه B. calyciflorus در این منابع آبی(4)، در مطالعه حاضر اثرات سمی جیوه بر تراکم و نرخ رشد جمعیت روتیفر آب شیرین B. calyciflorus جدا شده از منابع آبی چاهنیمههای سیستان مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
کشت جلبک Chlorella vulgaris : استوک خالص جلبک Chlorella vulgaris از پژوهشکده آبزی پروری آبهای داخلی انزلی تهیه و تحت شرایط استریل در محیط کشت زایندر (Z-8±N)(14،17) در دمای 1±25 درجه سانتیگراد، نور 300±3500 لوکس و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی به صورت نیمه انبوه کشت داده شد (1).
نمونه برداری: به منظور دستیابی به تعداد کافی از روتیفر آب شیرین B. calyciflorus مورد نیاز جهت کشت در آزمایشگاه، در اواخر فروردین سال 1390 از منابع آبی چاهنیمههای سیستان نمونه برداری صورت گرفت. جهت نمونه برداری از تور پلانکتونی 50 میکرونی استفاده شد. نمونههای آب در ظروف شیشهای 5/0 تا 1 لیتری جمع آوری و بلافاصله به آزمایشگاه منتقل گردید.
جداسازی و کشت روتیفر: با توجه به این که نمونههای آب، حاوی گونههای متعددی از موجودات آبزی مختلف از جمله دافنی، کپه پود، کلادوسر، روتیفر و غیره بوده است، لذا به منظور جداسازی روتیفر گونه مورد نظر، پس از هم زدن نمونه ها، 1 تا 2 میلیلیتر از نمونه آب در پتری دیش با استفاده از استریومیکروسکوپ با بزرگنمایی X10 مشاهده و مطابق با کلید شناسایی (22)، گونه
B. calyciflorus شناسایی و جداسازی گردید. پس از آماده سازی اتاقک کشت روتیفر و استریل نمودن محیط آزمایشگاه با استفاده از اشعه فرابنفش (UV) و اتانول °96، به منظور دستیابی به تراکم مورد نیاز جهت انجام آزمایشهای مربوط به سمیت فلزات سنگین، روتیفر جداسازی شده در آزمایشگاه در شرایط مطلوب کشت داده شد. درجه حرارت محیط آزمایشگاه در طول مدت آزمایش c˚1± 25 (24، 30) و 5/7= pH (24) ثابت نگه داشته شد. جهت کشت روتیفر از محیط کشت نیمه سخت EPA (حل کردن 96 میلیگرم NaHCo3، 60 میلیگرم CaSo4، 60 میلیگرم MgSo4 و 4 میلیگرم KCl در یک لیتر آب مقطر دو بار تقطیر)(5) و جهت تغذیه روتیفرها در طی دوره آزمایش، از جلبک سبز تک سلولی کلرلای آب شیرین (Chlorella vulgaris) با تراکم cells/ml 106×5/1- 1 استفاده گردید. کشت خالص روتیفر به عنوان استوک جهت انجام آزمایشات سمیت فلزات سنگین استفاده گردید و برای تأمین تعداد مورد نیاز روتیفر در طول مدت آزمایش، کشت روتیفر به طور پیوسته ادامه پیدا کرد.
تیماردهی روتیفرها با فلز سنگین جیوه: جهت انجام آزمایش، روتیفرها با 5 غلظت مختلف از فلز جیوه (0005/0، 001/0، 002/0، 004/0 و 008/0 میلیگرم درلیتر) تیمار شدند. جهت تیماردهی، مقدار مورد نیاز از ترکیب شیمیایی کلرید جیوه با استفاده از ترازوی حساس توزین و به محیط کشت پایه (غلظت 1000 میلیگرم بر لیتر) با غلظت مشخص در لولههای آزمایش 50 میلی لیتری مخصوص کشت روتیفر اضافه گردید. سپس جلبک و روتیفر با تراکم مشخص به این لولههای آزمایش حاوی محیط کشت روتیفر افزوده شد. به طوری که به هر کدام از لولههای آزمایش 10 عدد روتیفر ماده نوزاد با سن تقریبی 2 ساعت معرفی گردید. دوزهای انتخابی بر اساس استاندارد فلز سنگین جیوه جهت اهداف شیلاتی (19) و همچنین غلظت کشنده این فلز برای روتیفر آب شیرین B.calyciflorus (34) انتخاب گردیدند. برای فلز جیوه 5 غلظت (تیمار)، به ازای هر تیمار 3 تکرار و یک تیمار عاری از فلز سنگین با سه تکرار به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و در مجموع گروههای آزمایشی شامل 6 تیمار و 18 تکرار (نمونه) آماده شدند. به طور روزانه پس از بررسی نمونهها و ثبت شاخصهای مربوط به رشد و تولید مثل، محیط کشت روتیفرها در همه نمونهها تعویض می شد (24،32). جهت تغذیه روتیفرها جلبک کلرلای آب شیرین (Chlorella vulgaris) با تراکم 106×5/1-1 سلول در هر میلیلیتر به هر کدام از لولههای آزمایش اضافه گردید. به منظور تعویض محیط کشت، محتوی لولههای آزمایش با استفاده از توری پلانکتونی 50 میکرونی فیلتر شده و با استفاده از محیط کشت از قبل آماده شده ، به لولههای جدید منتقل شدند. جهت تعیین تراکم جلبکی از لام نئوبار و میکروسکوپ معمولی دو چشمی و جهت شمارش روتیفرها از لام بوگاروف و استریومیکروسکوپ استفاده شد. به طور روزانه پارامترهای مربوط به رشد روتیفر (تراکم و نرخ رشد ویژه) در همه تیمارها بررسی و نتایج ثبت گردید. تا روز سوم پس از شروع آزمایش، به دلیل پایین بودن تراکم روتیفرها و به منظور کاهش خطای آزمایش، تمام حجم نمونهها بررسی و از روز سوم تا پایان آزمایش، از هر کدام از لولهها پس از همگن سازی، 3 نمونه یک میلیلیتری بررسی می شد.
محاسبه نرخ رشد جمعیت روتیفرها در تیمارهای مختلف: به منظور بررسی اثر غلظتهای مختلف فلز سنگین جیوه بر رشد روتیفر، پس از تیماردهی روتیفرها با غلظتهای متفاوت فلز سنگین و ثبت دادههای خام، نرخ رشد جمعیت روتیفرها در هر روز برای هر یک از تیمارها با استفاده از فرمول زیر محاسبه گردید (13).
در این فرمول، r نرخ رشد جمعیت روتیفرها بر حسب روز، N0 و Nt به ترتیب تراکم اولیه و نهایی روتیفرها در هر تیمار و t تعداد روزهای آزمایش می باشد.
آنالیز آماری: پس از ثبت دادهها، ابتدا از آزمون لون و کولموگروف- اسمیرنوف، نرمال بودن دادهها بررسی شد و برای مقایسه کلی بین تیمارها از آزمون تجزیه واریانس یکطرفه (one way ANOVA) و برای مقایسه میانگین بین تیمارها و بررسی روند معنیداری از آزمون دانکن تحت نرم افزار SPSS (نسخه 19) استفاده شد. همچنین جهت رسم نمودارها از نرم افزار Excel استفاده شد.
نتایج
بررسی اثر فلز جیوه بر تراکم روتیفرها: میانگین تراکم روتیفرهای تیماردهی شده با غلظتهای مختلف فلز سنگین جیوه در روزهای مختلف در جدول 1 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت این فلز تراکم روتیفرها به طور معنیداری (05/0>P) کاهش می یابد. به طوری که در همۀ روزهای آزمایش (از روز دوم تا دوازدهم) بین تیمار شاهد و تیمارهای حاوی غلظتهای مختلف فلز جیوه اختلاف معنیداری (05/0>P) مشاهده شد. بیشترین تراکم (40/0±55) در روز دهم در تیمار شاهد مشاهده شد. بیشترین تراکم (07/0±87/45 عدد در میلی لیتر) در روز آخر مربوط به تیمار شاهد و کمترین تراکم (03/0±02/6 عدد در میلی لیتر) مربوط به تیمار حاوی غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر فلز جیوه بود. شکلهای 1- الف تا 1- ج روند تغییر تراکم روتیفرها را در غلظتهای مورد آزمایش جیوه طی روزهای اول تا دوازدهم نشان میدهد. به طوری که در تیمار شاهد میانگین تراکم از روز اول تا روز پنجم افزایش یافت و در روز پنجم به 60/0±01/39 عدد روتیفر در هر میلیلیتر رسید.
شکل1- تراکم روتیفرها (بر حسب تعداد در میلی لیتر) در غلظتهای مختلف فلز سنگین جیوه در روزهای مختلف.
از روز پنجم تا روز ششم تراکم کاهش یافت. از روز ششم تا روز دهم تراکم با شیب تقریباً یکنواختی افزایش یافت به طوری که در روز دهم به حداکثر میزان خود (55 عدد روتیفر در هر میلیلیتر) رسید و از روز دهم تا دوازدهم کاهش یافت (شکل 1- الف).
در روند تراکم روتیفرها در همه تیمارهای حاوی غلظتهای مختلف فلز سنگین جیوه دو پیک در روزهای چهارم و نهم مشاهده گردید (شکل 1- ب تا 1- ج). در همه تیمارهای حاوی غلظتهای فلز جیوه، در مقایسه با تیمار شاهد تراکم کاهش پیدا کرد (شکل 1- ب تا 1- ج). به طور کلی در هر روز با افزایش غلظت فلز تراکم روتیفرها کاهش پیدا کرد و در روز دوازدهم از 03/0±89/14عدد روتیفر در هر میلیلیتر در غلظت 0005/0 میلیگرم در لیتر فلز جیوه به 03/0±02/6 عدد روتیفر در هر میلیلیتر در غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر فلز جیوه رسید.
همچنین نتایج مشخص نمود که با افزایش غلظت فلز جیوه، نرخ رشد ویژۀ جمعیت روتیفرها کاهش می یابد و از 35/0در تیمار شاهد به 16/0در غلظت 008/0 میلیگرم در لیتر فلز جیوه می رسد (شکل 2).
شکل 2- نرخ رشد ویژۀ جمعیت روتیفرها (به ازای روز) در غلظتهای مختلف فلز سنگین جیوه (Hg). حروف مشابه روی نمودار در هر روز، نشان دهنده عدم وجود اختلاف معنیدار میباشد (05/0>P ).
بحث
مطالعات مربوط به رشد جمعیت از مهمترین جنبههایی هستند که برای ارزیابی اثرات سمیت فلزات سنگین و آفتکشها در زئوپلانکتونها مورد استفاده قرار میگیرند (6). روتیفرها نسبت به غلظتهای تحت کشنده مواد آلاینده پاسخهای مختلفی از جمله تغییر در سرعت شنا، تغذیه و تنفس از خود نشان میدهند (25). در میان روتیفرهای جنس Brachionus، B. calyciflorus،
B. rubens و B. patulus به طور وسیعی برای بررسی سمیت محیطی مطرح هستند (11). بر اساس مطالعات انجام شده جهت تعیین غلظت کشنده جیوه در روتیفرها، غلظت کشنده این فلز برای گونههای مختلف بین 27 تا 61 میکروگرم در لیتر تعیین شد (32). در مطالعات گذشته غلظت کشنده جیوه برای گونه B. calyciflorus، 06/0 میلیگرم در لیتر تعیین شد (34). غلظتهای انتخابی برای فلز جیوه در آزمایش حاضر بر اساس این غلظت کشنده تعیین گردید. به طوری که بالاترین غلظت انتخابی 5/7 برابر کوچکتر از غلظت کشنده و بقیه غلظتها با نسبت مشخص پایینتر از این غلظت انتخاب شدند. همچنین غلظتها به گونهای انتخاب شدند که غلظت میانه (002/0 میلیگرم در لیتر) برابر با استاندارد فلز جیوه جهت اهداف آبزی پروری باشد. غلظتهای مورد استفاده برای فلز جیوه در این آزمایش در محدوده غلظتی گزارش شده در منابع آبی آلوده شده با فلزات سنگین بوده است (28). سیانوباکتریهای رشتهای مثل جلبکهای سبز-آبی Anabaena flos- aquae و Oscillatoria africanum به دلیل مزاحمتهای مکانیکی، داشتن ترکیبات سمی و عدم خوش خوراکی، جهت تغذیه زئوپلانکتونهای علفخوار نامناسب میباشند (2). از طرفی جلبک تک سلولی Chlorella vulgaris منبع غذایی مناسبی جهت ارزیابی الگوهای رشد در روتیفرها معرفی شده است (33)، لذا در تحقیق حاضر از این جلبک جهت تغذیه روتیفرها استفاده گردید. در بررسیهای سمیت مزمن مواد سمی در زئوپلانکتونها، نرخ رشد جمعیت یکی از متغیرهای بسیار حساس نسبت به سطوح مختلف مواد سمی میباشد (9،23). در مواقعی که استرس ناشی از مواد سمی بسیار شدید باشد، حتی اگر تراکم روتیفرها در ابتدا کمی افزایش پیدا کند، ولی روی هم رفته نرخ رشد ویژه میتواند منفی باشد (27). چنین حالتی در برخی از جنسهای روتیفرها از قبیل: Asplanchna (29)، Brachionus (16)،
Euchlanis dilatata (31) گزارش شده است. در آزمایش حاضر با افزایش جیوه در محیط کشت روتیفر
B. calyciflorus ، نرخ رشد جمعیت کاهش پیدا کرد ولی همواره مثبت بود. این گونه روتیفر نسبت به غلظتهای مختلف جیوه حساسیت نشان داد و نتایج بدست آمده نشان داد که رشد جمعیت روتیفرها با افزایش غلظت این فلز کاهش پیدا می کند. نتایج به دست آمده با یافتههای Rios-Arana و همکاران (26) بر روی روتیفر
Plationus patulus مطابقت دارد. همچنین گزارش شده که افزایش غلظت مواد سمی (فلزات سنگین، آفت کشها و غیره) تأثیر منفی شدیدی بر رشد جمعیت روتیفر
B. rubens داشته است (32). بر اساس نتایج به دست آمده در این آزمایش، در رابطه با اثر فلز جیوه بر تراکم و نرخ رشد روتیفر B. calyciflorus ، با افزایش غلظت فلز حتی در کمترین غلظت (0005/0 میلیگرم در لیتر کلرید جیوه) تراکم و نرخ رشد روتیفرها کاهش یافت، که با نتایج بدست آمده از بررسی اثر جیوه بر رشد جمعیت Brachionus patulus (32)، نتایج بدست آمده از بررسی اثر فلز نیکل بر تراکم و نرخ رشد روتیفر B. calyciflorus (3)، همچنین با یافتههای Grosell و همکاران (10) در رابطه با اثر سرب بر نرخ رشد جمعیت روتیفر
B. calyciflorus مطابقت دارد. نوسانات نمودارهای مربوط به تراکم روتیفرها در شکل 1 مربوط به چرخه زندگی روتیفرها می باشد. به عنوان مثال کاهش تراکم روتیفرها در شکل 1 در روزهای ششم و هفتم به دلیل پایان یک چرخه زندگی موجود و افزایش مجدد تراکم روتیفرها به دلیل شروخ چرخه جدید می باشد که چنین روندی در نتایج بدست آمده از بررسی اثر جیوه بر ساختار جمعیت روتیفر Brachionus calyciflorus Pallas (25) نیز نشان داده شده است.
نتیجه گیری کلی
بر اساس نتایج این تحقیق، کاهش شدید تراکم و نرخ رشد روتیفر B. calyciflorus با افزایش غلظت فلز جیوه، نشان دهنده حساسیت بالای این گونه روتیفر نسبت به فلز مذکور میباشد. بنابراین میتوان روتیفر آب شیرین
B. calyciflorus را به عنوان نماینده جهت بررسی و پایش فلز جیوه در منابع آبی سیستان و احتمالاً سایر اکوسیستمهای آبی کشور معرفی نمود. همچنین با تعیین آستانه تحمل این گونه روتیفر در برابر فلز جیوه، می توان از آن به عنوان شاخص زیستی در منابع آبی سود جست.
سپاسگزاری
بدین وسیله نگارندگان از مدیریت محترم پژوهشکدۀ تالاب بین المللی هامون به خاطر حمایتهای مالی و از جناب آقای پروفسور سارما (S. S. S. Sarma, National Autonomous University of Mexico,Campus Iztacala) و سرکار خانم پروفسور ناندینی (S. Nandini, National Autonomous University of Mexico,Campus Iztacala) به خاطر متذکر شدن نکات کلیدی و در اختیار قرار دادن مقالات و دستورالعملهای لازم برای انجام آزمایش سمیت، تشکر و قدردانی مینمایند.