تعیین نقطه فوق سرما و برخی از عوامل مؤثر بر آن در پروانه جوانه­خوار Palpita unionalis Hubner (Lep: Pyralidae) زیتون

زهرا حکمت، مرتضی موحدی فاضل^* و کبری فتوحی

زنجان، دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه گیاه­پزشکی 

تاریخ دریافت: 2/2/93                 تاریخ پذیرش: 7/5/93 

چکیده

شب پره جوانه­خوار زیتون یکی از آفات مهم نهالستان­ها، باغات جوان و پاجوش­های درختان مسن زیتون است. راهبردهای اتخاذ شده از سوی حشرات در جهت سپری نمودن فصل زمستان نقش مهمی را در زنده­مانی آنها دارند، یکی از این راهبردها تنظیم دمای انجماد آنهاست. در این تحقیق سرماسختی این آفت و برخی از عوامل موثر بر آن از جمله دوره نوری و گیاه میزبان بر ظرفیت فوق سرمای پروانه جوانه­خوار زیتون مورد بررسی قرارگرفته است. کلنی در شرایط دمایی 2±24 درجه سانتی­گراد، رطوبت نسبی حداقل 10±60 درصد و دوره نوری 8:16 ساعت (روشنایی: تاریکی) نگهداری شد. در آزمون اول نقاط فوق سرمای افراد زمستان­گذران (لارو سن 5 و شفیره) پروانه جوانه­خوار زیتون پرورش یافته در سه دوره نوری 16، 12 و 8 ساعت نور مورد ارزیابی قرارگرفت. دوره­های نوری مختلف تاثیر معنی­داری بر نقطه فوق سرمای مراحل لاروی و شفیره­گی داشتند (001/0p<)، بطوریکه افراد روز کوتاه در مرحله شفیره­گی ظرفیت فوق سرمای بیشتری را نشان ­دادند. در آزمون دوم نقاط فوق سرمای افراد زمستان­گذران روی 4 گیاه میزبان زیتون، یاسمن، زبان گنجشک و برگ نو مورد آزمایش قرار گرفت. نتایج بیانگر تاثیر معنی­دار گیاهان مورد تغذیه بر نقاط فوق سرما بود (001/0p<)، بطوریکه افراد تغذیه شده از گیاه زیتون ظرفیت فوق سرمای بیشتری را نشان دادند. نتایج بدست آمده در این تحقیق نشان می­دهد که پروانه جوانه­خوار زیتون حشره­ای نامتحمل به سرما است.

واژه­های کلیدی: سرما­سختی، پروانه جوانه­خوار زیتون، دوره نوری، گیاهان میزبان.

* نویسنده مسئول، تلفن: 02433052603 ، پست الکترونیکی: movahedi@znu.ac.ir

مقدمه  

زیتون بعنوان یکی از گیاهان سازگار با شرایط اقلیمی ایران در حال حاضر در 24 استان کشور، سطح زیرکشتی معادل یکصد هزار هکتار و متوسط 61 هزار تن تولید را به خود اختصاص داده است (2). شب پره جوانه­خوار زیتون یکی از آفات مهم نهالستان­ها، باغات جوان و پاجوش­های درختان مسن زیتون است. این آفت اولین بار در ایران در سال 1378 از باغات زیتون شهر رودبار گزارش شد (27). این حشره علاوه بر زیتون بر روی برگ نو بعنوان دومین میزبان مرجح این آفت (5 و 6) و نیز یاس خوشه­ای و زبان گنجشک نیز فعالیت می­نماید. لاروهای سنین مختلف از جوانه­ها و برگ­های انتهایی گیاه میزبان تغذیه کرده و باعث توقف رشد آن می­شوند. تعداد نسل­های این آفت از 2 تا 6 نسل در مناطق مختلف سردسیری و گرمسیری متغیر است (17). این آفت زمستان را بصورت لاروهای سنین سوم تا پنجم و یا شفیره سپری می­کند، امّا در جنوب ایتالیا همه­ی مراحل در طول زمستان دیده می­شود (31). راهبردهای اتخاذ شده از سوی حشرات در جهت سپری نمودن فصل زمستان نقش مهمی را در زنده­مانی آنها دارند، یکی از این راهبردها تنظیم دمای انجماد آنهاست. دما به روش­های مختلفی بر تولید­مثل، طول عمر و رشد و نمو، تاثیر می­گذارد (16 و 26) که نتایج آن بعضاً بصورت ناهنجاری­های مورفولوژیک بروز می­نماید (8). در دمای پایین احتمال بقا، به فاکتورهایی همچون اندازه دما، مدت زمان در معرض بودن و سرماسختی ((Coldhardiness افراد بستگی دارد (7). سرماسختی به توانایی موجود زنده بر بقا طولانی یا کوتاه مدت در دمای پایین اطلاق می­شود (19) و فاکتورهایی همچون پروتئین­ها و ترکیبات ضدیخ نقش قابل توجهی بر سرماسختی و نقطه فوق سرما دارند علاوه بر این، عوامل دیگری نیز بر این فاکتور تاثیرگذارند که از جمله آنها می­توان به میزبان­های گیاهی و طول دوره نوری اشاره کرد. یکی از فاکتورهای تعیین کننده بر میزان زنده­مانی، وزن، طول دوره رشدی، فیزیولوژی حشرات گیاه­خوار و کیفیت گیاه میزبان است. برای حشرات گیاه خوار رشد و نمو اغلب به کیفیت گیاه میزبان مرتبط است (21) و این اثر بر سرعت رشد لارو، مرحله حساس برای القای دیاپوز و سرماسختی به ویژه در حشرات چندخوار دیده شده است (15). علاوه بر این بیشتر حشرات به ویژه آن­هایی که در عرض جغرافیایی بالا زندگی می­کنند برای تنظیم رفتار مناسب و راهبردهای رشدی از اطلاعات طول روز (یا طول شب) در طی فصول استفاده می­کنند. معمولترین این­ راهبردها آغاز وقفه رشد و نموی (Diapause) در حشرات زمستان­ یا تابستان گذران و تنظیم رفتارهای تولید­مثلی فصلی در تعدادی از آنهااست. القای دیاپوز توسط دوره نوری در بیش از 500 گونه از 15 راسته حشرات تعیین شده است. در تمام موارد، پاسخ حشرات به دوره نوری منجر به اتخاذ راهبرد­های فصلی مناسب در جهت تضمین بیشترین بقا می­باشد (29). روند کاهشی طول روز منجر به آماده­سازی حشرات و اتخاذ تمهیدات لازم برای مقابله با سرمای زمستان در آنها می­شود. بنابراین یکی از عوامل موثر بر نقطه فوق سرما همان طول دوره نوری و یا دوران تاریکی است. با توجه به تلفات بالای این آفت در طول زمستان در منطقه طارم علیا (25) و عدم وجود اطلاعاتی در خصوص مقاومت به سرمای این آفت در جهان، تحقیق حاضر تعریف گردید تا در طی آن راهبرد مقاومت به سرما در این حشره تعیین و تاثیر برخی از عوامل موثر بر سرماسختی آن بررسی گردد.

مواد و روشها

در طی این تحقیق برخی از عوامل موثر بر سرماسختی لاروها و شفیره­های پروانه جوانه­خوار زیتون مورد بررسی قرار گرفت. عوامل مورد بررسی شامل نوع میزبان مورد تغذیه بعنوان رژیم غذایی و رژیم نوری بود. تاثیر عوامل مذکور بر مقاومت به سرمای این آفت از طریق محاسبه نقطه فوق سرما در مرحله لاروی سن پنجم و شفیره­گی (بعنوان مهمترین شکل زمستان­گذرانی این آفت) مورد ارزیابی قرار گرفت.

پرورش حشره: جهت پرورش و استقرار کلنی جوانه­خوار زیتون، لاروهای سنین مختلف و شفیره از روی درختان زیتون منطقه­ی طارم علیای زنجان جمع­آوری و به آزمایشگاه منتقل شدند. لاروها، بر روی شاخه­های بریده برگ نو طبق روش عظیمی­زاده و همکاران (5) پرورش داده شدند. ظروف ویژه پرورش لارو شامل سه بخش ذخیره آب، بخش نگهدارنده بوته­ها و پوشش توری بالای ظرف بود. بعد از انتقال لاروها، ظروف پرورش به داخل اتاقک رشد تحت شرایط نوری 8 : 16 (تاریکی: روشنایی)، دمای 2±24 درجه­ی سانتی­گراد و رطوبت نسبی10 ±60 منتقل شدند. این ظروف هر دو روز یکبار مورد بازدید قرارگرفته و بقایای تغذیه و فضولات لاروی از داخل آنها خارج و لاروها دوباره روی شاخه­های تازه­ی برگ نو انتقال یافتند. شفیره­ها پس از تشکیل به ظروف ویژه­ی خروج و تخم­ریزی حشرات کامل منتقل شدند. حشرات کامل آفت با محلول آب و قند 5 درصد تغذیه شدند. به منظور ایجاد زمینه­ی مناسب برای تخم­ریزی حشرات ماده، ظرفی محتوی شاخه­های برگ نو داخل ظروف تخم­ریزی قرار داده شد. شاخه­های حاوی تخم به ظروف پرورش لاروها منتقل گردیدند.

روش انجام آزمایش: تعیین نقطه فوق سرما: برای تعیین نقطه فوق سرما و تغییرات آن در تیمارهای تعریف شده حداقل 10 عدد لارو سن پنجم و به همین تعداد شفیره انتخاب و توسط دستگاه حمام آب سرد(cooling bath)  مجهز به سیستم خنک­کننده حاوی الکل اتیلیک صنعتی با میزان کاهش دمای 5/0 درجه سانتی­گراد بر دقیقه استفاده گردید. برای مهار کردن لارو و شفیره از سرسمپلرهای 1000 میکرولیتری استفاده گردید. بخش جلویی آنها توسط لایه­هایی از پنبه پر شده و در بخش عقبی لارو یا شفیره قرار می­گرفت. سنسور ردیابی تغییرات دما نیز بصورت بسیار نزدیک به بدن لارو یا شفیره تثبیت گردید. لاروها و شفیره­ها هر کدام بصورت مجزا، پس از توزین با ترازویی با دقت 01/0 گرم، در داخل سرسمپلرها قرارگرفته و نقطه فوق سرمای آنها طبق روش لی (19) ثبت گردید. جهت ثبت تغییرات دما از دیتالاگر مدل CHY-502A مجهز به سنسور دمایی K100 با دقت اندازه­گیری 1/0 درجه سانتی­گراد و ثبت ثانیه­ای دما، قابل اتصال به کامپیوتر استفاده شد. زمانی که دمای مایع الکلی حمام آبسرد در بالاتر از صفر درجه سانتی­گراد قرار داشت سرسمپلرهای حاوی حشرات بصورت تکی در داخل حمام آبسرد قرار گرفته و دستگاه شروع به پایین آوردن دما با میانگین 5/0 درجه سانتی­گراد در دقیقه می­نمود. میزان کاهش دما و تغییرات آن توسط نرم افزار بصورت ثانیه­ای ثبت گردید. بطور کلی نقطه فوق سرما به درجه حرارتی اطلاق می­شود که در آن دما، مایع درونی بدن شروع به یخ زدن نموده و گرما آزاد می­نماید. گرمای آزاد شده باعث افزایش دما و تغییر در روند کاهش دما خواهد شد که این تغییرات توسط سنسورهای دیتالاگر ردیابی و ثبت گردید. اولین نقطه­ای که دما در آن حالت افزایشی نشان داد بعنوان نقطه فوق سرما لحاظ شد. علاوه بر این، آخرین حد دمایی که مجدداً دما روند کاهشی را بخود می­گیرد و نیز تفاوت زمانی شروع نقطه فوق سرما تا این حد نیز ثبت گردید. لازم بذکر است نمونه­ها پس از ثبت نقطه فوق سرما از حمام آبسرد خارج و درون ظروف مجزا برای مدت 24 ساعت در دمای محیط نگهداری شدند تا در صورتی که مجدداً احیاء (Recovery) شدند جهت تعیین استراتژی مقاومت به سرما لحاظ شوند.

برخی عوامل موثر بر نقطه فوق سرما: رژیم­ نوری: با توجه به اینکه یکی از فاکتورهای مهم در آمادگی حشرات جهت زمستان­گذرانی طول روز یا همان طول دوران نوری است، در این تحقیق لارو­های سن یک در 3 کلنی مجزا بر روی میزبان برگ نو در سه دوره نوری (8 : 16، 12:12 ،16: 8) (تاریکی: روشنایی) و شرایط دمایی 2±24 درجه سانتی­گراد و رطوبت نسبی10 ±60 درصد پرورش یافتند. پس از تغذیه لارو­ها و ورود آنها به سن پنجم و مرحله شفیره­گی، از هر تیمار حداقل ده عدد لارو سن پنج و ده عدد شفیره به طور تصادفی انتخاب و نقطه فوق سرمای آنها اندازه­گیری شد.

میزبان­های گیاهی: این آفت بر روی زیتون بعنوان میزبان اصلی و سایر گیاهان خانواده Oleaceae از جمله برگ نو، یاس خوشه­ای و زبان گنجشک فعالیت می­نماید (4).‌ با توجه به حضور همزمان این میزبان­ها در مناطق تحت کشت و کار زیتون، در این بررسی علاوه بر زیتون تاثیر تغذیه از سایر میزبان­ها بر مقاومت به سرمای این آفت ارزیابی گردید. بدین منظور لارو­های سن 1 در 4 کلنی مجزا بر روی میزبان­های زیتون، برگ ­نو، زبان گنجشک و یاس خوشه­ای در شرایط نوری 8 : 16 (تاریکی: روشنایی)، دمای 2±24 درجه­ی سانتی­گراد و رطوبت نسبی10±60 درصد پرورش یافتند. پس از تغذیه حشره از میزبان­های مذکور برای هر تیمار حداقل ده عدد لارو سن پنج و ده عدد شفیره به طور تصادفی انتخاب و نقطه فوق سرمای آن­ها تعیین گردید.

تجزیه آماری: تجزیه و تحلیل داده­ها با استفاده از نرم­افزارهای آماری استاتیستیکس  (Statistix)و مینی­تب16  (Minitab)صورت گرفت. آزمون مقایسات میزبان با چهار میزبان (زیتون، برگ نو، زبان گنجشک، یاس خوشه­ای) و دو مرحله رشدی (لارو کامل و شفیره) در قالب طرح کاملاً تصادفی و داده­های مربوط به تاثیر دوره نوری به صورت آزمون فاکتوریل دو متغیره با سه سطح دوره نوری (16، 12، 8) ساعت روشنایی و دو سطح مرحله رشدی (لارو کامل و شفیره) برای هر تیمار آزمایشی در ده تکرار در قالب طرح کاملاً تصادفی اجرا شد. مقایسه میانگین داده‌ها نیز با استفاده از آزمون توکی در سطح احتمال 95 درصد انجام شد.

نتایج و بحث

تاثیر دوره نوری بر نقطه فوق سرما: با توجه به تأثیر دوره نوری بر القاء دیاپوز در حشرات توأم با ایجاد آمادگی برای تحمل سرمای زمستان در این تحقیق، سه دوره نوری (8 : 16 ،12:12 ،16 : 8) (تاریکی: روشنایی)، در دوران پرورش لارو و شفیره اعمال و تاثیر آن بر روی نقطه فوق سرما بررسی گردید. نتایج حاصله بیانگر تاثیر معنی­دار دوره نوری و نیز مرحله رشد و نموی بر روی نقطه فوق سرما در این حشره می­باشد (001/0p<). بعلاوه تجزیه آماری اثرات توأم فاکتورهای فوق، بیانگر تاثیر معنی­دار آنها بر روی تغییرات نقاط فوق سرمای حاصله از تاثیر دوره نوری می­باشد (001/0p<) (شکل 1). بطوریکه کمترین مقدار نقطه فوق سرما در دوره نوری (8:16) (تاریکی: روشنایی)، با میانگین39/0±25/11- و بیشترین مقدار در دوره نوری (8 :16) (تاریکی: روشنایی)، با میانگین 36/0 ±06/9- مشاهده شد. همچنین نقطه فوق سرما در دوره نوری (12:12) ما بین دو رژیم قبل و با میانگین45/0± 09/10- واقع شده است.

                                    (ب)                                                                                                        (الف)        

شکل 1- نمودار حاصل از تاثیر سطوح مختلف دوره نوری بر میانگین نقاط فوق سرما در لارو سن پنج و شفیره جوانه­خوار زیتون

 P. unionalis  (الف)، مرحله رشدو نموی حشره (ب) طول دوره نوری

در این تحقیق سه دوره نوری 16، 12 و 8 ساعت نور تفاوت معنی­داری را در میانگین نقاط فوق سرمای پروانه جوانه­خوار ایجاد کرده و به طوری که لارو سن 5 و شفیره­های کلنی پرورش یافته در شرایط 8 ساعت نور نقطه فوق سرمای پایینتر و در نتیجه تحمل به سرمای بیشتری را نسبت به افرادی که در دو شرایط دیگر قرار داشتند نشان دادند. طول روز بعنوان فاکتور کلیدی در تصمیم گیری­های موجودات می­باشد بطوریکه کاهش آن تداعی فصول پاییز و زمستان و افزایش آن تداعی فصول بهار و تابستان را دارد. برای مثال در مگس Drosophila montana طول روز 22 تا24 ساعت باعث افزایش میزان ویتلوژنین در حشرات ماده و آمادگی برای تولید­مثل می­شود. طول روز 5/15 تا 5/18 ساعت باعث کاهش ویتلوژنین در حد متوسط و کاهش تولید­مثل می­شود و حد متوسطی از مقاومت به سرما را نشان می­دهند و طول روز­های کمتر توقف تولید­مثل و افزایش بیشتر مقاومت به سرما را به همراه داشته است. بعبارت دیگر شرایط نور کوتاه در مقایسه با شرایط نور بلند فنوتیپ­های متحمل به سرما ایجاد کرده است (33). نتایج این تحقیق نیز روند مطلوبی از تغییرات طول روز توام با آمادگی برای زمستان­گذرانی و افزایش مقاومت به سرما را در قالب نقطه فوق سرما نشان می­دهد، بطوریکه همبستگی بین نقاط فوق سرمای لاروهای سن پنجم جوانه­خوار زیتون و رژیم نوری از معادله درجه اول (1) تبعیت می­کند.

1)                      

نتایج تحقیقات انجام شده در این زمینه نیز موید اطلاعات ارائه شده می­باشد. افزایش تحمل به سرمای افراد ماده در شرایط روز کوتاه می­تواند با بر هم کنش بین دیاپوز و طول روز القا شود. دوره نوری می­تواند بر ترکیب غشای لیپیدی تاثیر گذاشته که این فرآیند مشابه تاثیری است که با قراردادن حشره در معرض دمای پایین بوجود می­آید (12). در گونه Dendroides Canadensis مشاهده شد که روز کوتاه منجر به افزایش تولید پروتئین­های تاخیر دمایی (Termal hysteresis proteins) می­شود اما اثری بر القاء دیاپوز ندارد (14). درD. Montana  طول روز کوتاه می­تواند باعث ایجاد سازش­پذیری به سرما مرتبط با دوره نوریPhotoperiodic cold acclimation) ) از طریق مکانیسم­های مشابه با سازش به سرمای مرتبط با دما (Temperature-mediated cold acclimation) شود. در افراد ماده بدون دیاپوز این حشره، دوره نوری اثری بر سرماسختی ندارد (33).

نتایج آنسارت و همکاران (3) نشان داد که طول روز اثری معنی­دار بر ظرفیت فوق سرمای H. aspersa می­گذارد. بطوریکه این حشره در روز کوتاه با 12 ساعت نور نقطه فوق سرمای کمتری را نسبت به روز بلند با 16 ساعت نور نشان داد در این گونه افزایش ظرفیت فوق سرما کمی قبل از آغاز زمستان شروع شده و کاهش دوره نوری ورود به مرحله کمون (Dormancy) را القا می­کند. در این دوره تغذیه متوقف شده و شروع به از دست دادن آب می­کند که منجر به کاهش وزن­تر و وزن خشک آن می­شود. همچنین بررسی­های انجام شده توسط گوتو و همکاران (11) نشان داد که در گونه Xestia c-nigrum L. طول روز کوتاه توانایی تحمل به انجماد را در افراد القا می­کند.

تاثیر گیاه میزبان بر نقطه فوق سرما: با توجه به تاثیر مستقیم ترکیبات غذایی بر سرماسختی در حشرات، در این تحقیق تاثیر تعدادی از گیاهان میزبان شامل برگ نو، زبان گنجشک، یاس خوشه­ای و زیتون روی نقطه فوق سرمای مرحله لاروی و شفیره­گی پروانه جوانه­خوار زیتون مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصله بیانگر تاثیر معنی­دار گیاهان میزبان و نیز مرحله رشد و نموی روی نقاط فوق سرما در این حشره می­باشد (001/0p<). کمترین مقدار نقطه فوق سرما در لاروهای تغذیه شده از زیتون، با میانگین50/0±9/10- و شفیره­های حاصله از آنها، با میانگین 22/0±90/10- و شفیره­های تغذیه شده با برگ نو، با میانگین 56/0±96/10- و بیشترین مقدار در لاروهای تغذیه شده با برگ نو با میانگین 26/0±91/5- مشاهده گردید (شکل2). در این تحقیق لاروهای سن پنجم پرورش یافته بر روی زبان گنجشک به شفیره تبدیل نشدند و اندازه­گیری نقطه فوق سرمای این مرحله میسر نگردید.

در این تحقیق نوع میزبان تفاوت معنی­داری را در نقطه فوق سرما ایجاد کرده و به طوری که لاروهایی که از گیاه زیتون تغذیه کرده بودند نقطه فوق سرمای پایین­تری را نسبت به لاروهایی که از سه میزبان دیگر تغذیه کرده بودند نشان دادند. با توجه به اینکه برخی از اجزاء غذایی همچون ترکیبات غذایی بطور مستقیم یا غیرمستقیم بعنوان عوامل ضدیخ عمل می­نمایند. بنابراین بخشی از تفاوتهای میزبانی بدلیل تفاوت احتمالی در کیفیت و کمیت این اجزاء خواهد بود. در تحقیقی مشخص شد در بین درختان زیتون، رقم آربیکن  (Arbequina)نه تنها بسیار متحمل به سرماست بلکه بیشترین سازگاری را به شرایط متنوع رشدی نشان می­دهد. همچنین تحقیقی دیگر وجود مانیتول در زیتون اروپایی  (Olea uropea)را گزارش نموده است، که ترکیب مهمی برای تحمل تنش شوری و نیز تخصیص انرژی و کربن در تولید میوه زیتون است (9).

شکل 2- نمودار گروه­بندی تاثیر میزبان­ های مختلف و نیز مراحل رشد ونموی آفت بر نقطه فوق سرما در جوانه­خوار زیتون P. unionalis