بررسی ریخت شناسی و مولکولی ژله­فیش گونه (Cnidaria: Scyphozoa Pelagia noctiluca (Forsskal, 1775)) با تشکیل بالقوه شکوفایی در سواحل جنوب شرق ایران (دریای عمان)

گیلان عطاران فریمان^* و علی دلاور

چابهار، دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار، دانشکده علوم دریایی، گروه زیست­شناسی دریا

تاریخ دریافت: 5/7/92                 تاریخ پذیرش: 15/6/93

چکیده

در سالهای اخیر بلومهای پلانکتونی در آبهای ساحلی دنیا رو به افزایش است. رده سیفوزوا از مرجانها به ژله­فیش های حقیقی معروفند که اغلب این پلانکتونها دارای پتانسیل تشکیل بلوم در آبهای ساحلی هستند و می­توانند اثرات نامطلوبی را بر روی صید و صیادی و ذخایر آبزیان بگذارند. بنابراین شناسایی گونه­های عامل بلوم از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. در بررسی حاضر، گونه­ای از ژله­فیش که در بهمن­ماه سال 1390 در سواحل خلیج چابهار بلوم کرده بود نمونه­برداری گردید. نمونه­ها ابتدا از نظر مورفولوژی شناسایی سپس بمنظور بررسی توالی ژنی استخراج DNA انجام شد و پس از عمل PCR توالی ژنی در ناحیه
18S-rRNA تعیین گردید. توالی ژنی گونه­ی پلانکتون بلوم کرده از ایران با 25 توالی دیگر از بانک ژن در ناحیه ژنی مشابه مقایسه گردید. بررسی فیلوژنی با استفاده از آنالیز حداکثر احتمال(Maximum Likelihood) انجام شد. نتایج بدست آمده نشان داد که توالی ژنی گونه  جمع اوری شده از خلیج چابهار با 99% به گونه Pelagia noctiluca شباهت دارد. گونه ایرانی با گونه­ P. noctiluca در یک کلاد قرار گرفته که با بقیه جنس­های خانواده پلاژیده (Pelagiidea) در یک کلاد خواهری قرار می گیرند. نتایج کلی تحقیق نشان داد که رده سیموستوما چند نیا هستند و بررسی مولکولی همراه با ریخت­شناسی برای شناسایی گونه­های ژله­فیش که بیشتر بافت آنها را آب تشکیل می­دهد و شناسایی ریخت شناسی آنها دشوار و بسیار مفید می­باشد.

واژه­های کلیدی: Pelagia noctiluca، ژله­فیش، پلانکتون، خلیج چابهار، تبارزایی، 18S-rRNA

* نویسنده مسئول، تلفن: 09151450078، پست الکترونیکی: Gilan.attaran@gmail.com 

مقدمه

مدوزوزوا ((Medusozoa زیرشاخه ای از شاخه نیداریا(Cnidaria) هستند که تقریباً شامل 3800 گونه از سه رده هیدروزوا  (Hydrozoa)، کوبوزوا (Cubozoa) و سیفوزوا (Scyphozoa) می­باشند (16). ژله­فیش­ها متعلق به رده سیفوزوا است که دارای بیش از 220 گونه بوده و اغلب نمونه­های این رده به شکل مدوز می­باشند، پولیپ بسیار کوچک است و یا وجود ندارد (23). تنوع گونه­ای در این رده خیلی بیشتر حداقل دو برابر این تعداد حدس زده  می­شود (19، 18). مدوزوزوئن­ها، فرم­های گوناگونی در مراحل چرخه زندگی­شان از جمله کف­زی و پلانکتونی را دارا هستند، خیلی از گونه­ها نیز هر دو فاز را در چرخه زندگی­شان دارا می­باشند. زئوپلانکتونها به عنوان غذای لاروها، ماهیان و بی­مهره­گان آبزی می­باشند (3). از لحاظ بوم شناختی، مدوزوزوئن­ها، شکارچیان حریص زئوپلانکتونی می­باشند که می­توانند اثرات چشمگیری بر ساختار و عملکرد بوم سازگان داشته باشند (45 و 44). آن­ها با شکل بدنی مدوزی در چرخه­ی زندگی بعضی از گونه­ها و یک ژنوم میتوکندریایی خطی (6 و46)، از گروه خواهریشان (رده­ی آنتوزوا) تشخیص داده می­شوند (7، 10 و 12). دریانبرد و داوسون در سال 2008 گونه­ای از این پلانکتونها را که در دریای عمان و خلیج­فارس بلوم کرده بود (Crambionella orsisni) را مورد شناسایی و بررسی قرار دادند. به علاوه از مطالعاتی که تاکنون بر روی گونه های ژله­فیش انجام شده است می­توان به کولینز در سال (1998 و 2002) و نیز دالی در سال 2005 اشاره کرد. mtDNA به صورت گسترده­ای در قارچ­ها، گیاهان و گروه­های مختلفی از یوکاریوتهای تک سلولی مورد مطالعه قرارگرفته است (33، 36، 30 و 8). امروزه نه تنها در مورد مدوزوزوئن­ها بلکه در مورد اکثر بی­مهره­گان و حتی مهره­داران آنالیز DNA یکی از روش­های مطمئن در امر شناسایی و در نتیجه بررسی­های تکاملی، ارایه­شناختی و ژنتیک جمعیت­های دریایی بحساب می­آید (2). در این مطالعه هدف شناسایی گونه­ی پلانکتونی که در سال 1390 در سواحل دریای عمان بلوم کرده می­باشد.

مواد و روشها

نمونه­برداری از نمونه­های پلانکتونی بلوم کرده خلیج چابهار، از ایستگاه واقع در ساحل دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار با موقعیت جغرافیایی 25°18΄N  60°36΄E با استفاده از تور پلانکتون با چشمه 100 میکرون، یا با استفاده از بطری در بهمن ماه سال 1390 انجام شد (شکل1).

شکل 1- موقعیت منطقه نمونه­برداری که با رنگ قرمز نشان داده شده است.

بعضی نمونه­های پلانکتونی در سطل حاوی آب دریا نگهداری شده و بمنظور بررسی­های ریخت­شناسی و مولکولی به آزمایشگاه منتقل شده و بعضی نمونه­ها در محل نمونه برداری در اتانول 95% تثبیت شدند.

استخراج DNA از نمونه­های تازه و نمونه­های مدوزی نگهداری شده در اتانول %95 با استفاده از روش­های استخراج DNA مختلفی مانند، CTAB، GUTC، Phenol/chloroform و بافر لیزکننده (Farming inteligen Taiwan.)، (براساس کیت IQ 2000) انجام شد. کیفیتDNA  استخراج شده بر روی ژل آگارز 1% با استفاده از رنگ بارگذاری در دستگاه الکتروفورز و کمیت آن با استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومتر مدل RS232C بررسی گردید. تصاویر باندهای DNA تشکیل شده بر روی ژل در دستگاه مستند ساز مدل E_BOX_VX2/2M تصویربرداری گردید و سپس در فریزر20- درجه­ی سانتی­گراد برای انجام آنالیزهای بعدی نگهداری شدند. تکثیر ژن ناحیه rDNA s-18 با استفاده از آغاز­گرهای 18Sa (Forward) (5’- ACC CTG GTT GAT CCT GCC AGT)- 18Sb (Reverse) (5’-GAT CCT TCT GCA GGT TCA CCT AC-3’),  (42) انجام شد. PCR با استفاده از دستگاه توسعه و بسط مدل5331  Ependorf در هر واکنش پلیمراز زنجیره­ای 20 نانوگرم DNA بعنوان نمونه الگو و،10x buffer 3mM MgCl₂،1 UTaq  و 200mM dNTP و 10 پیکومول از آغاز­گرهای رفت و برگشت در حجم 50 میکرولیتری استفاده شد. برنامه­ی واکنش­های زنجیره­ی پلیمراز عبارتند از: شامل واسرشت سازی اولیه به مدت 4 دقیقه در درجه حرارت 95 درجه­ی سانتی­گراد، سپس 38 سیکل که شامل واسرشتگی در دمای 94 درجه­ برای مدت 40 ثانیه، اتصال آغازگرها در 59 درجه­ برای 1 دقیقه، بسط در 72 درجه برای 5/2 دقیقه و بسط نهایی در 72 درجه برای 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR پس از رنگ­آمیزی با اتیدیوم برومید بر روی ژل آگارز 1% حرکت کردند و پس از خالص­سازی، توالی­یابی و بررسی گردیدند. در این مطالعه بمنظور آنالیزهای تبار شناسی و رسم درخت شجره شناسی گونه­ی ایرانی مورد نظر از نرم‌افزارهای MEGA Ver 5 (52) و آنالیز حداکثر احتمال با 1000 بوت استراپ استفاده شد و بمنظور همردیفی (alignment) از برنامه­هایBioEdit  و ClustalX استفاده گردید (26 و 31). گونه­ی Paranthus niveus نیز بعنوان گروه خارجی در این آنالیزها در نظر گرفته شده است (4) که به رده­ی آنتوزوا و خانواده­ی اکتینوستولیده تعلق دارد. شناسایی ریخت­شناسی گونه براساس منابع موجود انجام شد (41، 38، 49، 51 و 56).

نتایج

گونه­­ی ژله­فیشی که در سواحل چابهار شکوفا گردید، پس از بررسی ریخت شناسی مشخص شد متعلق به جنسPelagia  می­باشد که دارای فرم مدوز چتر ماننداست و دارای یک زنگ شنای (Swimming bell) شب­تاب با قطر 3 تا 12 سانتی­متر در گونه­های بالغ می­باشد(شکل 2). لبه­ی زنگ، 16 لاپتlapet) ( وجود دارد ،برریدگی و تو رفتگی در حاشیه زنگ که محل تجمع اعضای حسی می باشد (شکل 3). 8 بازو از لبه­ی زنگ ناشی می­شود. بطور کلی دارای رنگ صورتی، بنفش یا قهوه­ای روشن می­باشند گونه شکوفا شده در شکل­های 2 و 3 نشان داده شده است از آنجائیکه بیشتر بافت این گونه مرجان را آب گرفته است بعد از خارج شدن از آب جمع شده و حالت بسیار نرم و ژله­ای پیدا کرده و گرفتن عکس­های واضح تر امکان­پذیر نمی­باشد.

شکل2- گونه Pelagia noctiluca در حالت بلوم، در بستر شنی ساحل چابهار (شکل سمت راست) در سال 1390 در شکل سمت چپ پیکان بالایی چترو یا زنگ شنا (Swimming bell) و پیکان پایینی بازوهای این گونه را نشان می دهد.

سطح بالایی زنگ و 4 قطعه­ی دهانی فیلترکننده با مجموع نماتوسیستها پر می­شود. بطوری که  برداشتن نمونه با دست سبب خارش و قرمزی پوست به مدت بیش از یک هفته گردید. نتایج توالی نوکلئوتیدی در بانک ژن به نام گونه Pelagia noctiluca با specimen voucher CHIsP1 و توالی (جفت باز)bp 876 نوکلئوتید با شماره KJ028025 از ایران ثبت گردید. مقایسه توالی ژنی و همردیف سازی و آنالیز­های تبار زایی گونه­ی ژله­فیش از ایران با 25 گونه از بانک ژن در منطقه ژنی مشابه که معرف خانواده­های مختلف مدوزوزوا بودند، جایگاه گونه ایران را در درخت شجره شناسی مشخص کرد (شکل 4). گونه­هایی که در این درخت آمده­اند متعلق به 6 خانواده­ از مدوزوزوا شامل Catostylidae, Ulmaridae، Cyaneidae، Rhizostomatidae،Mastigiidae  و Pelagiidae می­باشند. گونه­ی ژله­فیش از ایران بهمراه 6 تا از گونه­های جنس Chrysaora وmalayensis Sanderia در خانواده پلاژیده قرار می­گیرند.

شکل3- گونه پلانکتونی P. noctiluca جمع آوری شده از آب­های ساحلی خلیج چابهار، در سینی تشریح در آزمایشگاه پیکان ها لاپت ها در حاشیه چتر را نشان می دهند

شکل 4- درخت فیلوژنی گونه Pelagia noctiluca  جدا شده از سواحل جنوب شرق ایران براساس توالی ژنی در قسمتی از ناحیه 18S-rDNA با استفاده از آنالیز (ML). بوت استراپ بر اساس 1000 رونوشت می­باشد. گونه Paranthus niveus نیز به عنوان برون گروه در نظر گرف شده است.

گونه ایرانی با گونه مشابه خود در یک کلاد بصورت تک­نیا قرارگرفته که با 98% بوت استراپ حمایت می­شود. براساس اینکه توالی ژنی مشابه گونه­های مورد آنالیز نیستند و همانطوری که انتظار داریم کاملاً خارج از درخت قرارگرفته است.  

بحث

پنج رده­ی آنتازوا، کوبوزوا، سیفوزوا، هیدروزوا و استاروزوا از مرجانیان شناخته شده­اند (34)، گونه Pelagia noctiluca متعلق به رده سیفوزوا زیررده دیسکومدوزا (Discomedusae) و راسته سیموستوم­ها (Semaeostomeae) و خانواده پلاژیده، ژله­فیشی است که پتانسیل تشکیل بلوم را دارد، بنابراین بصورت ویژه­ای مطالعه شده است. نمونه­های این رده بعنوان ژله­فیش­های حقیقی شناخته شده­اند (23 و 36). در مطالعه حاضر گونه­ای از ژله­فیش­ها که در بهمن ماه سال 1390 در سواحل چابهار شکوفا گردید با بررسیهای ریخت شناسی و مولکولی بعنوان گونه P. noctiluca شناسایی گردید. زیست توده ژله­فیش­ها در فصول خاصی از سال به یکباره به طور چشمگیری افزایش می­یابد که اصطلاحاً گفته می شود که شکوفایی اتفاق افتاده است. هنوز دلایل قطعی برای شکوفایی آنها یافت نشده است (24) اما از علل و عوامل احتمالی شکوفایی ژله­فیش­ها در آبهای جنوبی ایران می­توان به کاهش چشمگیر طعمه­خواران آنها مانند لاک پشت­ها و تون­ماهیان و تغییر کلی رژیم اکولوژیکی منطقه اشاره کرد (1 و 17). با توجه به جهت جریانات دریایی که در خلاف جهت عقربه­های ساعت در دریای عمان و خلیج­فارس است و همچنین پلانکتون بودن این موجودات و عدم قدرت شنای آنها، می­توان حرکت این موجودات را از جایی که بیوماس آنها بیشتر است به جایی که بیوماسشان کمتر است را تابع جریانات دریایی دانست (17). گونه­ی Pelagia noctiluca خاص دریای مدیترانه بوده و تاحدی پراکنش جهانی نیز دارد (39). تحقیقات گسترده و گردآوری اطلاعات بوم شناسی منطقه در دو قرن اخیر مشخص نمود که شکوفایی این گونه همواره با تغییرات اقلیمی منطقه همراه بوده است که عبارتند از: کاهش بارندگی، افزایش دما و افزایش فشار اسمزی. احتمالاً این گونه تنها گونه­ای است که دارای شکوفایی های دوره­ای بوده و در بعضی مناطق مانند دریای مدیترانه هر 12 سال یکبار شکوفا می شود و برای چند سال در این وضعیت باقی می­ماند (45 و 35). این گونه با وجود اینکه هر چند سال یکبار در سواحل جنوب شرقی ایران بلوم می­کند (مشاهدات شخصی) ولی تا کنون مطالعه­ای بر روی اثرات بلوم این پلانکتون و همین­طور شناسایی آن از آبهای جنوبی کشور صورت نگرفته است. بلوم این گونه ژله­فیشی نیش زننده (40)، کوچک برنگ صورتی یا قهوه­ای روشن است که در آبهای ساحلی پراکنش وسیع دارد. این گونه خاص آبهای گرم می­باشد ولی ممکن است با جریانات دریایی چون حالت پلانکتونی دارد به آبهای نواحی سردتر مانند اطلس و آرام شمالی هم کشیده شوند (29). گزارشات مختلف از نیش­زدن توسط نماتوسیت­های این گونه وجود دارد که سبب ایجاد قرمزی و خارش و التهاب به مدت 1-2 هفته و در مواقع حاد سبب ایجاد عفونت می­شود (37 و40) گونه شکوفا شده در سواحل ایران که بدون محافظ برداشته شدند سبب ایجاد خارش و قرمزی در پوست دست می­گردد. ماتیک و همکاران در سال 1991 هموژنات­های بدن آنها را در الکتروفورز مطالعه کردند و اظهار داشتند که سم P. noctiluca دارای ماهیت پروتئینی، آنتی­ژنتیک و ترکیب­ شده از هشت قسمت و یک کاردیوتوکسین می­باشد که تا حدی از سم خام تصفیه می شود (47 و 22).

شناسایی دقیق مدوزوزوئن­ها، با استفاده از ویژگی­های ریخت­شناسی آنها بسیار پیچیده و مشکل است وبرای بعضی از گونه­ها بعنوان روشهای مفید و قابل اطمینان محسوب نمی­شوند (4). گونه­ی شکوفا شده در سواحل چابهار اگرچه مورد بررسی ریخت شناسی قرارگرفته، ولی با توجه به بافت بسیار نرم و ویژگیهای ریخت شناسی موجود تا حدودی قابل تشخیص بودند. این موجودات، لطیف و نازک­اند و در جریان جمع­آوری سنتی با تورها به آسانی آسیب می­بینند، در نتیجه محتوای آب بافتهایشان بالا می­رود. به همین دلیل معرفی در سطح گونه که به مشخصات ریخت شناسی دقیق وابسته است، برای خیلی از گونه­ها بسیار مشکل خواهد بود (16 و 21). اعضای هیدروزوئن­های کلونیال، رده سیفوزوا، اغلب در جریان جمع­آوری با تور قطعه قطعه شده و بهمراه زوئیدهای بمنظور شناسایی از دست می­روند (57). حالت شکل پذیری فنوتیپیکی در اندازه و شکل هیدروپولیپ­ها (50) و سیفیستوما (49) و نیز واگرایی ریخت شناسی­شان که به فاصله­ی جغرافیایی­شان وابسته است (5)، تشخیص گونه­های ژله­فیش­ها از یکدیگر را دشوار و پیچیده ساخته است. به علاوه، این امر با مراحل لاروی مختلف گونه­های مدوزوئن­ها (به عنوان مثال پلانولا، اکتینولا، پولیپ­ها و افیرا که مشکل می­باشد)، پیچیده­تر می­شود، زیرا خیلی اوقات این مراحل ناشناخته یا غیرقابل توصیف می­باشند. بعضی از پولیپ­های هیدروزئن­ با بررسی خصوصیات ریخت شناسی، شناسایی نمی­شوند (25) و بعضی از پولیپ­های سیفوزوئن، می­توانند تنها از طریق آنالیز میکروسکوپی ضمائم نماتوسیست شناسایی شوند (9). گونه­ی ایرانی هم شناسایی ریخت شناسی آن به سختی انجام شد و بمنظور تایید شناسایی دقیق  توالی نوکلئوتیدی آن با گونه­های مشابه مقایسه گردید و جایگاه ش آن تایید شد. موقعیت فیلوژنتیکی نیداریا در متازوا فعلاً بسیار بحث­انگیز می­باشد. از نظر زیست­شناس­ها فرض می­شود که تفکیک ژنتیکی، جدایی تولیدمثلی را بازتاب می­کند (28). کروناتها، گروه خواهری سیموستوم­ها به علاوه­ی ریزوستوم­ها می­باشد و یک ارتباط نیز توسط تایل و همکارانش در سال 1966 براساس ویژگیهای ریخت شناسی معرفی گردید. کروناتها و سیموستوم­ها هر دو تحت شرایط تقسیم عرضی دیسک مرکزی (Strobilation)، به چندین افیرای اولیه بطور مشخص تمایز می­یابد (54 و 55). برخلاف آن­ها ریزوستوم­ها تحت شرایط تجمع لاروهای مجزا در انتهای دهان از پولیپ توسعه می­یابد و با تقسیم عرضی آزاد می­شود. در هر دو مورد پولیپ های تقسیم شده دوباره بازوها را رشد می­دهند، سپس مدوزهای جوان آزاد می­شوند و این پروسه ممکن است تکرار شود. در حال حاضر راسته کروناتها شامل 4 خانواده هستند که همه تک نیایی (مونوفایلتیک) هستند. در مطالعه حاضر راسته­های  ریزوستومه  و سیموستومه از رده سیفوزوا در نظر گرفته شده است که رده سیموستوم­ها در حال حاضر دارای 19 خانواده است (4). براساس شجره شناسی حاصل از داده­های  SSU rDNAو تطابق آن با ویژگیهای ریخت شناسی (42 و 54) سیموستوم­ها یک گروه تکاملی آبا و اجدادی هستند که مطالعات قبلی (56 و 41) را که براساس ریخت شناسی ریزوستوم­ها و سیموستوم­ها ترسیم شده (شکل 5) را تایید می­کند .در مطالعه حاضر از راسته ریزوستوما خانواده­های ماستیجیده و ریزوستوماتیده در نظر گرفته شده­اند (شکل 4). همانطور که در شکل 4 مشخص است خانواده اولماریده گروه خواهری ریزوستوما هستند مطالعه حاضر با آنالیزهای قبلی (57) که براساس ریخت شناسی است مطابقت دارد.

برخی مطالعات دلیل چند نیایی سیموستوما را رابطه خواهری بین خانواده اولماریده از ریزوستومی­ها بیان می­کنند (12، 20 و 27). اغلب شاخه­ها در مطالعه حاضر از بوت استراپ ضعیفی برخوردار هستند، بدلیل اینکه بیشتر خانواده­های سیموستومها در حالت از نژادهای مختلف هستند، گونه­ها در خانواده سیانیده در این مطالعه از نژادهای مختلف هستند (شکل 4) و جنس­های Desmonema  و Cyanea با بوت استراپ بسیار ضعیف (22%) حمایت می­شود مطالعات بیها و همکاران در سال 2010 نشان داد که ارتباط بین Desmonema  ، Cyanea وUlmaridae نسبت به بقیه کلادهای  راسته سیموستوم­ها هنوز براساس اطلاعات ریخت شناسی و داده­های مولکولی لاینحل باقی مانده است. خانواده کاتوستیلیده (شکل 4) نسبت به بقیه­ی خانواده­های سیفوزوا گروه آبا و اجدادی، اما نه از جمله تمام گروه های نسل و از نژادهای مختلف هستند (14). خانواده­های پلاژیده و سیانیده براساس ویژگیهای ریخت شناسی نزدیک بهم طبقه­بندی می­شوند (شکل 5) براساس داده­های مولکولی در این مطالعه و دیگر مطالعات اینها گروه آبا و اجدادی، اما نه از جمله تمام گروه های نسل. هستند (15).

شکل 5- مقایسه رابطه مورفولوژی برخی ازخانواده­ها و راسته­های سیفوزوا (برگرفته از Uchida, 1926 (