مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)

تأثیر نانو ذره کیتوسان در درمان سوختگی بر روی موش نر بالغ نژاد NMRI

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی تکوینی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران

چکیده

زخمهای ناشی از سوختگی یکی از دیر بهبود یافته ترین زخمها می باشند. درمان صحیح و مراقبت از زخم جهت افزایش سرعت بهبود، هم چنین جلوگیری از مزمن شدن و عفونت آن همواره مد نظر بوده است. کیتوسان مشتقی از گلوکان با واحدهای تکرار شونده کیتین دارای ساختاری طبیعی شبیه سلولز است که زیست سازگار و زیست تخریب پذیر است .
42 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به صورت تصادفی در گروه های کنترل و شم و تجربی قرار گرفتند .با رعایت شرایط استریل و تحت بیهوشی یک زخم مدور به قطر 1 سانتی متر و با ضخامت کامل پوست در پشت هر موش ایجاد شد. روز جراحی روز صفر محسوب گردید. از روز یک بطور روزانه همه موشها به صورت موضعی با محلول نانوذره کیتوسان تیمار شدند.موش ها در روزهای 7، 14، 28 پس از تیمار روزانه، با کلروفرم کشته و نمونه بستر زخم و پوست سالم مجاور ،از هر موش برداشته شدند. بر نمونه های مربوط ، مطالعات بافت شناسی انجام شد.
یافته های این تحقیق و بررسی داده های آماری نشان می دهد که تعداد و قطر در سطح معنی داری P<0.001 نسبت به گروه کنترل افزایش معنا داری یافته است.
با توجه به یافته های این تحقیق میتوان گفت نانو ذره کیتوسان بر روی رگ زایی اثر مثبت داشته و با مطالعه بیشتر بر روی این نانو ماده شاید بتوان برای درمان زخم پیشرفت های بیشتری حاصل کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Effect of Chitosan Nanoparticles in the treatment of burns on Adult male NMRI mouse strain

نویسندگان [English]

  • Nazanin Jabbari 1
  • Kazem Parivar 2
  • Nassim Hayati Roodbari 2

چکیده [English]

Burns are one of the slowest healing wounds. Proper treatment and care for the wound to accelerate healing, preventing chronic infection has always been considered.Chitosan, Derivative of glucan, with repeating structural units of chitin, has natural cellulose that is biocompatible and biodegradable.
42 adult male NMRI mice were randomly assigned to experimental and control groups and sham. Sterile conditions and general anesthesia, a circular lesion with a diameter of 1 cm full thickness of the skin was created on the back of each mouse. Surgery day was considered as day zero. From day one every day, all animals were treated topically with a solution of chitosan nanoparticles. Mice on days 7, 14, 28 after daily treatment killed with chloroform and wounds and adjacent skin samples from each mouse were removed. Histological studies were performed on the samples.
The findings of the study's data shows that the number and diameter of the significance level of P <0.001 compared to the control group, There has been a significant increase.
According to these results it can be said chitosan nanoparticles have a positive effect on angiogenesis and further research on nano materials may be obtained for further advances in wound healing.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Burn
  • chitosan nanoparticles
  • repair
  • skin
  • NMRI mice

تأثیر نانوذره کیتوسان در درمان سوختگی بر روی مدل موشی 

نازنین جباری، کاظم پریور و نسیم حیاتی رودباری 

تهران، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی 

تاریخ دریافت: 20/2/93                تاریخ پذیرش: 15/9/93 

چکیده 

زخمهای ناشی از سوختگی یکی از دیر بهبود یافته­ترین زخمها می­باشند. درمان صحیح و مراقبت از زخم جهت افزایش سرعت بهبود، هم­چنین جلوگیری از مزمن شدن و عفونت آن همواره مدنظر بوده است .کیتوسان مشتقی از گلوکان با واحدهای تکرار شونده کیتین دارای ساختاری طبیعی شبیه سلولز است که زیست سازگار و زیست تخریب­پذیر است. 42 سر موش نر بالغ نژاد NMRI به صورت تصادفی در گروه­های کنترل، شاهد و تجربی قرارگرفتند .با رعایت شرایط استریل و تحت بیهوشی یک زخم مدور به قطر یک سانتی­متر و با ضخامت کامل پوست در پشت هر موش ایجاد شد. روز جراحی روز صفر محسوب گردید. از روز یک بطور روزانه همه موشها به صورت موضعی با محلول نانوذره کیتوسان تیمار شدند. موش­ها در روزهای 7، 14، 28 پس از تیمار روزانه، با کلروفرم کشته و نمونه بستر زخم و پوست سالم مجاور، از هر موش برداشته شدند. بر نمونه­های مربوط، مطالعات بافت­شناسی انجام شد. یافته­های این تحقیق و بررسی داده­های آماری نشان می­دهد که تعداد و قطر در سطح معنی­داری (P<0.001) نسبت به گروه کنترل افزایش معناداری یافته است. با توجه به یافته­های این تحقیق میتوان گفت نانو ذره کیتوسان بر روی رگ­زایی اثر مثبت داشته و با مطالعه بیشتر بر روی این نانو ماده شاید بتوان برای درمان زخم پیشرفت­های بیشتری حاصل کرد.

واژه­های کلیدی: سوختگی، نانو ذرات کیتوسان، ترمیم، پوست، NMRI، موش. 

* نویسنده مسئول، تلفن: 44172753-021، پست الکترونیکی: Nazanin.Jabbari@gmail.com 

مقدمه

 

پـوست سنگین‌ترین  اندام منفرد بدن و بزرگترین ارگان بدن ما می‌باشد و شامل روپوست یا اپیدرم، میان‌پوست یا درم می‌باشد. در زیر درم، زیرپوست یا هیپودرم یا بافت زیرجلدی قرار دارد حاوی لایه‌ای از سلول‌های چربی به نام طبقه بافتی چربی یا پانیکولوس آدیپوزوس می‌باشد. اپیدرم خارجى‌ترین طبقه پوست و درم در زیر اپیدرم قرارگرفته و خیلی ضخیم‌تر از آن است و اپیدرم را تغذیه می‌کند. درم برخلاف اپیدرم دارای عروق خونی زیادی است (1). سوختگی، نوعی آسیب به گوشت یا پوست است که براثر گرما، برق، مواد‌شیمیایی، اصطکاک یا پرتو به وجود می‌آید .‌سوختگی‌ها در سه سطح،  سوختگی‌های سطحی یا درجه اول (آسیب سطح پوست)، سوختگی باضخامت نسبی یا درجه‌دوم (آسیب لایه‌های زیرین پوست)، سوختگی با ضخامت کامل یا درجه‌سوم (آسیب همه لایه‌های پوست) طبقه‌بندی می‌شود (6). حدود ۱۱ میلیون نفر در جهان نیازمند درمان دارویی‌اند و هرساله ۳۰۰۰۰۰ نفر در اثر سوختگی می‌میرند (14). ترمیم زخم یکی از شگفت‌انگیزترین پدیده‌هایی است که علم پزشکی با آن روبرو است. به‌طور کلی، فرآیند ترمیم به سه گروه از وقایع زیر تقسیم می‌شود :1). فاز التهاب 2) .فاز تکثیر 3) .فاز تجدید ساختار . هر ماده‌ای که بتواند زمان این فازها را کوتاه‌تر کند، منجر به تسریع روند ترمیم می‌شود (5). در طول تاریخ انواع درمان‌های حاد برای سوختگی‌های درجه‌یک و دو مورد استفاده قرارگرفته است. غار نگاره‌هایی که قدمت آن به بیش از ۳۵۰۰  سال پیش بازمی‌گردد سوختگی و درمان آن را نشان می‌دهد (6). نانوتکنولوژی شاخه‌ای از علم است که به کاربرد اتم‌ها و مولکولها در مقیاس نانو  اختصاص دارد (17). ایران در تولید علم نانو فناوری در زمینه علوم و فناوری نانو، به جایگاه بیست و پنجم جهان دست‌یافته است (3) . کیتوسان بیوپلیمری است که به دلیل قیمت نازل و همچنین ویژگی‌های ژیست شناختی نظیر زیست‌تخریب‌پذیری،آنتی باکتریال بودن و بی‌خطر بودن برای سلامتی، کاربرد فراوانی پیداکرده است (17). کیتوسان پلی­ساکارید کاتیونی است که از فرآیند استیل زدایی قلیایی کیتین بدست می‌آید. منابع عمده تولید کیتوسان دیواره سلولی قارچها و پوست خارجی سخت‌پوستان است. عمده فعالیت‌های بیوشیمیایی کیتین و کیتوسان در بهبود زخم، فعال‌سازی پلیمورفونوکلیر سلولی، فعال شدن فیبروبلاست، تولید سایتوکاین، مهاجرت سلول غول پیکر و شبیه‌سازی سنـتز کـلاژن نـوع IV می‌باشد. کیتوسان سیستم‌های ترمیم، سلول‌های پلی مورفونوکلیر، فیبروبلاست‌ها و سلول‌های اندوتلیال رگ‌ها را فعال می‌کند. در تحقیقات گذشته ثابت شده که کیتین و کیتوسان روی مهاجرت سلول‌های اندوتلیال و فیبروبلاست‌ها اثر داشته  و بر روی ترمیم زخم‌ها مؤثرند (2)، در زمینه نانوذره کیتوسان تحقیقات خاصی جهت بررسی روند ترمیم و بهبود زخم صورت نپذیرفته است. بنابراین بر آن شدیم تا بدانیم آیا نانوذره کیتوسان می‌تواند  برروند رگ زایی و التیام زخم تأثیرگذار باشد؟

مواد و روشها

در این مطالعه، 42 سر موش نر بالغ نژاد  NMRI با 12-10 هفته سن و با وزن 3±32  گرم انتخاب شدند. دمای اتاق در حدود 2±22 تنظیم شد و به‌منظور تنظیم سیستم فیزیولوژی بدن آنها، 12 ساعت نور و 12 ساعت تاریکی در نظر گرفته شد. تغذیه آنها با حبه‌های مخصوص حیوانات آزمایشگاهی  و آب آشامیدنی لوله‌‌کشی صورت می گرفت. در این مطالعه از بیوپلیمر زیستی کیتوسان (Chitosan) استفاده شد. با توجه به وجود ناخالصی در کیتوسان­های متداول و موجود در بازار، از بیوپلیمر زیستی کیتوسان با درجه خلوص 31/90% شرکت کیتوتک استفاده گردید. تشکیل نانو ذرات کیتوسان براساس فرایند اتصال یونی ذرات کیتوسان که در اثر انحلال در استیک­اسید به‌صورت مثبت باردار شده‌اند و یونهای منفی STPP می باشد. برای تهیه این سوسپانسیون ابتدا 2 میلی‌گرم کیتوسان را به cc1 اسیداستیک 1/0 مولار اضافه و بعد به کمک NaoH،pH  محلول به 4/4 رسانده شد. سپس محلول سدیم­تری پلی فسفات (STPP) را با افزودن 1 میلی‌گرم سدیم­تری پلی فسفات به cc1 آب‌مقطر تهیه گردید. به نسبت 1به 3، محلول STPP به محلول کیتوسان، به‌صورت قطره‌قطره، افزوده‌ شده و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق روی همزن مغناطیسی قرارداده شد. سپس محلول را در میکروتیوپ‌ها ریخته و به مدت 20 دقیقه با دور 12000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. محلول رویی که حاوی نانو ذرات کیتوسان بود جمع‌آوری و استفاده شد. با استفاده از طیف‌سنج پراش اشعه ایکس (XRD) زاویه برابر 0.00375 رادیان و در نتیجه قطر ذره (D) 374.59459 آنگستروم و یا به عبارتی 37.4594 نانومتر محاسبه شد. میکروسکوپ الکترونی روبشی (TEM) نانو ذرات کیتوسان را نشان می‌دهد. تصاویر توسط شرکت دی پترونیک تهیه شد. با محاسبات انجام شده، میانگین شعاع ذرات 17 نانومتر است این بدان معناست که قطر نانو ذرات 34 نانومتر است که این رقم با داده‌های ایکس­آر­دی همخوانی دارد (شکل1).

 

 

 

شکل 1- تصاویر نانوذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی TEM (50 و 100 نانومتر)

طبق جدول 1 موش‌ها به 9 گروه تقسیم شدند:

 

جدول 1- طبقه بندی گروه موش های استفاده شده در آزمایش

نام گروه

تعداد موش‌ها

گروه کنترل 1 (واجد سوختگی بدون تیمار تا 7 روز پس از سوختگی)

4

گروه شم 1 (واجد سوختگی و تیمار با حلال نانوذره کیتوسان(محلول STPP ) تا 7 روز پس از سوختگی)

4

گروه تجربی 1 (واجد سوختگی و تیمار با محلول نانوذره کیتوسان تا 7 روز پس از سوختگی)

6

گروه کنترل 2 (واجد سوختگی بدون تیمار تا 14 روز پس از سوختگی)

4

گروه شم 2 (واجد سوختگی و تیمار با حلال نانوذره کیتوسان(محلول STPP ) تا 14 روز پس از سوختگی)

4

گروه تجربی 2 (واجد سوختگی و تیمار با محلول نانوذره کیتوسان تا 14 روز پس از سوختگی)

6

گروه کنترل 3 (واجد سوختگی بدون تیمار تا 28 روز پس از سوختگی)

4

گروه شم 3 (واجد سوختگی و تیمار با حلال نانوذره کیتوسان(محلول STPP ) تا 28 روز پس از سوختگی)

4

گروه تجربی 3 (واجد سوختگی و تیمار با محلول نانوذره کیتوسان تا 28 روز پس از سوختگی)

6

 

 

بعد از بیهوشی حیوان با تزریق درون صفاقی مخلوط کتامین (ipmg/kg2) و زایلازین (ipmg/kg3)، از ناحیه شکم روی سطح میز قرارگرفت و موهای پشت حیوان، با تیغ ژیلت کاملاً تراشیده شد. سپس به کمک هویه (در مدت‌زمان 33 ثانیه، دمای آن به 100 درجه سانتی‌گراد می‌رسید) با قطر یک سانتی‌متر، سوختگی‌های نسبتاً عمیق دربرگیرنده دولایه پوست در محدوده ما بین دو کتف و زیر گردن، به وجود آمد. هویه به مدت 1 دقیقه گرم شد و 15 ثانیه روی پشت حیوان قرارگرفت. روزانه یک‌مرتبه محلول تیمار روی سطح زخم‌ها استفاده می‌شد به‌طوری که تمام سطح زخم‌ها و کناره آنها پوشانده می‌شد. بر روی زخمهای کنترل هیچ ماده‌ای استعمال نشد .کلیه زخمها بدون پانسمان و روباز ماندند. هرروز سطح زخم‌ها توسط کولیس دیجیتال اندازه‌گیری می‌شد. سپس در روزهای 7 و 14 و 28، موش‌ها از طریق استنشاق کلروفرم در دسیکاتور دچار مرگ سریع و بدون درد (اتانازی) شدند. پوست سوخته با تیغ اسکالپل جدا شد و نمونه‌ها به فیکساتیو بوئن منتقل و به مدت 5 ساعت در محلول باقی ماندند. سپس از بوئن خارج شده و به مدت 1 ساعت در آب جاری شستشو داده شدند و در الکل 70 % قرار گرفتند. پس از انجام مراحل آب‌گیری و تهیه قالب‌های پارافینی، برش‌های 5 میکرونی از آنها تهیه شد و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین روی آنها صورت گرفت. بعد از اتمام این مرحله نمونه‌ها برای بررسی میکروسکوپی و عکس گرفتن آماده گردیدند. در بررسی میکروسکوپی، لایه‌های اپیدرم، درم، هیپودرم، لایه کراتینه شده، فولیکولهای مو و رگهای خونی به‌آسانی قابل‌تشخیص بودند. به‌طور تصادفی در 10 لام تهیه شده از هر گروه توسط چشمی 40 میکروسکوپ، ضخامت لایه‌ها، قطر فولیکول مو و قطر رگ‌ها توسط گراتیکول مدرج و تعداد رگ‌ها توسط گراتیکول مشبک شمارش شدند. نتایج بدست آمده به‌صورت داده‌های اولیه به نرم افزار SPSS  داده شد. سپس مقایسه میانگین‌ها با در نظر گرفتن انحراف معیار (SE) و (05/0P<) انجام پذیرفت. سنجش‌های آماری بوسیله نرم‌افزار SPSS نسخه 19 و آزمون One way- Anova و Tukey صورت گرفت و با استفاده از نرم‌افزار Excel نسخه 2007، نمودارهای میله ای رسم گردید.

نتایج

تصاویر ماکروسکوپی از محل زخم در گروه‌های آزمایشی بعد از گذشت مدت ‌زمان تیمار، تأییدکننده جمع­شدگی و بسته شدن کامل زخم در گروه های تیماری با نانوذره کیتـوسـان (تـجربـی) نـسبت بـه گـروه شاهد و کـنترل می‌باشد. همچنین روند بهبود زخم در گروه شاهد نسبت به گروه کنترل بهتر بود. در بررسی میکروسکوپی برشهای بافتی، بافت گرانوله و اپیتلیوم نازک، عدم تشکیل لایه کراتینه، بافت چربی و فولیکول های مو در گروه های کنترل مشاهده شد. ولی در محل ترمیم زخمِ گروههای تجربی 1 و 2 و 3 بافت های تمایز یافته اپیدرم، درم، هیپودرم ، فولیکول های تازه تشکیل یافته مو، عروق خونی دیده شد.

ضخامت اپیدرم در گروه‌های شاهد و تجربی نسبت به گروه کنترل افزایش معنی‌داری را نشان داد (P<0.001). همچنین افزایش معنی دار ضخامت اپیدرم در گروههای شاهد نسبت به تجربی 1 و 2 و 3 مشاهده شد (P<0.001).(نمودار 1 )

ضخامت درم در گروههای شاهد و تجربی نسبت به گروه کنترل افزایشی نشان داد که معنی دار نبود. همچنین افزایش ضخامت درم در گروههای شاهد نسبت به تجربی 1و2و3 مشاهده شد.(نمودار 2)

 

 

 

نمودار 1- مقایسه ضخامت اپیدرم در کلیه گروه ها نسبت به گروه کنترل ( *دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

 

نمودار 2- مقایسه ضخامت درم در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل ( *دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

ضخامت لایه کراتینه در گروههای تجربی نسبت به گروه کنترل و شاهد افزایش نشان داد. همچنین افزایش ضخامت لایه کراتینه در گروه های تجربی 2 و 3 نسبت به گروه های شاهد 2 و 3 مشاهده گردید.(نمودار 3)

ضخامت هیپودرم در گروه تجربی و شاهد 2 نسبت به گروه کنترل 2 و در گروه تجربی و شم 3 نسبت به کنترل 3 افزایش نشان می‌دهد (نمودار 4).

 

 

 

نمودار 3- مقایسه ضخامت لایه شاخی در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل ( *دارای اختلاف معنی‌دار نست به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

نمودار 4- مقایسه ضخامت هیپودرم در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل ( *دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

 

تعداد رگهای درمی گروه‌های تجربی 1 و 2 و3 در مقایسه با گروه کنترل 1، افزایش معنی‌داری نشان می‌دهد (نمودار 5).

قطر رگ درمی در گروه تجربی 3 نسبت به گروه کنترل 1 در سطح (P<0.001) افزایش معنی‌داری نشان می‌دهد. همچنین گروه تجربی 1 نسبت به گروه تجربی 1 در سطح (P<0.05) افزایش معنی‌داری نشان می‌دهد (نمودار6).

تعداد فولیکول‌های مو در گروه‌های تجربی 1 و 2 افزایش معنی‌داری نسبت به گروه‌های کنترل 1 و 2 در سطح  (P<0.001) نشان می‌دهد.گروه تجربی 3 نیز نسبت به گروه کنترل 3 افزایش معنی‌داری در سطح (P<0.05) نشان می‌دهد (نمودار 7).

جمع­شدگی سطح زخم در گروه‌های تجربی 1 و 2 و 3  و شم 1 و 2 افزایش معنی‌داری در سطح (P<0.001) نسبت به گروه‌های کنترل داشته‌اند، همچنین گروه شم 3 افزایش معنی‌داری در سطح (P<0.01) نسبت به گروه کنترل نشان می‌دهد. در گروه‌های تجربی نسبت به شم افزایش جمع­شدگی بیشتری در سطح زخم قابل‌مشاهده است (نمودار8).

 

 

 

نمودار 5- مقایسه تعداد رگهای درمی در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل ( *دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

نمودار 6- مقایسه قطر رگ درمی در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل( *دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

 

نمودار 7- مقایسه تعداد فولیکول مو در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل( *دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 

نمودار 8- مقایسه مساحت زخم در کلیه گروه‌ها نسبت به گروه کنترل( *دارای اختلاف معنی‌دار نست به گروه کنترل به ازاء P<0.05 و ** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.01 و *** دارای اختلاف معنی‌دار نسبت به گروه کنترل به ازاء P<0.001)

 


بحث

میزان رگ‌زایی یا آنژیوژنسیس و توسعه عروق خونی درواقع یکی از اساسی‌ترین عوامل مؤثر در امر ترمیم زخم است. درصورتی‌که عاملی بتواند در زمان مناسب تشکیل عروق خونی جدید را تحریک و تشدید نماید و خونرسانی به منطقه توقف را سبب شود می‌توان گفت که روند ترمیم با موفقیت پیش می‌رود و از عمیق شدن زخم جلوگیری می‌شود. آخرین گام در آنژیوژنسیس بلوغ سلولهای اندوتلیال و سازمان یافتن این سلولها برای تشکیل لوله‌های مویرگی است (8). هیدروژل کیتین و کیتوسان به‌عنوان مواد پانسمان زخم استفاده شد. نتیجه، حساس‌تر بودن هیدروژل کیتین نسبت به کیتوسان در فعالیت آنزیم لیزوزیم بود. در برش زخم ایجادشده کیتین، کیتوسان، پودر کیتین و هیدروژل کیتین جاسازی شده بودند. پودر کیتین کار آمدتر از کیتین و کیتوسان به‌عنوان یک شتاب‌دهنده بهبود زخم مشاهده شد. زخم تحت درمان با هیدروژل کیتین به طور کامل دوباره اپیتلیزه شد، بافتهای گرانوله تقریباً با فیبروز و فولیکول مو جایگرین شدند و تقریباً 7 روز پس از زخم اولیه درمان شد و پوست درمان شده بیشترین مقاومت کششی و آرایش الیاف کلاژنی را در پوست دارد که مشابه پوست طبیعی است. هیدروژل کیتین با توجه به کاربرد آسان آن و اثربخشی بالا یک عامل مناسب بهبود زخم در نظر گرفته شد (5). بهبود زخم و تشکیل فولیکول مو در مطالعه انجام‌شده ما نیز قابل‌رؤیت است. در مطالعه ما، رگ­زایی به‌وفور دیده می‌شود که حائز اهمیت است.

پانسمان زخمی متشکل از دولایه، لایه فوقانی هیدروژل کیتین کربوکسی متیل، لایه‌های پایین‌تر به‌عنوان ماده ضدمیکروبی استفاده شد .لایه هیدروژل به‌عنوان یک مانع مکانیکی و میکروبی عمل می‌کند و قادر به جذب ترشحات زخم است. هیدروژل کربوکسی متیل کیتین، بطور قابل‌توجهی با جذب 4 برابر وزن خود آب متورم شده و نیز بسیار متخلخل می‌گردد. نفوذ رطوبت از پانسمان مانع از تجمع مایع در زخم سوختگی درجه دوم می شود (12) که ازنظر ممانعت میکروبی و عفونی بامطالعه حاضر یکسان است.

مواد اسفنجی متخلخل حاوی سولفادیازین نقره، به منظور جلوگیری از عفونت باکتری‌ها در سطح زخم، مناسب برای پانسمان زخم از بتا-کیتین تهیه شد. نفوذپذیری اکسیژن از نمونه‌ها نسبتاً خوب بودند. ظرفیت کامل باکتریایی در برابر پسودوموناس آئروژینوزا را تا 7 روز داشتند. مطالعه بافت‌شناسی، تکثیر فیبروبلاست­ها در بستر زخم و کاهش مشخص سلول‌های عفونی را تأیید کرد (11). در مطالعات ما نیز افزایش تکثیر فیبروبلاست­ها قابل مشاهده بود.

به منظور بررسی اثر شتاب­دهندگی بر بهبود زخم، برشی در تمام ضخامت پوست پشت موش ایجادشده و سپس محلول آبی کیتوسان فوتوکراس به زخم اضافه شد و تحت تابش اشعه ماوراءبنفش به مدت 90 ثانیه قرارگرفت. به‌طور قابل‌توجهی باعث انقباض زخم و تسریع بسته شدن و بهبود زخم در مقایسه با گروه کنترل درمان نشده قرارگرفت، بررسی بافت‌شناسی میزان انقباض پیشرفته‌ای در 2 روز اول و  ترمیم نسبتاً کامل بافت در روز 2 تا 4 در زخم درمان شده با هیدروژل کیتوسان نشان داد (9). بهبود زخم و انقباض آن با مطالعات انجام‌شده ما برابری می‌کند.

غشاهای کیتوسان نامتقارن حاوی سولفادیازین نقره توسط روش جداسازی فاز خشک/ مرطوب برای غلبه بر محدودیت‌های فعلی در کرم سولفادیازین نقره برای درمان زخم سوختگی حاد توسعه‌یافته بود. غشای کیتوسان نامتقارن که شامل یک پوست متراکم و لایه متخلخل اسفنج مانند است می‌تواند برای این غشا به‌عنوان پانسمان زخم مورد استفاده قرارگیرد. کرم سولفادیازین نقره به‌عنوان ضدباکتری به‌طور سنتی جهت پیشگیری از عفونت زخم مورد استفاده بوده است، بااین‌حال مسئله مسمومیت بالقوه نقره مطرح شده است (15) مهمترین خاصیت کیتوسان، عدم سمیت آن می‌باشد. در مطالعه مورد بررسی ما، نفوذ اکسیژن بررسی نشده است اما از نظر کنترل تبخیر رطوبت زخم یکسانند.

 کمپلکس محلول در آب کیتوسان/ هپارین برای شتاب­دهندگی مؤثر بهبود زخم آماده شد. پس از 15 روز، بررسی بافت‌شناسی نشان داد که در گروه کنترل تیمار نشده به‌خوبی زخم در لبه بهبود یافته و توسط پوسته پوشیده شده بود. گروه دوم تحت درمان با پماد کیتوسان محلول در آب نشان داد اندازه زخم کوچک‌تر با  مقدار کمتر از پوشش پوسته و لبه نامشخص که به  نظر می‌رسد بازسازی از لبه انجام‌شده است. به نظر می‌رسد گروه سوم تحت درمان با کمپلکس پماد کیتوسان محلول در آب/ هپارین نسبتاً به‌صورت کامل درمان شده است (10). مدت‌زمان ترمیم سوختگی در مطالعات ما کوتاهتر بود. در این مطالعه با توجه به وجود هپارین، توقف خونریزی مشهود بوده است.

زخم روی لاله گوش خرگوش ایجاد شد و با پماد کیتین مورد ترمیم قرارگرفت. استفاده از پماد کیتین محلول در آب به‌طور قابل‌توجهی سرعت ترمیم و انقباض زخم را افزایش می‌دهد. مناطقی از بافت پوششی و دانه‌های ریزبافتی که در مجاورت پماد کیتین محلول در آب بودند به‌صورت قابل‌ملاحظه‌ای بزرگتر از گروه کنترل و گروه شم بودند. تعداد زیادی از دانه‌های بافتی ازجمله رسوب متراکم فیبروبلاست در زیر اپیتلیوم ضخیم در زخم تحت درمان با پماد کیتین محلول در آب رشد کرده بود. تعداد سلول‌های التهابی به‌طور قابل‌توجهی در مقایسه باکسانی که در گروه شم و شاهد بودند کاهش یافته بود، نشان می‌دهد که کیتین محلول در آب می‌تواند محرک ترمیم زخم بوده و از تشکیل بیش از حد اسکار جلوگیری کند (7). از نظر رشد درم نتایج یکسانی حاصل شد. فرایند آنژیوژنز، رشد لایه کراتینیزه  و فولیکول های مو در مطالعه انجام شده ما، به وضوح قابل‌رؤیت است.

ماتریس نانوالیاف کیتوسان به‌عنوان داربست برای جایگزین پوست استفاده شد. مزایای استفاده از داربست، نفوذپذیری نسبت به اکسیژن با تخلخل بالا و شباهت ظاهری به ماتریکس خارج سلولی طبیعی در پوست است که به ترویج مهاجرت چسبندگی سلول و تکثیر می‌پردازد (13). تشکیل اپیدرم، لایه شاخی و رگ با مطالعات انجام شده ما مطابقت دارد. اما در مطالعات ما رگها با تعداد بالا و کامل تشکیل شد و ضخامت لایه شاخی افزایش مشهودی داشت.

هیدروژل دولایه متشکل از کیتوسان و آب تشکیل شد و جهت درمان جراحات سوختگی استفاده شد. آزمایشات در پوست خوک و بیوپسی در روز 9، 17، 22، 100 و 293  انجام شد. تمام نتایج به دست آمده نشان داد که ترویج بازسازی بافت خوب است و منجر به مهاجرت التهابی سلول‌ها و فعالیت‌های رگ­زایی می‌شوند. در روز 22، کلاژن نوع یک و چهار در زیر بافت همبند ساخته شد و شکل‌گیری محل اتصال درم-اپیدرمی مشاهده شد. پس از 100 روز، بافت جدید، به‌خصوص با جنبه‌های زیبایی‌شناختی آن و انعطاف‌پذیری زیاد آن کاملاً شبیه به پوست مادری بود (4). از نظر رشد رگزایی و ترمیم بافتهای پوشش هر دو مطالعه یکسان است با این تفاوت که در مطالعه ما طول دوره درمان بسیار کاهش یافته است.

برای بهبود سریع زخم، ورق هیدروژل متشکل از پودری مخلوط از آلژینات، کیتین/ کیتوسان و فوکوئیدان به‌عنوان پانسمان زخم استفاده شده است. بررسی بافت‌شناسی به‌طور قابل‌توجهی پیشرفت بافت گرانوله و شکل‌گیری مویرگی در زخم‌هایی که بهبودشان دچار اختلال شده بود و با ACF-HS  (ورق هیدروژل متشکل از مخلوط پودری آلژینات، کیتین/ کیتوسان و فوکوییدان) در روز 7 تحت درمان  قرارگرفتند، در مقایسه باکسانی که تحت درمان با فیبرآلژینات کلسیم و کسانی که بدون درمان مانده بودند، نشان می‌دهد (16). شکل‌گیری عروق خونی و بافت گرانوله در هر دو مطالعه یکسان است. هر دو مطالعه این روند ترمیمی را در روز 7 پس از جراحی نشان می‌دهند.

نقش کیتوسان در ترمیم زخم سوختگی به‌طور کامل مشخص نشده است و تاکنون از آثار سودمند و مضر آن گزارش های متعددی منتشر شده است. شاخص های اصلی برای بررسی هیستوپاتولوژی اثرهای ترمیمی کیتوسان در زخمهای سوختگی میزان رگ­زایی، میزان پیشروی اپیدرم از لبه سالم زخم، اندازه‌گیری ضخامت اپیدرم و درم و هیپودرم، تعداد فولیکول های مو، تعداد و قطر عروق تازه ساخته‌شده بود. در مشاهدات ماکروسکوپی، شاهد تسریع بهبود و جمع­شدگی زخم در گروه‌های تجربی بودیم. ضخامت اپیدرم در گروه‌های تجربی و شم کاهش‌یافته بود. در ابتدا اسکار روی پوست تشکیل شد که جزیی از اپیدرم شده بود اما به مراتب با تأثیر نانوذره و بهبود فرایند ترمیم زخم، هرکدام از لایه‌های کراتینه و اپیدرم پوست به‌صورت مجزا شکل گرفتند. در گروه‌های تجربی و شم و نیز به میزان کمتر در گروه کنترل، تمایز و جایگزینی هیپودرم و توسعه سلولهای چربی به زمان بیشتری نیاز دارد. هدف اصلی تحقیق حاضر تسریع روند ترمیم زخم با افزایش فعالیت آنژیوژنزیس می‌باشد، اما برای بررسی بیشتر، ضخامت لایه های مختلف پوست و فاکتورهای دیگر مورد برسی قرارگرفته را نیز اندازه گیری کردیم. هنگامی‌که محلول را روی زخم می‌ریزیم، چون موش حیوانی پرتحرک است، سریعاً با تکانی که به خود می‌دهد مایع را از پشت خود خارج می‌کند و در همان مدت کوتاه محلول فقط جذب لایه سطحی پوست یا همان اپیدرم می‌شود. پیش‌بینی می‌شود اگر طول مدت درمان طولانی‌تر شود و یا از این محلول پماد یا ژلی ساخته شود و روی زخم قرارگیرد ضخامت اپیدرم و همچنین ضخامت کل پوست بالاتر رود.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از کلیه پرسنل مجتمع آزمایشگاهی زکریای رازی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران جهت اجرای این تحقیق، سپاسگزاری ‌می‌شود. همچنین از پرسنل‌ محترم شرکت دی پترونیک جهت تهیه تصاویر میکروسکوپ الکترونی سپاسگزاری می‌شود.

  1. پریور، ک.، یغمایی، پ.، حیاتی‌رودباری، ن.، و محمدی‌محقق، پ.، 1390. مشاهده اثر استفاده توأم موضعی و خوراکی کمبوچا بر ترمیم جراحتهای ناشی از سوختگی درجه سوم در موشهای صحرایی بالغ، مجله علوم پزشکی دانشگاه آزاد اسلامی، دوره 22، شماره 1، صفحات 1 تا 11.
  2. خلیلی بروجنی، م.، انوری پور، ب.، متوسل، م.، و جدیدی، ن.، 1391. تولید نانو ذرات کیتوسان و بررسی عوامل مؤثر بر سایز نانو ذرات، دانشکده نفت شهید تندگویان، دانشگاه صنعت نفت آبادان، اولین همایش ملی علوم و فناوری نانو، باشگاه پژوهشگران جوان واحد اهواز، 7 صفحه.
  3. 3.        شیخ الاسلامی، ز.، 1390. استفاده‌های صنعتی کیتوسان، مجله علوم و صنایع پلاستیک، لاستیک و کامپوزیت. ماهنامه علوم و صنایع پلیمر، سال سیزدهم. شماره 6 (پیاپی 110)، 108 صفحه، صفحه 92. 
    1. Boucard, N., Vitona, C., Agayb, D., Maric, E., Rogerc, T., Chancerelleb, Y., and Domard, A., 2000. the use of physical hydrogels of chitosan for skin regeneration following third-degree burns. Biomaterials, 28, PP: 3478-3488.
    2. Cho, Y.W., Cho, Y.N., Chung, S.H., Yoo, G., and Ko, S.W., 1999. Water-soluble chitin as a wound healing accelerator. Biomaterials, 20, PP: 2139-2145.
    3.  Geerligs M, Breemen L, Peters G, Ackermans P, Baaijens F and Oomens C., April, 2011. In vitro indentation to determine the mechanical properties of epidermis. Journal of Biomechanics. Volume 44, Issue 6, 7, PP: 1176–1181.
    4. Han, S.S., 2005. Topical formulations of water-soluble chitin as a wound healing assistant evaluation on open wounds using a rabbit ear model. Fibers and Polymers, 6, PP: 219-223.
    5. Herndon, D., ed., "Chapter 1: A Brief History of Acute Burn Care Management". Total burns care (4th Ed.). Edinburgh: Saunders.
    6. Ishihara, M., Nakanishi, K., Ono, K., Sato, M., Kikuchi, M., Saito, Y., Yura, H., Matsui, T., Hattori, H., Uenoyama, M., and Kurita, A., 2002. Photo cross linkable chitosan as a dressing for wound occlusion and accelerator in healing process. Biomaterials, 23, PP: 833-840.

 

10. Kweon, D.K., Song, S.B., and Park, Y.Y., 2003. Preparation of water-soluble chitosan/heparin complex and its application as wound healing accelerator. Biomaterials, 24, PP: 1595-1601.

11. Lee, Y.M., Kim, S.S., Park, M.H., Song, K.W., Sung, Y.K., and Kang, I.K., 2000. Beta-chitin-based wound dressing containing silver sulfurdiazine. J Mater Sci Mater Med, 11, PP: 817-823.

12. Loke, W.K., Lau, S.K., Yong, L.L., Khor, E., and Sum, C.K., 2000. Wound dressing with sustained antimicrobial capability. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials; 53: 8-17.

13. Mattioli-Belmonte M, Zizzi A, Lucarini G, Giantomassi F, Biagini G, Tucci G, Orlando F,Provinciali M, Carezzi F, Morganti P.2007, Chitin nanofibrils linked to chitosan glycolate as spray, gel and gauze preparations for wound repair. Journal of Bioactive and Compatible Polymers 22: 525-538.

14. Mezzana, P., 2008. Clinical efficacy of a new chitin nanofibrils-based gel in wound healing. International journal of plastic surgery Acta Chir Plast (Acta chirurgiae plasticae), 50(3), PP: 81–4.

15. Mi, F.L., Wu, Y.B, Shyu, S.S., Chao, A.C., Lai, J.Y., and Su, C.C., 2003. Asymmetric chitosan membranes prepared by dry/wet phase separation: A new type of wound dressing for controlled antibacterial release. Journal of Membrane Science; 212, PP: 237-254.

16. Murakami, K., Aoki, H., Nakamura, S., Nakamura, S.I., Takikawa, M., Hanzawa, M., Kishimoto, S., Hattori, H., Tanaka, Y., Kiyosawa, T., Sato, Y., and Ishihara, M., 2010, Hydrogel blends of chitin/chitosan, fucoidan and alginate as healing-impaired wound dressings. Biomaterials, 31, PP: 83-90.

17. Peck, M.D., 2011. "Epidemiology of burns throughout the world. Part I: Distribution and risk factors". Burns: journal of the International Society for Burn Injuries, 37 (7), PP: 1087–100. DOI: 10.1016/j.burns.2011.06.005. PMID 21802856.

مجله پژوهشهای جانوری (مجله زیست شناسی ایران)(علمی)
دوره 28، شماره 3 - شماره پیاپی 3
آذر 1394
صفحه 282-292
  • تاریخ دریافت: 20 اردیبهشت 1393
  • تاریخ بازنگری: 06 آذر 1393
  • تاریخ پذیرش: 15 آذر 1393