اثرات کورکومین بر کبد رت­های ویستار مبتلا به سندرم تخمدان پلی­کیستیک القاء شده با استرادیول والرات

محمد نبیونی^1*، ویدا حجتی²، آزیتا قربانی ² و لطیفه کریم زاده باردئی³ 

¹ تهران، دانشگاه خوارزمی (تربیت‌معلم)، دانشکده علوم زیستی، گروه سلولی و مولکولی

² دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیست­شناسی

³ تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی و آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوینی 

تاریخ دریافت: 21/11/93              تاریخ پذیرش: 9/6/94 

چکیده

سندرم تخمدان پلی­کیستیک (PCOS) نارسایی اندوکرینی است که بافت کبدی را تحت تأثیر قرارداده و منجر به نکروز، فیبروز وسیروز کبدی می­شود. کورکومین ترکیب اصلی مشتق شده از ریشه گیاه زردچوبه (Curcuma longa) دارای خواص آنتی اکسیدانی و اثرات محافظتی برکبد است. در تحقیق حاضر پس از القاء سندرم تخمدان پلی­کیستیک (PCOS=Polycystic Ovary Syndrome) رت­های بیمار تحت تیمار با کورکومین به‌عنوان یک عامل ضدالتهابی و آنتی‌اکسیدانی قرار داده شدند. در این بررسی تجربی، تعداد 90 سر رت بالغ ویستار به گروه کنترل (بدون هیچ تزریقی) و گروه PCOS (تحت تزریق زیرپوستی دو میلی گرم استرادیول والرات) تقسیم گردیدند. پس از 60 روز و تأیید پلی­کیستیک شدن این گروه به مدت 14 روز متوالی تحت تزریق درون صفاقی غلظت mg/kgBW300 کورکومین قرارگرفتند و سپس بافت کبد و نمونه خون بمنظور مطالعات بافتی و تغییرات سطح پروتئین واکنشگرP (CRP) ، استرادیول و تستوسترون برداشت شدند. داده­ها با استفاده از روش تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA  one way) در سطح  0.05 P<و 3.567 F> مقایسه شدند. نتایج حاصل از مطالعات سرمی و بافت­های کبد رنگ­آمیزی شده با هماتوکسیلین و ائوزین افزایش معنی­داری در میزان شاخص‌های سرمی تحت بررسی و تعداد سلول‌های ایمنی کوپفر و هپاتوسیت­های آسیب‌دیده در گروه مبتلا به سندرم تخمدان پلی­کیستیک نسبت به کنترل نشان داد. در حالیکه این علائم التهابی در گروه کورکومین بصورت معنی­داری تقلیل یافت. افزایش میزان لیپوپروتئین های با چگالی کم و تری گلیسیرید در نمونه‌های مبتلا به سندرم تخمدان پلی­کیستیک و کاهش میزان آنها در نمونه­های تحت تیمار با کورکومین دیده شد. در مجموع نتایج نشان داد کورکومین از طریق خواص ضدالتهابی خود دارای اثرات مفیدی بر روی علائم التهابی سندرم تخمدان پلی­کیستیک در کبد می‌باشد.

واژه­های کلیدی: کبد، سندرم تخمدان پلی کیستیک، کورکومین، رت.

* نویسنده مسئول، تلفن: 34579600-026، پست الکترونیکی: devbiokharazmi@gmail.com

مقدمه

کورکومین یک ترکیب فنولی هیدروفوب مشتق شده از ریشه گیاه علفی زردچوبه (Curcuma longa) است و طیف وسیعی از فعالیت­های بیولوژیکی و فارماکولوژیکی را سبب می­شود (2). کورکومین تجاری  محتوی حدود 77 درصد Difeuloylmethane، 17 درصد Demethoxy curcumin و 6 درصد Bisdemethoxy curcumin است که به‌طورکلی به این ترکیبات کورکومینوئیدها گفته می‌شود. کورکومین به عنوان ماده اصلی گیاه زردچوبه شناسایی‌شده و خواص آنتی­اکسیدانی، ضدالتهابی، ضدمیکروبی و ضد سرطان‌زایی را نشان داده است. همچنین اثرات محافظی برکبد و کلیه دارد و مهارکننده انعقاد خون است و مانع از حملة انفارکتوس میوکاردیک می­شود. گیاه زردچوبه به طور سنتی برای درمان بسیاری از بیماری­ها به کار می­رود. به‌ویژه به‌عنوان یک ماده که دارای اثر ضدالتهابی است. همچنین کورکومین باعث افزایش کارایی سیستم ایمنی، افزایش حفاظت سیستم قلبی- عروقی و سیستم عصبی می­شود. دی‌فرولویل متان (Diferuloylmethan) که 5-2% زردچوبه را تشکیل می‌دهد، مشتقی از متان است که به‌وسیله‌ی دو بنیان اسیدفرولیک استخلاف شده است. این ترکیب در سال 1815 از زردچوبه استخراج‌شده و در سال 1910 ساختار آن تحت عنوان diferuloylmethan شناسایی شد. کورکومین ترکیبی است با فرمول C₂₁H₂₀O₆ و با وزن مولکولی  39/368 گرم بر مولار که دمای ذوب آن 183 درجه سانتی­گراد است. کورکومین در آب و اتر نامحلول ولی در الکل، اسیداستیک، استون، DMSO (دی متیل سولفواکسید) و در برخی روغن‌ها قابل‌حل می‌باشد (19). بسیاری از مدل­های انسانی و حیوانی مطالعه شده نشان داده­اند که کورکومین حتی در دوزهای بسیار زیاد کاملاً بی­خطر است. زردچوبه از قرن‌ها پیش برای درمان بیماری‌هایی نظیر بیماری‌های کبدی، پوستی و ویروسی مورد استفاده بوده است. خواص آنتی‌اکسیدانتی، ضدسرطانی، ضدویروسی، ضدروماتیسمی و ضدالتهابی کورکومین را اثبات نموده‌اند. همچنین اثرات حفاظتی این ترکیب بر ضد بیماری‌های کبدی، پوستی و کلیوی اثبات‌شده است. کورکومین ازنظر ساختمان شیمیایی پلی­فنول (diferuloylmethane) است. بدین‌جهت توان آنتی­اکسیدانی بالایی دارد و در شرایط استرس اکسیداتیو اثر محافظتی خود را از طریق پراکسیداسیون لیپیدی و جمع­آوری رادیکال‌های آزاد اکسیژن و افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس ترانسفراز و درنتیجه گلوتاتیون داخل سلولی بر کبد اعمال می‌کند. بدین ترتیب از این گیاه به‌عنوان محافظ کبدی نام برده می‌شود (2، 24).

به دلیل نقش مهم کبد در مسیرهای متابولیکی بدن، هرگونه اختلال در عملکرد کبد در گروه سندرم متابولیک (metabolic syndrome) دسته‌بندی می‌شود. سندرم متابولیک نیز با دارا بودن علائمی همچون مقاومت به انسولین و استروژن و سیتوکین­های التهابی افزایش‌یافته، افزایش تعداد و فعالیت سلول‌های چربی همبستگی زیادی را با سندرم تخمدان پلی­کیستیک نشان می‌دهد. گرچه مطالعات حیوانی در زمینه­ی این همبستگی اندک است اما جوامع مورد مطالعه در ژاپن و امریکا نشان از بروز علائم ﺳﻨﺪرم ﺗﺨﻤﺪان ﭘﻠﻲﻛﻴﺴﺘﻴﻚ (PCOS:Polycystic Ovary Syndrome) در زنان مبتلابه اختلالات متابولیکی و نیز تقلیل علائم متابولیکی و تولیدمثلی در این زنان توسط متفورمین به عنوان موثرترین و رایج ترین روش درمان دیابت نوع دو دارد.  طیف وسیعی از اختلالات کبدی، سرطان کبد و از رده خارج شدن این بافت در هر دو سندرم قابل‌ مشاهده است (23).

PCOS ﺷﺎﻳﻊﺗﺮﻳﻦ ﻋﻠﺖ ﻧﺎﺑﺎروری اﺳﺖ (20% ﻋﻠﻞ ﻧﺎﺑﺎروری زوﺟﻴﻦ). 6-8% زﻧﺎن ﺳﻨﻴﻦ ﺑﺎروری مبتلابه اﻳﻦ اﺧﺘﻼل اﻧﺪوﻛﺮﻳﻨﻲ­اﻧﺪ (4). افزایش مقاومت به انسولین در این سندرم نیز دیده شده است که خود انسولین باعث افزایش غیرطبیعی آندروژن می‌شود (12). مبتلایان علائمی نظیر اختلالات قاعدگی و عدم تخمک‌گذاری، دیابت، چاقی، فشارخون بالا، افزایش سطح پروتئین واکنشگر C (شاخص بیماری­های قلبی و التهابی)، افزایش اندروژن و هورمون­های مردانه (تستوسترون، آندروستندیون و دهیدرواپی­آندرستندیون) را احساس کنند (9،11). زنان مبتلابه PCOS ویژگی­های مشابه زیادی را به‌طور خاص با سندرم متابولیک ازجمله اختلال در محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تخمدان" هیپرانسولینمی" افزایش سیتوکین­ها و فاکتورهای مشتق از چربی و دیس لیپیدمی دارند. دیس لیپیدمی در PCOS با افزایش تری­گلیسیریدها و کاهش لیپو پروتئین با چگالی بالا و کلسترول مشخص می‌شود. شاخص کلاسیک لیپوپروتئین آتروژنیک با افزایش تری گلیسیرید، کاهش سطح لیپوپروتئین با چگالی بالا و نسبت بالای  لیپوپروتئین با چگالی پایین به لیپو پروتئین با چگالی بالا که مشخصه زنان مبتلابه PCOS  چاق می‌باشد مشخص می­شود (14).

با توجه به مصرف مداوم کورکومین به‌عنوان چاشنی غذایی و نیز با تکیه‌بر خواص ضدالتهابی این محصول گیاهی، در این مطالعه تلاش شد اثرات حمایتی کورکومین بر بافت کبد رت که درجاتی از آسیب بافتی را تحت تأثیر علائم متابولیکی PCOS نشان داد مورد بررسی قرارگیرد. بنابراین در این تحقیق فرض بر این است که این ترکیب بتواند موجب بهبود عوارض کبدی علائم سندرم تخمدان پلی­کیستیک گردد. هدف این تحقیق بررسی اثرات محافظتی کورکومین بر بافت کبد رت­های ویستار مبتلابه سندرم تخمدان پلی­کیستیک می­باشد.

مواد و روشها 

دراین مطالعه 90 سر موش آزمایشگاهی بزرگ (رت) نژاد ویستار ماده با وزن20±170 گرم استفاده شد که در قفس­های مخصوص با فضای استاندارد و تحت شرایط محیطی مناسب و درجه حرارت مطلوب 24-20 درجه سانتی­گراد و سیکل روشنایی و تاریکی 12 ساعته در مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه خوارزمی نگهداری شدند. رت­هایی که دارای دو الی سه دوره استروس منظم در طی دوازده الی چهارده روز مشاهده­ی اسمیر واژینال بوده و در مرحله­ی استروس سیکل تولیدمثلی خود قرار دارند انتخاب شدند. رت­های در سه گروه دسته‌بندی شدند. گروه کنترل که هیچ ماده‌ای دریافت نکرد، گروه PCOS که القای این سندرم در آنها بواسطه­ی تزریق تک‌مرحله‌ای زیرپوستی 2 میلی‌گرم استرادیول والرات که در روغن کنجد حل‌شده بود، به رت­های انتخاب شده با معیارهای مذکور صورت گرفت و گروه شم که به همان میزان روغن کنجد به‌عنوان حلال استرادیول دریافت کردند. گروه کنترل، گروه شم و گروه PCOS به مدت 60 روز پس از تزریق روغن کنجد و استرادیول والرات تحت بررسی­های اسمیر واژینال قرارگرفتند (1). این کار در اوایل روز صورت گرفت و به‌وسیله یک سوآپ پنبه­ای که با آب یا سالین مرطوب و نرم شده به‌صورت دورانی از مخاط واژن رت­ها نمونه‌گیری شد و بر روی یک لام تمیز قرارگرفت و بعد از فیکس کردن، نمونه روی لام را به وسیله متیلن بلو رنگ شد تا نامنظم شدن سیکل استروس که یکی از علائم PCOS است، بررسی و مشاهده شود. علاوه بر این به‌منظور تأیید نهایی القای سندرم تخمدان پلی­کیستیک، سه سر از رت­ها را کشته و تخمدان­های پلی­کیستیک مشاهده شد. رویت کیست‌های سفید در تخمدان آنها به‌صورت ماکروسکوپی و همچنین بررسی مقاطع بافتی رنگ­آمیزی شده با هماتوکسیلین-ائوزین به صورت میکروسکوپی، مشاهداتی دال بر القای PCOS در این گروه بود. به دلیل عدم وجود تفاوت معنی‌دار در مشاهدات و داده‌های مربوط به گروه شم، این گروه به قرینه گروه کنترل، حذف گردید. بدین ترتیب که از داده‌های گروه شم صرفنظر شد و تنها داده‌های مربوط به گروه کنترل لحاظ شد.

پس از بررسی تخمدان­های سه سر رت ازنظر مورفولوژی و حصول اطمینان از القاء سندرم پلی­کیستیک، تعدادی از رت­های PCOS خود به دو گروه شم و تیمار شده با کورکومین تقسیم شدند. رت­های گروه شم، حلال کورکومین دی متیل سولفوکسید (DMSO) دریافت کردند. به رت­های گروه تیمارشده با کورکومین نیز با توجه به دوز مجاز کورکومین برای رت که 1000 تا 2000 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رت گزارش شده است، میزان 300 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رت­ها کورکومین حل‌شده در DMSO به مدت 14 روز به‌صورت داخل صفاقی تزریق شد (16).  بنابراین گروه‌های مورد بررسی شامل گروه کنترل، گروه شم (DMSO)، گروه PCOS و گروه تیمار شده با دوز 300 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن کورکومین بودند. قسمت شکمی حیوان با الکل 70 درصد استریل شد و حیوان را سرپایین نگه‌داشته طوری که احشاء به سمت پایین باشد و سرنگ انسولین حاوی محلول کورکومین به‌آرامی از بین کشاله ران و شکم وارد بدن رت شد. برای اطمینان از این‌که سوزن سرنگ انسولین وارد صفاق شده باشد ابتدا آسپیره کرده و در صورت عدم مشاهده مایع سبز یا زرد رنگ در سرنگ، تزریق انجام شد. پس از کشتن رت­ها در اثر استنشاق کلروفرم، با استفاده از سرنگ 5 سی‌سی خون‌گیری از قلب حیوانات انجام شد. سپس با استفاده از سانتریفیوژ 3 هزار دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سرم نمونه‌های خونی را جدا کرده و به‌منظور بررسی تغییرات میزان سرمی پروفایل چربی به روش آنزیمی کالریمتری کمی GPO-PAP /CHOD-PAP/endopoint و با استفاده از معرف‌های تهیه‌شده توسط کمپانی زیست‌شیمی، تستوسترون و استرادیول به روش الایزا با استفاده از کیتCosmo Bio Co. Ltd. Japan   کشور ژاپن و میزان CRP به روش الایزا با استفاده از کیت Millipore’s MILLIPLEX® MAP Rat/Mouse CRP Single Plex USA کشور امریکا در هر چهار گروه کنترل، شم، PCOS و تیمار شده با کورکومین آزمایش های سرولوژیک انجام شد.

همچنین بافت کبدی از هر چهار گروه برداشت‌شده و در فیکساتیو بوئن قرارداده شد تا مطالعه بافت­شناختی آن جهت بررسی اختلالات کبدی ناشی از القای PCOS و همچنین بررسی اثرات درمانی کورکومین براین بافت صورت گیرد. جهت مقایسه بافت کبدی در چهار گروه تحت آزمایش و بررسی بروز نکروز کبدی در گروه بیمار و بهبود آن در گروه­های تیمار شده با کورکومین از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین استفاده شد.

جهت تجزیه و تحلیل آماری داده‌های حاصل از آزمایشات سرولوژیک و داده­های حاصل از شمارش سلولی و مقایسه میانگین‌ها از روش آنالیز واریانس یک‌طرفه (One-way ANOVA) و نرم‌افزار Instat3 و آزمون آماری توکی در سطح 0.05P< و3.567F> استفاده شد. تمامی آزمایش‌ها با حداقل سه تکرار انجام‌شده و نمودارها از طریق نرم‌افزار EXCEL رسم شدند.

نتایج

سنجش‌تری گلیسیرید: میزان تری گلیسیرید سرم خون در گروه کنترل و شم تفاوت معنی‌داری نداشت و در محدوده طبیعی بود ولی در گروه PCOS میزان تری­گلیسیرید نسبت به گروه کنترل و شم بالاتر بود و بررسی‌های مورفولوژیک در هنگام باز کردن بدن رت­ها حاکی از وجود چربی‌های شکمی در بدن بخصوص اطراف تخمدان‌ها بود که خود تأییدی برافزایش کاملاً معنی‌دار سطح ‌تری­گلیسیرید خون در این گروه است. درواقع شیوع چاقی و دیس لیپیدمی در رت­های مبتلابه سندرم بیشتر از رت­های کنترل و شم می‌باشد ولی میزان تری­گلیسیرید در گروه تیمار شده با کورکومین بصورت معنی‌داری نسبت به گروه PCOS کاهش یافت (شکل 1).

سنجش HDL: بررسی میزان HDL در سرم خون گروه‌های کنترل، شم، PCOS و تیمار شده با کورکومین نشان داد لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL) در گروه PCOS نسبت به گروه کنترل و شم کاهش چشمگیری داشت در حالیکه میزان این فاکتور لیپوپروتئینی در سرم خون گروه تیمار شده با دوز 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم کورکومین نسبت به گروه PCOS تقریباً حالت طبیعی و نزدیک به سطح آن در گروه کنترل و شم بود (شکل2).

سنجش LDL: میزان LDL نتایجی مشابه با تغییرات تری­گلیسیرید نشان داد، بدین معنا که در گروه PCOS میزان سرمی LDL نسبت به گروه کنترل و شم افزایش ولی با تیمار رت­های مبتلابه سندرم با کورکومین میزان این فاکتور کاهش معنی‌داری نسبت به گروه PCOS یافت (شکل 3).

سنجش سطح سرمی کلسترول: سطح سرمی کلسترول پس از القاء PCOS  در این گروه  نسبت به گروه کنترل و شم کاهش یافت. درحالی‌که پس از تیمار رت­ها با دوز 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم کورکومین میزان کلسترول در گروه تیمار یافته نسبت به گروه PCOS افزایش یافت (شکل 4).

شکل1-  تغییرات میزان تری گلیسیرید در گروه‌های کنترل، شم،  PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلی‌گرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشان‌دهنده‌ی تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم می‌باشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه PCOS است.  (n=10, میانگین ± انحراف معیار)، 0.05P< *،0.001P<***

شکل2-  تغییرات میزان HDL در گروه‌های کنترل، شم، PCOS و رت­های PCOS تیمار شده با 300 میلی‌گرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشان‌دهنده‌ی تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم می‌باشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه PCOS است.  (n=10 میانگین ± انحراف معیار)، 0.05 P<*0.01P<**

شکل3- تغییرات میزان LDL در گروه‌های کنترل، شم،  PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلی‌گرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشان‌دهنده‌ی تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم می‌باشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه PCOS است.  (,n=10 میانگین ± انحراف معیار) 0.01P<**

شکل4-  تغییرات میزان کلسترول تام در گروه‌های کنترل، شم،  PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلی‌گرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشان‌دهنده‌ی تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم می‌باشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنی‌دار این گروه نسبت به گروه PCOS است.  (,n=10 میانگین ± انحراف معیار)، 0.01P<^***0.001P<**

سنجش سطح سرمی CRP، استرادیول و تستسترون: افزایش معنی‌داری در سطح سرمی هورمون‌های استرادیول و تستوسترون و نیز فاکتور التهابی CRP در گروه PCOS نسبت به گروه کنترل و شم مشاهده شد. این افزایش بواسطه تیمار حیوانات با کورکومین به سطح طبیعی در نمونه‌های کنترل و شم تقلیل یافت و این کاهش نسبت به گروه PCOS معنی‌دار بود (جدول 1).

رنگ­آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین: در نمونه­های کنترل هپاتوسیت­های کبدی، لوبول­های کبدی و همچنین فضای 3 گانه پورت همگی طبیعی بودند (شکل a-5 و a-6). این در حالی بود که در نمونه­های مربوط به رت­های دچار این سندرم، نکروزبافتی و پرخونی مشاهده شد (شکل b-5 وb-6) و در نمونه­های تیمار شده با دوز300 میلی‌گرم بر کیلوگرم پورت‌ها نکروزبافتی و قطعه‌قطعه شدن و مچاله شدن هسته مشاهده نشد.

جدول 1- مقایسه تعداد هپاتوسیت های آسیب‌دیده و سلول‌های کوپفر  و سطح سرمی CRP، استرادیول و تستسترون در گروه‌های کنترل، شم،  PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلی‌گرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان.  (05/0< P *، 01/0<P**، 001/0<P***).

یکدست بودن طناب‌های هپاتوسیت و مشخص بودن مرزهای سلولی مشاهده شد (شکل c-5 و c-6). در کل می­توان نتیجه گرفت که دوز 300 اثرات مفیدی را از نظر بافت­شناسی بر روی بافت­های کبدی حاصل از رت های دچار سندرم اعمال کرد.

شکل5-  فوتومیکروگراف حاصل از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین کبد رت سالم (a)، کبد رت PCOS (b) و کبد رت­های PCOS تیمار شده با دوز300 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن حیوان کورکومین (c) a: کبد سالم که در آن هپاتوسیت های کبدی، لوبول های کبدی و همچنین پورت‌های کبدی (پیکان‌ها) طبیعی هستند. b: کبد نمونه PCOS  که در آن ساختار پورت به‌هم‌ریخته (پیکان‌ها)، نکروز بافتی (بدشکل شدن سلول‌های کبدی به‌صورت از بین رفتن حدود سیتوپلاسمی سلول‌های کبدی و تغییر در هسته سلول‌ها در محدوده‌ای که با دایره سیاه نمایش داده‌شده است) مشاهده می‌شود. c: در نمونه‌های تیمار شده با دوز 300 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن حیوان کورکومین، فضای پورت‌ها طبیعی به نظر می­رسد (a,b,c x200).

شکل6- فوتو میکروگراف حاصل از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین کبد رت سالم (a)، کبد رت PCOS (b) و کبد رت­های PCOS تیمار شده با دوز300 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن حیوان کورکومین (c).  تغییر در تمامیت هپاتوسیت­ها، نکروز بافتی و قطعه‌قطعه شدن و مچاله شدن هسته، منظم بودن طناب‌های هپاتوسیت و مشخص بودن مرزهای سلولی (پیکان) در گروه‌های موردبررسی مقایسه شده است (a,b,c x100).

شمارش سلولی: میانگین تعداد هپاتوسیت­های آسیب‌دیده (دارای هسته پیکنوزه و سیتوپلاسم آسیب‌دیده) در سطحی برابر با 1000 میکرومترمربع در گروه کنترل 24 عدد شمارش گردید درحالی‌که با القاء سندرم به 90 عدد رسید که این افزایش ازنظر آماری نسبت به گروه کنترل و شم معنی‌دار بود (0.001P<). درحالی‌که کاربرد دوز300 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن از این ترکیب منجر به کاهش تعداد سلول­های آسیب‌دیده تا 71 عدد شد. میانگین تعداد سلول‌های کوپفر در گروه کنترل 16 عدد شمارش گردید درحالی‌که با القاء سندرم پلی­کیستیک به 34 عدد رسید که این افزایش ازنظر آماری نسبت به گروه کنترل و شم معنی­دار بود (0.001P<). درحالی‌که کاربرد دوز300 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن از این ترکیب منجر به کاهش تعداد سلول­های آسیب­دیده و کوپفر شد که نسبت به گروه PCOS به ترتیب با (0.01P<) و (0.05P<) معنی‌دار بود (جدول 1).

بحث

سندرم تخمدان پلی­کیستیک به‌عنوان یک اختلال پیچیده هورمونی و متابولیکی، بافت کبد را نیز درگیر می‌کند (24). از تظاهرات بالینی مبتلایان به سندرم تخمدان پلی­کیستیک، بیماری‌های کبدی شامل بروز نکروز، فیبروز و در مراحل پیشرفته بیماری بروز سیروز کبدی می‌باشد (7). این سندرم در صورت عدم تشخیص زودرس و درمان مناسب، به دلیل تخریب پیش‌رونده سلول­های کبدی می­تواند منجر به بیماری پیشرفته و غیرقابل برگشتی به نام «سیروز کبدی» شود. به‌عبارتی‌دیگر بیماری کبد چرب شامل طیفی از اختلالات کبدی است که از تجمع چربی در سلول­های کبدی آغاز شده و به التهاب، تخریب سلول کبدی و در نهایت بیماری مزمن و غیرقابل‌برگشت سیروز کبدی منتهی می­شود (2). در این بررسی به‌منظور القای سندرم تخمدان پلی­کیستیک از روش تزریق زیرپوستی استرادیول ولرات استفاده شد. در مطالعه همدن (2009) از این هورمون به منظور ترمیم اختلالات کبدی در رت­های نر در سنین بالا (12-18ماهه) استفاده‌ شده است ولی با توجه به تحقیق براور (1978) که توانست این روش را بنیان گذارد استرادیول که در ابتدای بلوغ رت­های جنس ماده ویستار (هشت هفتگی) و در مرحله استروس از سیکل استروس تزریق می‌شود، اثر متفاوتی نسبت به اثر آن در تحقیق همدن (2009) داشته و می‌تواند منجر به ایجاد چهره التهابی PCOS گردد (22، 6). چراکه در جنس ماده محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزی-تخمدانی نقش مهمی را در تکوین تخمدان و سیستم هورمونی و متابولیکی دارد. استنر و ویکتورین  (2004) اثبات کرد که تزریق استرادیول ولرات در رت­های ماده‌ای که در سنین ابتدایی بلوغ هستند، سبب افزایش فعالیت هسته‌های قوسی هیپوتالاموس رت­های ماده می‌شود. متعاقباً نورون‌های سمپاتیکی در تخمدان افزایش فعالیت نشان داده و تولید فاکتور رشد عصبی (Nerve growthfactor: NGF) را بالا می‌برند. سطح بالای این فاکتور در ایجاد التهاب سیستمیک و اختلالات اتوایمن دخیل است (5). ازاین‌رو در این مطالعه از میان روش‌های دیگر القای سندرم، از روش استرادیول ولرات هم به دلیل قرابت سندرم القا شده با مدل انسانی و هم به دلیل ایجاد وضعیت التهابی این سندرم در رت، استفاده شد.

سندرم تخمدان پلی­کیستیک اغلب با انواع الگوهای دیس لیپیدمی از جمله کاهش کلسترول لیپوپروتئین با چگالی بالا  (HDL-C)، سطح بالای تری­گلیسیرید (TG)، کلسترول کل (TC) و کلسترول لیپوپروتئین با چگالی کم (LDL-C) مرتبط است (7). در این تحقیق هم پس از القاء PCOS نتایجی همسو با مطالعه فوق به دست آمد. سطح ‌تری­گلیسیرید، کلسترول، LDL و HDL در هر چهار گروه کنترل، شم، سندرم پلی­کیستیک ‌و‌ تیمار شده با کورکومین بررسی شد. میزان تری­گلیسیرید و LDL‌ در نمونه‌های بیمار نسبت به کنترل افزایش و در نمونه‌های تیمار شده با کورکومین کاهش را نشان داد. برعکس میزان کلسترول و HDL در نمونه‌های بیمار نسبت به کنترل کاهش یافت که در نمونه‌های تیمار شده با کورکومین افزایش را نشان داد. بدین ترتیب می‌توان نتیجه گرفت که کورکومین می‌تواند در تعدیل دیس لیپیدمی به‌عنوان یکی از علائم التهابی حاصل از PCOS در این بررسی نیز مؤثر بوده باشد. از علائم التهابی بررسی‌شده در این تحقیق پروتئین واکنشگر C است. این پروتئین که توسط آدیپوسیت­های کبد ترشح می‌شود در طی التهاب میزان تا 50 هزار برابر به‌واسطه‌ی افزایش غلظت پلاسمایی اینترکولین 6 بالا می‌رود. با کاهش میزان سرمی این فاکتور در نمونه‌های تیمار شده با کورکومین در این بررسی می‌توان دریافت که احتمالاً کورکومین فعالیت‌های محافظتی خود را بر بافت کبد از طریق کاهش شاخص‌های مهم التهابی اثر می‌دهد. چنانچه جورنکا در مطالعات خود در سال 2009 هم ادعا کرد که کورکومین از طریق مسیر NF-ƘB که مهم‌ترین مسیر سیگنالینگ در التهاب سیستمیک محسوب می‌شود، می‌توانند دیگر اثرات خود را (آنتی­اکسیدانی و ضد سرطان‌زایی و...) اعمال نماید. NF-ƘB به‌وضوح یکی از مهم‌ترین تنظیم‌کننده‌های بیان ژن پیش التهابی است و سنتز سایتوکاین­هایی مانند TNF-α , IL-1β , IL-6 ,IL-8 را میانجی‌گری می‌کند (15، 14). از سوی دیگر تعیین و مقایسه سطح سرمی استرادیول و تستوسترون می‌تواند میزان عملکرد بافت کبد را نمایان سازد. SHBG (Sex Hormone Binding Globulin) پروتئین حامل تستوسترون و استرادیول است که از کبد تولید می‌شود و میزان آن با میزان استرادیول و تستوسترون که توسط بافت تخمدان تولید می‌گردند، تنظیم می‌شود و میزان آن در مبتلایان به PCOS کاهش می‌یابد. علی‌رغم اینکه در این بررسی میزان SHBG اندازه‌گیری نشد ولی با تکیه ‌بر بررسی Hamden، می‌توان گفت در این سندرم احتمالاً افزایش میزان استرادیول و تستوسترون که در تخمدان تولید می‌گردند، شواهدی دال بر کاهش SHBG می‌باشد (13). بعلاوه باتاایل در تحقیق در سال 2005 خود نشان داد که کاهش SHBG با تغییرات پروفایل لیپیدی مرتبط است (8). بدین ترتیب اختلالی که در کبد رخ‌داده است وابستگی نزدیکی با وضعیت بافتی تخمدان پلی­کیستیک دارد و تحت تأثیر محصولات هورمونی محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تخمدان است. بدین معنا که افزایش میزان CRP و کاهش میزان SHBG و متعاقباً تغییرات پروفایل لیپیدی در گروه PCOS در این تحقیق نسبت به دیگر اختلالات کبدی که مستقل از این محور به وجود می‌آیند، متفاوت است و نیازمند راهکارهایی است که با تأثیر بر منشأ این تغییرات (تخمدان)، وضعیت التهابی و بافتی کبد را به سمت حالت طبیعی سوق داده و بهبود بخشیده است. با توجه به کاهش میزان تستوسترون در این بررسی در گروه‌های تیمار شده با کورکومین می‌توان بیان داشت با نظر به تحقیق تسویی در سال 2008 مبنی بر احتمال کاهش سطح تستوسترون در گروه‌های تیمار شده با کورکومین به دلیل اعمال اثرات این ماده در طول مدت 14 روز بوده است (4).

مطالعه ترکیبات با منشأ گیاهی شاخه‌ای بسیار جالب در علوم پزشکی می‌باشد. بسیاری از این ترکیبات دارای اثرات پیشگیری‌کننده بوده و می‌توانند در برخی جوامع با احتمال زیاد در مهار بیماری‌های خاص مورد استفاده قرارگیرند (18). زردچوبه از قرن‌ها پیش برای درمان بیماری‌هایی نظیر بیماری‌های کبدی، پوستی و ویروسی مورد استفاده بوده است. در طب سنتی از زردچوبه به‌عنوان گیاه محافظ کبدی نام‌برده شده است. اثرات حفاظتی این ترکیب بر ضد بیماری‌های کبدی، پوستی و کلیوی اثبات‌شده است (21). در عصر حاضر با توجه به اثرات درمانی و تأثیرات قابل‌توجه گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی بررسی اثر این گیاهان در دستور کار محققین قرارگرفته است (20).

مروتی و همکاران در سال 2013 نشان دادند که کورکومین تغییرات بافت کبدی موش که در اثر آدرنالکتومی ایجاد شده بود را کاهش می­دهد. در موش­های آدرنالکتومی تیمار شده با کورکومین میزان سلول‌های تغییر شکل یافته که دارای هسته پیکنوزه و سیتوپلاسم چروکیده هستند، به‌طور معنی‌داری کاهش می­یابد. همچنین تعداد سلول­های کوپفر کبدی که پس از برداشت غده آدرنال افزایش‌یافته بودند با مصرف کورکومین به میزان قابل‌توجهی کاهش یافت (12). فرزانگی و همکاران در سال 2013 نشان دادند که در موش‌هایی که در معرض مسمومیت با سرب قرارگرفته‌اند، تمرینات ورزشی و مصرف مکمل کورکومین منجر به کاهش آسیب بافت کبدی در این حیوانات می­شود (10). در راستای بررسی این دو محقق، در مطالعه حاضر، پرخونی سینوزوئیدهای کبدی در گروه PCOS مشاهده شد، سلول­های التهابی (کوپفر) در اطراف ورید مرکزی افزایش‌یافته‌اند و همچنین سلول­های لنفوئیدی به داخل فضای پورت نفوذ یافته­اند. با شمارش سلول­های کوپفر مشاهده شد که تعداد این سلول­ها در پاسخ به آسیب بافتی، در گروه بیمار مقایسه با گروه کنترل افزایش‌یافته است. از طرف دیگر بدشکل شدن سلول­های کبدی به‌صورت از بین رفتن حدود سیتوپلاسمی سلول­های کبدی و تغییر در هسته سلول­ها نظیر (لیزشدگی، قطعه‌قطعه شدن و مچاله شدن هسته) در مقایسه با گروه کنترل نیز افزایش پیداکرده بود. همچنین تعداد سلول­هایی که دچار بدشکلی شده بودند نسبت به گروه کنترل افزایش‌یافته بود. در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که تزریق روزانه کورکومین به میزان 300 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 14 روز دارای اثرات درمانی بر بافت کبد بوده است. به‌گونه‌ای که تعداد سلول‌های تغییر شکل یافته و همچنین تعداد سلول­های کوپفر در بافت کبد رت­های دچار سندرم تخمدان پلی­کیستیک پس از تزریق کورکومین به‌طور معنی‌داری از لحاظ آماری نسبت به گروه بیمار کاهش پیدا کرد. بررسی حاضر همچنین نشان داد که افزایش معنی­داری که در تعداد سلول­های کوپفر گروه PCOS مشاهده شد، در تیمار با کورکومین کاهش یافت. به‌بیان‌دیگر رت­های تیمار شده با 300 کورکومین کاهش معنی‌داری نسبت به گروه PCOS از خود نشان دادند. همچنین میزان پرخونی سینوزوئیدها نیز کمتر از گروه PCOS شد. بنابراین نتایج این بررسی مؤکد بررسی‌های مروتی و فرزانگی و همکاران بوده است.

اثرات درمانی کورکومین بر کبد در چند مسیر دیگر نیز به اثبات رسیده است. مطالعات گسترده­ای که در ارتباط با نقش کورکومین در مهار سرطان انجام‌شده است و نشان داده‌اند که این ترکیب مهارکننده مراحل مختلف شبکه رونویسی بوده و بدین ترتیب از تکثیر سلولی جلوگیری می‌کند (3).

ترکیبات موجود در زردچوبه مثل کورکومین باعث حذف رادیکال های آزاد اکسیژن و افزایش غلظت گلوتاتیون به‌عنوان یک ترکیب مقابله کننده با افزایش تولید رادیکال های آزاد اکسیژن و نیز تغییرات شیمیایی اکسیداتیو لیپیدها، اسیدهای نوکلئوئیک و پروتئین­ها می­شود. کورکومین فعالیت­های آنتی­اکسیدانی را به شیوه مستقیم و غیرمستقیم توسط مهار اکسیژن واکنشی و القاء پاسخ آنتی­اکسیدانی انجام می‌دهد (17). بر پایه این اطلاعات احتمال می‌رود کورکومین به‌عنوان یک ترکیب آنتی­اکسیدان قوی، احتمالاً توانسته است علائم  دیس لیپیدمی و التهاب PCOS را کاهش دهد و بازسازی سلول­های آسیب‌دیده کبدی را موجب شود.

نتیجه­گیری

در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که تزریق روزانه کورکومین به میزان 300 میلی­گرم بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 14 روز دارای اثرات درمانی بر بافت کبد بوده است. به‌گونه‌ای که تعداد سلول­های بدشکل شده و همچنین تعداد سلول­های کوپفر و میزان پرخونی سینوزوئیدها در بافت کبد و همچنین سطح سرمی شاخص التهاب (CRP) در رت­های دچار سندرم تخمدان پلی­کیستیک پس از تزریق کورکومین به‌طور معنی‌داری از لحاظ آماری نسبت به گروه PCOS کاهش پیدا کرد و بهبود عوارض کبدی ناشی از بیماری سندرم تخمدان پلی­کیستیک مشاهده شد.