نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 1) دکترای زیست شناسی سلولی و تکوینی، دانشیار گروه سلولی و مولکولی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی( تربیت معلم)، تهران، ایران
2 1) دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیستشناسی، دامغان، ایران
3 مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی و آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوینی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی( تربیت معلم)، تهران، ایران.
چکیده
سندرم تخمدان پلیکیستیک (PCOS) نارسایی اندوکرینی است که بافت کبدی را تحت تأثیر قرار داده و منجر به نکروز، فیبروز وسیروز کبدی میشود. کورکومین ترکیب اصلی مشتق شده از ریشه گیاه Curcuma longa دارای خواص آنتیاکسیدانی و اثرات محافظتی برکبد است. در تحقیق حاضر پس از القاء PCOS رتهای بیمار تحت تیمار با کورکومین به عنوان یک عامل ضد التهابی و آنتی اکسیدانی قرار داده شدند. در این بررسی تجربی، تعداد 90 سر رت بالغ ویستار به گروه کنترل (بدون هیچ تزریقی) و گروه PCOS (تحت تزریق زیرپوستیmg/kgBW2 استرادیول والرات) تقسیم گردیدند. پس از 60 روز و تأیید پلی کیستیک شدن این گروه به مدت 14 روز متوالی تحت تزریق درون صفاقی غلظت mg/kgBW300 کورکومین قرار گرفتند و سپس بافت کبد و نمونه خون بمنظور مطالعات بافتی و تغییرات سطحCRP ، استرادیول و تستوسترون برداشت شدند. دادهها با استفاده از روش ANOVA one way در سطح P<0.05 و F>3.567 مقایسه شدند. نتایج حاصل از مطالعات سرمی و بافتهای کبد رنگامیزی شده با هماتوکسیلین و ائوزین افزایش معنیداری در میزان شاخصهای سرمی تحت بررسی و تعدادسلولهای ایمنی کوپفر و هپاتوسیتهای آسیب دیده در PCOS نسبت به کنترل نشان داد. در حالیکه این علایم التهابی در گروه کورکومین بصورت معنیداری تقلیل یافت. افزایش میزان LDL و تری گلیسیرید در نمونه های PCOS و کاهش میزان آنها در نمونههای تحت تیمار با کورکومین دیده شد. در مجموع نتایج نشان داد کورکومین از طریق خواص ضد التهابی خود دارای اثرات مفیدی بر روی علایم التهابی PCOS در کبد میباشد.
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
The Effect of Curcumin on Liver of Stradiol Valerate -induced Polycystic Ovarian Syndrome Wistar Rat
نویسندگان [English]
2 1) Department of Biology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
3 Laboratory,s Animal Center & Cellular And Molecular Research Laboratory, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran.
چکیده [English]
Polycystic ovarian syndrome (PCOS) is endocrine insufficiency that affects liver structure in many cases and finally leads to liver necrosis, fibrosis and Cirrhosis. Curcumin, the major constituent in the rhizome of Curcuma longa, has anti-oxidant effects and protects liver tissue. In this experimental study we aimed to evaluate the effects of curcumin on liver dysfunction of PCOS induced rat as an anti-inflammatory therapeutic agent. For this purpose, 90 mature female Wistar rats were divided into control (no injection) and PCOS groups (exposed to subcutaneously administration of estradiol valerate for PCOS induction). PCOS rats were divided into control and experimental groups received 14 days intraperitoneal injection curcumin (300 mg/kg BW). Animals were killed and Liver and serum were taken for histomorphometric examination and serum CRP, stradiol and testostron level. The data were analyzed using One-Way ANOVA with P<0.05 and F>3.567 significance level. Serological assays and Hematoxylin & eosin-stained liver showed that the serum CRP, stradiol and testostron level and also number of Kupffer and damaged or necrotic hepatocytes significantly increased in PCOS compare to control. Whereas, the number of necrotic and kupffer cells decreced in Curcumin-treated groups compared to PCOS. Also, the levels of LDL, triglyceride increased in PCOS group compare to the control group but reduced in curcumin-treated group. Whereas, the levels of HDL and cholesterol decreased in PCOS group compare to the control group but increased in curcumin treatment group. In conclution, we suggest that curcumin has beneficial effect on inflammatory features of PCOS in liver via anti-inflammatory effects.
کلیدواژهها [English]
اثرات کورکومین بر کبد رتهای ویستار مبتلا به سندرم تخمدان پلیکیستیک القاء شده با استرادیول والرات
محمد نبیونی1*، ویدا حجتی2، آزیتا قربانی 2 و لطیفه کریم زاده باردئی3
1 تهران، دانشگاه خوارزمی (تربیتمعلم)، دانشکده علوم زیستی، گروه سلولی و مولکولی
2 دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، گروه زیستشناسی
3 تهران، دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی و آزمایشگاه تحقیقاتی سلولی تکوینی
تاریخ دریافت: 21/11/93 تاریخ پذیرش: 9/6/94
چکیده
سندرم تخمدان پلیکیستیک (PCOS) نارسایی اندوکرینی است که بافت کبدی را تحت تأثیر قرارداده و منجر به نکروز، فیبروز وسیروز کبدی میشود. کورکومین ترکیب اصلی مشتق شده از ریشه گیاه زردچوبه (Curcuma longa) دارای خواص آنتی اکسیدانی و اثرات محافظتی برکبد است. در تحقیق حاضر پس از القاء سندرم تخمدان پلیکیستیک (PCOS=Polycystic Ovary Syndrome) رتهای بیمار تحت تیمار با کورکومین بهعنوان یک عامل ضدالتهابی و آنتیاکسیدانی قرار داده شدند. در این بررسی تجربی، تعداد 90 سر رت بالغ ویستار به گروه کنترل (بدون هیچ تزریقی) و گروه PCOS (تحت تزریق زیرپوستی دو میلی گرم استرادیول والرات) تقسیم گردیدند. پس از 60 روز و تأیید پلیکیستیک شدن این گروه به مدت 14 روز متوالی تحت تزریق درون صفاقی غلظت mg/kgBW300 کورکومین قرارگرفتند و سپس بافت کبد و نمونه خون بمنظور مطالعات بافتی و تغییرات سطح پروتئین واکنشگرP (CRP) ، استرادیول و تستوسترون برداشت شدند. دادهها با استفاده از روش تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA one way) در سطح 0.05 P<و 3.567 F> مقایسه شدند. نتایج حاصل از مطالعات سرمی و بافتهای کبد رنگآمیزی شده با هماتوکسیلین و ائوزین افزایش معنیداری در میزان شاخصهای سرمی تحت بررسی و تعداد سلولهای ایمنی کوپفر و هپاتوسیتهای آسیبدیده در گروه مبتلا به سندرم تخمدان پلیکیستیک نسبت به کنترل نشان داد. در حالیکه این علائم التهابی در گروه کورکومین بصورت معنیداری تقلیل یافت. افزایش میزان لیپوپروتئین های با چگالی کم و تری گلیسیرید در نمونههای مبتلا به سندرم تخمدان پلیکیستیک و کاهش میزان آنها در نمونههای تحت تیمار با کورکومین دیده شد. در مجموع نتایج نشان داد کورکومین از طریق خواص ضدالتهابی خود دارای اثرات مفیدی بر روی علائم التهابی سندرم تخمدان پلیکیستیک در کبد میباشد.
واژههای کلیدی: کبد، سندرم تخمدان پلی کیستیک، کورکومین، رت.
* نویسنده مسئول، تلفن: 34579600-026، پست الکترونیکی: devbiokharazmi@gmail.com
مقدمه
کورکومین یک ترکیب فنولی هیدروفوب مشتق شده از ریشه گیاه علفی زردچوبه (Curcuma longa) است و طیف وسیعی از فعالیتهای بیولوژیکی و فارماکولوژیکی را سبب میشود (2). کورکومین تجاری محتوی حدود 77 درصد Difeuloylmethane، 17 درصد Demethoxy curcumin و 6 درصد Bisdemethoxy curcumin است که بهطورکلی به این ترکیبات کورکومینوئیدها گفته میشود. کورکومین به عنوان ماده اصلی گیاه زردچوبه شناساییشده و خواص آنتیاکسیدانی، ضدالتهابی، ضدمیکروبی و ضد سرطانزایی را نشان داده است. همچنین اثرات محافظی برکبد و کلیه دارد و مهارکننده انعقاد خون است و مانع از حملة انفارکتوس میوکاردیک میشود. گیاه زردچوبه به طور سنتی برای درمان بسیاری از بیماریها به کار میرود. بهویژه بهعنوان یک ماده که دارای اثر ضدالتهابی است. همچنین کورکومین باعث افزایش کارایی سیستم ایمنی، افزایش حفاظت سیستم قلبی- عروقی و سیستم عصبی میشود. دیفرولویل متان (Diferuloylmethan) که 5-2% زردچوبه را تشکیل میدهد، مشتقی از متان است که بهوسیلهی دو بنیان اسیدفرولیک استخلاف شده است. این ترکیب در سال 1815 از زردچوبه استخراجشده و در سال 1910 ساختار آن تحت عنوان diferuloylmethan شناسایی شد. کورکومین ترکیبی است با فرمول C21H20O6 و با وزن مولکولی 39/368 گرم بر مولار که دمای ذوب آن 183 درجه سانتیگراد است. کورکومین در آب و اتر نامحلول ولی در الکل، اسیداستیک، استون، DMSO (دی متیل سولفواکسید) و در برخی روغنها قابلحل میباشد (19). بسیاری از مدلهای انسانی و حیوانی مطالعه شده نشان دادهاند که کورکومین حتی در دوزهای بسیار زیاد کاملاً بیخطر است. زردچوبه از قرنها پیش برای درمان بیماریهایی نظیر بیماریهای کبدی، پوستی و ویروسی مورد استفاده بوده است. خواص آنتیاکسیدانتی، ضدسرطانی، ضدویروسی، ضدروماتیسمی و ضدالتهابی کورکومین را اثبات نمودهاند. همچنین اثرات حفاظتی این ترکیب بر ضد بیماریهای کبدی، پوستی و کلیوی اثباتشده است. کورکومین ازنظر ساختمان شیمیایی پلیفنول (diferuloylmethane) است. بدینجهت توان آنتیاکسیدانی بالایی دارد و در شرایط استرس اکسیداتیو اثر محافظتی خود را از طریق پراکسیداسیون لیپیدی و جمعآوری رادیکالهای آزاد اکسیژن و افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس ترانسفراز و درنتیجه گلوتاتیون داخل سلولی بر کبد اعمال میکند. بدین ترتیب از این گیاه بهعنوان محافظ کبدی نام برده میشود (2، 24).
به دلیل نقش مهم کبد در مسیرهای متابولیکی بدن، هرگونه اختلال در عملکرد کبد در گروه سندرم متابولیک (metabolic syndrome) دستهبندی میشود. سندرم متابولیک نیز با دارا بودن علائمی همچون مقاومت به انسولین و استروژن و سیتوکینهای التهابی افزایشیافته، افزایش تعداد و فعالیت سلولهای چربی همبستگی زیادی را با سندرم تخمدان پلیکیستیک نشان میدهد. گرچه مطالعات حیوانی در زمینهی این همبستگی اندک است اما جوامع مورد مطالعه در ژاپن و امریکا نشان از بروز علائم ﺳﻨﺪرم ﺗﺨﻤﺪان ﭘﻠﻲﻛﻴﺴﺘﻴﻚ (PCOS:Polycystic Ovary Syndrome) در زنان مبتلابه اختلالات متابولیکی و نیز تقلیل علائم متابولیکی و تولیدمثلی در این زنان توسط متفورمین به عنوان موثرترین و رایج ترین روش درمان دیابت نوع دو دارد. طیف وسیعی از اختلالات کبدی، سرطان کبد و از رده خارج شدن این بافت در هر دو سندرم قابل مشاهده است (23).
PCOS ﺷﺎﻳﻊﺗﺮﻳﻦ ﻋﻠﺖ ﻧﺎﺑﺎروری اﺳﺖ (20% ﻋﻠﻞ ﻧﺎﺑﺎروری زوﺟﻴﻦ). 6-8% زﻧﺎن ﺳﻨﻴﻦ ﺑﺎروری مبتلابه اﻳﻦ اﺧﺘﻼل اﻧﺪوﻛﺮﻳﻨﻲاﻧﺪ (4). افزایش مقاومت به انسولین در این سندرم نیز دیده شده است که خود انسولین باعث افزایش غیرطبیعی آندروژن میشود (12). مبتلایان علائمی نظیر اختلالات قاعدگی و عدم تخمکگذاری، دیابت، چاقی، فشارخون بالا، افزایش سطح پروتئین واکنشگر C (شاخص بیماریهای قلبی و التهابی)، افزایش اندروژن و هورمونهای مردانه (تستوسترون، آندروستندیون و دهیدرواپیآندرستندیون) را احساس کنند (9،11). زنان مبتلابه PCOS ویژگیهای مشابه زیادی را بهطور خاص با سندرم متابولیک ازجمله اختلال در محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تخمدان" هیپرانسولینمی" افزایش سیتوکینها و فاکتورهای مشتق از چربی و دیس لیپیدمی دارند. دیس لیپیدمی در PCOS با افزایش تریگلیسیریدها و کاهش لیپو پروتئین با چگالی بالا و کلسترول مشخص میشود. شاخص کلاسیک لیپوپروتئین آتروژنیک با افزایش تری گلیسیرید، کاهش سطح لیپوپروتئین با چگالی بالا و نسبت بالای لیپوپروتئین با چگالی پایین به لیپو پروتئین با چگالی بالا که مشخصه زنان مبتلابه PCOS چاق میباشد مشخص میشود (14).
با توجه به مصرف مداوم کورکومین بهعنوان چاشنی غذایی و نیز با تکیهبر خواص ضدالتهابی این محصول گیاهی، در این مطالعه تلاش شد اثرات حمایتی کورکومین بر بافت کبد رت که درجاتی از آسیب بافتی را تحت تأثیر علائم متابولیکی PCOS نشان داد مورد بررسی قرارگیرد. بنابراین در این تحقیق فرض بر این است که این ترکیب بتواند موجب بهبود عوارض کبدی علائم سندرم تخمدان پلیکیستیک گردد. هدف این تحقیق بررسی اثرات محافظتی کورکومین بر بافت کبد رتهای ویستار مبتلابه سندرم تخمدان پلیکیستیک میباشد.
مواد و روشها
دراین مطالعه 90 سر موش آزمایشگاهی بزرگ (رت) نژاد ویستار ماده با وزن20±170 گرم استفاده شد که در قفسهای مخصوص با فضای استاندارد و تحت شرایط محیطی مناسب و درجه حرارت مطلوب 24-20 درجه سانتیگراد و سیکل روشنایی و تاریکی 12 ساعته در مرکز تکثیر و پرورش حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه خوارزمی نگهداری شدند. رتهایی که دارای دو الی سه دوره استروس منظم در طی دوازده الی چهارده روز مشاهدهی اسمیر واژینال بوده و در مرحلهی استروس سیکل تولیدمثلی خود قرار دارند انتخاب شدند. رتهای در سه گروه دستهبندی شدند. گروه کنترل که هیچ مادهای دریافت نکرد، گروه PCOS که القای این سندرم در آنها بواسطهی تزریق تکمرحلهای زیرپوستی 2 میلیگرم استرادیول والرات که در روغن کنجد حلشده بود، به رتهای انتخاب شده با معیارهای مذکور صورت گرفت و گروه شم که به همان میزان روغن کنجد بهعنوان حلال استرادیول دریافت کردند. گروه کنترل، گروه شم و گروه PCOS به مدت 60 روز پس از تزریق روغن کنجد و استرادیول والرات تحت بررسیهای اسمیر واژینال قرارگرفتند (1). این کار در اوایل روز صورت گرفت و بهوسیله یک سوآپ پنبهای که با آب یا سالین مرطوب و نرم شده بهصورت دورانی از مخاط واژن رتها نمونهگیری شد و بر روی یک لام تمیز قرارگرفت و بعد از فیکس کردن، نمونه روی لام را به وسیله متیلن بلو رنگ شد تا نامنظم شدن سیکل استروس که یکی از علائم PCOS است، بررسی و مشاهده شود. علاوه بر این بهمنظور تأیید نهایی القای سندرم تخمدان پلیکیستیک، سه سر از رتها را کشته و تخمدانهای پلیکیستیک مشاهده شد. رویت کیستهای سفید در تخمدان آنها بهصورت ماکروسکوپی و همچنین بررسی مقاطع بافتی رنگآمیزی شده با هماتوکسیلین-ائوزین به صورت میکروسکوپی، مشاهداتی دال بر القای PCOS در این گروه بود. به دلیل عدم وجود تفاوت معنیدار در مشاهدات و دادههای مربوط به گروه شم، این گروه به قرینه گروه کنترل، حذف گردید. بدین ترتیب که از دادههای گروه شم صرفنظر شد و تنها دادههای مربوط به گروه کنترل لحاظ شد.
پس از بررسی تخمدانهای سه سر رت ازنظر مورفولوژی و حصول اطمینان از القاء سندرم پلیکیستیک، تعدادی از رتهای PCOS خود به دو گروه شم و تیمار شده با کورکومین تقسیم شدند. رتهای گروه شم، حلال کورکومین دی متیل سولفوکسید (DMSO) دریافت کردند. به رتهای گروه تیمارشده با کورکومین نیز با توجه به دوز مجاز کورکومین برای رت که 1000 تا 2000 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رت گزارش شده است، میزان 300 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن رتها کورکومین حلشده در DMSO به مدت 14 روز بهصورت داخل صفاقی تزریق شد (16). بنابراین گروههای مورد بررسی شامل گروه کنترل، گروه شم (DMSO)، گروه PCOS و گروه تیمار شده با دوز 300 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن کورکومین بودند. قسمت شکمی حیوان با الکل 70 درصد استریل شد و حیوان را سرپایین نگهداشته طوری که احشاء به سمت پایین باشد و سرنگ انسولین حاوی محلول کورکومین بهآرامی از بین کشاله ران و شکم وارد بدن رت شد. برای اطمینان از اینکه سوزن سرنگ انسولین وارد صفاق شده باشد ابتدا آسپیره کرده و در صورت عدم مشاهده مایع سبز یا زرد رنگ در سرنگ، تزریق انجام شد. پس از کشتن رتها در اثر استنشاق کلروفرم، با استفاده از سرنگ 5 سیسی خونگیری از قلب حیوانات انجام شد. سپس با استفاده از سانتریفیوژ 3 هزار دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سرم نمونههای خونی را جدا کرده و بهمنظور بررسی تغییرات میزان سرمی پروفایل چربی به روش آنزیمی کالریمتری کمی GPO-PAP /CHOD-PAP/endopoint و با استفاده از معرفهای تهیهشده توسط کمپانی زیستشیمی، تستوسترون و استرادیول به روش الایزا با استفاده از کیتCosmo Bio Co. Ltd. Japan کشور ژاپن و میزان CRP به روش الایزا با استفاده از کیت Millipore’s MILLIPLEX® MAP Rat/Mouse CRP Single Plex USA کشور امریکا در هر چهار گروه کنترل، شم، PCOS و تیمار شده با کورکومین آزمایش های سرولوژیک انجام شد.
همچنین بافت کبدی از هر چهار گروه برداشتشده و در فیکساتیو بوئن قرارداده شد تا مطالعه بافتشناختی آن جهت بررسی اختلالات کبدی ناشی از القای PCOS و همچنین بررسی اثرات درمانی کورکومین براین بافت صورت گیرد. جهت مقایسه بافت کبدی در چهار گروه تحت آزمایش و بررسی بروز نکروز کبدی در گروه بیمار و بهبود آن در گروههای تیمار شده با کورکومین از رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین استفاده شد.
جهت تجزیه و تحلیل آماری دادههای حاصل از آزمایشات سرولوژیک و دادههای حاصل از شمارش سلولی و مقایسه میانگینها از روش آنالیز واریانس یکطرفه (One-way ANOVA) و نرمافزار Instat3 و آزمون آماری توکی در سطح 0.05P< و3.567F> استفاده شد. تمامی آزمایشها با حداقل سه تکرار انجامشده و نمودارها از طریق نرمافزار EXCEL رسم شدند.
نتایج
سنجشتری گلیسیرید: میزان تری گلیسیرید سرم خون در گروه کنترل و شم تفاوت معنیداری نداشت و در محدوده طبیعی بود ولی در گروه PCOS میزان تریگلیسیرید نسبت به گروه کنترل و شم بالاتر بود و بررسیهای مورفولوژیک در هنگام باز کردن بدن رتها حاکی از وجود چربیهای شکمی در بدن بخصوص اطراف تخمدانها بود که خود تأییدی برافزایش کاملاً معنیدار سطح تریگلیسیرید خون در این گروه است. درواقع شیوع چاقی و دیس لیپیدمی در رتهای مبتلابه سندرم بیشتر از رتهای کنترل و شم میباشد ولی میزان تریگلیسیرید در گروه تیمار شده با کورکومین بصورت معنیداری نسبت به گروه PCOS کاهش یافت (شکل 1).
سنجش HDL: بررسی میزان HDL در سرم خون گروههای کنترل، شم، PCOS و تیمار شده با کورکومین نشان داد لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL) در گروه PCOS نسبت به گروه کنترل و شم کاهش چشمگیری داشت در حالیکه میزان این فاکتور لیپوپروتئینی در سرم خون گروه تیمار شده با دوز 300 میلیگرم بر کیلوگرم کورکومین نسبت به گروه PCOS تقریباً حالت طبیعی و نزدیک به سطح آن در گروه کنترل و شم بود (شکل2).
سنجش LDL: میزان LDL نتایجی مشابه با تغییرات تریگلیسیرید نشان داد، بدین معنا که در گروه PCOS میزان سرمی LDL نسبت به گروه کنترل و شم افزایش ولی با تیمار رتهای مبتلابه سندرم با کورکومین میزان این فاکتور کاهش معنیداری نسبت به گروه PCOS یافت (شکل 3).
شکل1- تغییرات میزان تری گلیسیرید در گروههای کنترل، شم، PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلیگرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشاندهندهی تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم میباشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه PCOS است. (n=10, میانگین ± انحراف معیار)، 0.05P< *،0.001P<***
شکل2- تغییرات میزان HDL در گروههای کنترل، شم، PCOS و رتهای PCOS تیمار شده با 300 میلیگرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشاندهندهی تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم میباشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه PCOS است. (n=10 میانگین ± انحراف معیار)، 0.05 P<*0.01P<**
شکل3- تغییرات میزان LDL در گروههای کنترل، شم، PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلیگرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشاندهندهی تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم میباشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه PCOS است. (,n=10 میانگین ± انحراف معیار) 0.01P<**
شکل4- تغییرات میزان کلسترول تام در گروههای کنترل، شم، PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلیگرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. علامت ستاره (*) روی گروه PCOS نشاندهندهی تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه کنترل و شم میباشد و علامت بعلاوه (+) روی گروه رت هایPCOS تیمار شده با کورکومین نشانگر تغییرات معنیدار این گروه نسبت به گروه PCOS است. (,n=10 میانگین ± انحراف معیار)، 0.01P<***0.001P<**
سنجش سطح سرمی CRP، استرادیول و تستسترون: افزایش معنیداری در سطح سرمی هورمونهای استرادیول و تستوسترون و نیز فاکتور التهابی CRP در گروه PCOS نسبت به گروه کنترل و شم مشاهده شد. این افزایش بواسطه تیمار حیوانات با کورکومین به سطح طبیعی در نمونههای کنترل و شم تقلیل یافت و این کاهش نسبت به گروه PCOS معنیدار بود (جدول 1).
رنگآمیزی هماتوکسیلین- ائوزین: در نمونههای کنترل هپاتوسیتهای کبدی، لوبولهای کبدی و همچنین فضای 3 گانه پورت همگی طبیعی بودند (شکل a-5 و a-6). این در حالی بود که در نمونههای مربوط به رتهای دچار این سندرم، نکروزبافتی و پرخونی مشاهده شد (شکل b-5 وb-6) و در نمونههای تیمار شده با دوز300 میلیگرم بر کیلوگرم پورتها نکروزبافتی و قطعهقطعه شدن و مچاله شدن هسته مشاهده نشد.
جدول 1- مقایسه تعداد هپاتوسیت های آسیبدیده و سلولهای کوپفر و سطح سرمی CRP، استرادیول و تستسترون در گروههای کنترل، شم، PCOS و رت های PCOS تیمار شده با 300 میلیگرم کورکومین به ازای هر کیلوگرم وزن بدن حیوان. (05/0< P *، 01/0<P**، 001/0<P***).
PCOS تیمارشده با کورکومین نسبت به PCOS |
PCOS نسبت به کنترل |
PCOSتیمارشده با کورکومین |
PCOS |
شم |
کنترل |
گروهها/ سلولها |
++ |
*** |
71 |
90 |
26 |
24 |
هپاتوسیتهای آسیبدیده |
+ |
*** |
24 |
34 |
15 |
16 |
کوپفر |
+++ |
*** |
04/0±086/0 |
05/0±325/0 |
01/0±180/0 |
01/0±175/0 |
CRP(ng/ml) |
+++ |
*** |
01/0±32/0 |
05/0±63/0 |
05/0±30/0 |
01/0±27/0 |
E2(ng/ml) |
+++ |
*** |
02/0±82/0 |
3/0±41/1 |
06/0±71/0 |
03/0±73/0 |
T(ng/ml) |
یکدست بودن طنابهای هپاتوسیت و مشخص بودن مرزهای سلولی مشاهده شد (شکل c-5 و c-6). در کل میتوان نتیجه گرفت که دوز 300 اثرات مفیدی را از نظر بافتشناسی بر روی بافتهای کبدی حاصل از رت های دچار سندرم اعمال کرد.
شکل5- فوتومیکروگراف حاصل از رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین کبد رت سالم (a)، کبد رت PCOS (b) و کبد رتهای PCOS تیمار شده با دوز300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن حیوان کورکومین (c) a: کبد سالم که در آن هپاتوسیت های کبدی، لوبول های کبدی و همچنین پورتهای کبدی (پیکانها) طبیعی هستند. b: کبد نمونه PCOS که در آن ساختار پورت بههمریخته (پیکانها)، نکروز بافتی (بدشکل شدن سلولهای کبدی بهصورت از بین رفتن حدود سیتوپلاسمی سلولهای کبدی و تغییر در هسته سلولها در محدودهای که با دایره سیاه نمایش دادهشده است) مشاهده میشود. c: در نمونههای تیمار شده با دوز 300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن حیوان کورکومین، فضای پورتها طبیعی به نظر میرسد (a,b,c x200).
شکل6- فوتو میکروگراف حاصل از رنگآمیزی هماتوکسیلین و ائوزین کبد رت سالم (a)، کبد رت PCOS (b) و کبد رتهای PCOS تیمار شده با دوز300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن حیوان کورکومین (c). تغییر در تمامیت هپاتوسیتها، نکروز بافتی و قطعهقطعه شدن و مچاله شدن هسته، منظم بودن طنابهای هپاتوسیت و مشخص بودن مرزهای سلولی (پیکان) در گروههای موردبررسی مقایسه شده است (a,b,c x100).
شمارش سلولی: میانگین تعداد هپاتوسیتهای آسیبدیده (دارای هسته پیکنوزه و سیتوپلاسم آسیبدیده) در سطحی برابر با 1000 میکرومترمربع در گروه کنترل 24 عدد شمارش گردید درحالیکه با القاء سندرم به 90 عدد رسید که این افزایش ازنظر آماری نسبت به گروه کنترل و شم معنیدار بود (0.001P<). درحالیکه کاربرد دوز300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن از این ترکیب منجر به کاهش تعداد سلولهای آسیبدیده تا 71 عدد شد. میانگین تعداد سلولهای کوپفر در گروه کنترل 16 عدد شمارش گردید درحالیکه با القاء سندرم پلیکیستیک به 34 عدد رسید که این افزایش ازنظر آماری نسبت به گروه کنترل و شم معنیدار بود (0.001P<). درحالیکه کاربرد دوز300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن از این ترکیب منجر به کاهش تعداد سلولهای آسیبدیده و کوپفر شد که نسبت به گروه PCOS به ترتیب با (0.01P<) و (0.05P<) معنیدار بود (جدول 1).
سندرم تخمدان پلیکیستیک بهعنوان یک اختلال پیچیده هورمونی و متابولیکی، بافت کبد را نیز درگیر میکند (24). از تظاهرات بالینی مبتلایان به سندرم تخمدان پلیکیستیک، بیماریهای کبدی شامل بروز نکروز، فیبروز و در مراحل پیشرفته بیماری بروز سیروز کبدی میباشد (7). این سندرم در صورت عدم تشخیص زودرس و درمان مناسب، به دلیل تخریب پیشرونده سلولهای کبدی میتواند منجر به بیماری پیشرفته و غیرقابل برگشتی به نام «سیروز کبدی» شود. بهعبارتیدیگر بیماری کبد چرب شامل طیفی از اختلالات کبدی است که از تجمع چربی در سلولهای کبدی آغاز شده و به التهاب، تخریب سلول کبدی و در نهایت بیماری مزمن و غیرقابلبرگشت سیروز کبدی منتهی میشود (2). در این بررسی بهمنظور القای سندرم تخمدان پلیکیستیک از روش تزریق زیرپوستی استرادیول ولرات استفاده شد. در مطالعه همدن (2009) از این هورمون به منظور ترمیم اختلالات کبدی در رتهای نر در سنین بالا (12-18ماهه) استفاده شده است ولی با توجه به تحقیق براور (1978) که توانست این روش را بنیان گذارد استرادیول که در ابتدای بلوغ رتهای جنس ماده ویستار (هشت هفتگی) و در مرحله استروس از سیکل استروس تزریق میشود، اثر متفاوتی نسبت به اثر آن در تحقیق همدن (2009) داشته و میتواند منجر به ایجاد چهره التهابی PCOS گردد (22، 6). چراکه در جنس ماده محور هیپوتالاموسی- هیپوفیزی-تخمدانی نقش مهمی را در تکوین تخمدان و سیستم هورمونی و متابولیکی دارد. استنر و ویکتورین (2004) اثبات کرد که تزریق استرادیول ولرات در رتهای مادهای که در سنین ابتدایی بلوغ هستند، سبب افزایش فعالیت هستههای قوسی هیپوتالاموس رتهای ماده میشود. متعاقباً نورونهای سمپاتیکی در تخمدان افزایش فعالیت نشان داده و تولید فاکتور رشد عصبی (Nerve growthfactor: NGF) را بالا میبرند. سطح بالای این فاکتور در ایجاد التهاب سیستمیک و اختلالات اتوایمن دخیل است (5). ازاینرو در این مطالعه از میان روشهای دیگر القای سندرم، از روش استرادیول ولرات هم به دلیل قرابت سندرم القا شده با مدل انسانی و هم به دلیل ایجاد وضعیت التهابی این سندرم در رت، استفاده شد.
سندرم تخمدان پلیکیستیک اغلب با انواع الگوهای دیس لیپیدمی از جمله کاهش کلسترول لیپوپروتئین با چگالی بالا (HDL-C)، سطح بالای تریگلیسیرید (TG)، کلسترول کل (TC) و کلسترول لیپوپروتئین با چگالی کم (LDL-C) مرتبط است (7). در این تحقیق هم پس از القاء PCOS نتایجی همسو با مطالعه فوق به دست آمد. سطح تریگلیسیرید، کلسترول، LDL و HDL در هر چهار گروه کنترل، شم، سندرم پلیکیستیک و تیمار شده با کورکومین بررسی شد. میزان تریگلیسیرید و LDL در نمونههای بیمار نسبت به کنترل افزایش و در نمونههای تیمار شده با کورکومین کاهش را نشان داد. برعکس میزان کلسترول و HDL در نمونههای بیمار نسبت به کنترل کاهش یافت که در نمونههای تیمار شده با کورکومین افزایش را نشان داد. بدین ترتیب میتوان نتیجه گرفت که کورکومین میتواند در تعدیل دیس لیپیدمی بهعنوان یکی از علائم التهابی حاصل از PCOS در این بررسی نیز مؤثر بوده باشد. از علائم التهابی بررسیشده در این تحقیق پروتئین واکنشگر C است. این پروتئین که توسط آدیپوسیتهای کبد ترشح میشود در طی التهاب میزان تا 50 هزار برابر بهواسطهی افزایش غلظت پلاسمایی اینترکولین 6 بالا میرود. با کاهش میزان سرمی این فاکتور در نمونههای تیمار شده با کورکومین در این بررسی میتوان دریافت که احتمالاً کورکومین فعالیتهای محافظتی خود را بر بافت کبد از طریق کاهش شاخصهای مهم التهابی اثر میدهد. چنانچه جورنکا در مطالعات خود در سال 2009 هم ادعا کرد که کورکومین از طریق مسیر NF-ƘB که مهمترین مسیر سیگنالینگ در التهاب سیستمیک محسوب میشود، میتوانند دیگر اثرات خود را (آنتیاکسیدانی و ضد سرطانزایی و...) اعمال نماید. NF-ƘB بهوضوح یکی از مهمترین تنظیمکنندههای بیان ژن پیش التهابی است و سنتز سایتوکاینهایی مانند TNF-α , IL-1β , IL-6 ,IL-8 را میانجیگری میکند (15، 14). از سوی دیگر تعیین و مقایسه سطح سرمی استرادیول و تستوسترون میتواند میزان عملکرد بافت کبد را نمایان سازد. SHBG (Sex Hormone Binding Globulin) پروتئین حامل تستوسترون و استرادیول است که از کبد تولید میشود و میزان آن با میزان استرادیول و تستوسترون که توسط بافت تخمدان تولید میگردند، تنظیم میشود و میزان آن در مبتلایان به PCOS کاهش مییابد. علیرغم اینکه در این بررسی میزان SHBG اندازهگیری نشد ولی با تکیه بر بررسی Hamden، میتوان گفت در این سندرم احتمالاً افزایش میزان استرادیول و تستوسترون که در تخمدان تولید میگردند، شواهدی دال بر کاهش SHBG میباشد (13). بعلاوه باتاایل در تحقیق در سال 2005 خود نشان داد که کاهش SHBG با تغییرات پروفایل لیپیدی مرتبط است (8). بدین ترتیب اختلالی که در کبد رخداده است وابستگی نزدیکی با وضعیت بافتی تخمدان پلیکیستیک دارد و تحت تأثیر محصولات هورمونی محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- تخمدان است. بدین معنا که افزایش میزان CRP و کاهش میزان SHBG و متعاقباً تغییرات پروفایل لیپیدی در گروه PCOS در این تحقیق نسبت به دیگر اختلالات کبدی که مستقل از این محور به وجود میآیند، متفاوت است و نیازمند راهکارهایی است که با تأثیر بر منشأ این تغییرات (تخمدان)، وضعیت التهابی و بافتی کبد را به سمت حالت طبیعی سوق داده و بهبود بخشیده است. با توجه به کاهش میزان تستوسترون در این بررسی در گروههای تیمار شده با کورکومین میتوان بیان داشت با نظر به تحقیق تسویی در سال 2008 مبنی بر احتمال کاهش سطح تستوسترون در گروههای تیمار شده با کورکومین به دلیل اعمال اثرات این ماده در طول مدت 14 روز بوده است (4).
مطالعه ترکیبات با منشأ گیاهی شاخهای بسیار جالب در علوم پزشکی میباشد. بسیاری از این ترکیبات دارای اثرات پیشگیریکننده بوده و میتوانند در برخی جوامع با احتمال زیاد در مهار بیماریهای خاص مورد استفاده قرارگیرند (18). زردچوبه از قرنها پیش برای درمان بیماریهایی نظیر بیماریهای کبدی، پوستی و ویروسی مورد استفاده بوده است. در طب سنتی از زردچوبه بهعنوان گیاه محافظ کبدی نامبرده شده است. اثرات حفاظتی این ترکیب بر ضد بیماریهای کبدی، پوستی و کلیوی اثباتشده است (21). در عصر حاضر با توجه به اثرات درمانی و تأثیرات قابلتوجه گیاهان دارویی نسبت به داروهای شیمیایی بررسی اثر این گیاهان در دستور کار محققین قرارگرفته است (20).
مروتی و همکاران در سال 2013 نشان دادند که کورکومین تغییرات بافت کبدی موش که در اثر آدرنالکتومی ایجاد شده بود را کاهش میدهد. در موشهای آدرنالکتومی تیمار شده با کورکومین میزان سلولهای تغییر شکل یافته که دارای هسته پیکنوزه و سیتوپلاسم چروکیده هستند، بهطور معنیداری کاهش مییابد. همچنین تعداد سلولهای کوپفر کبدی که پس از برداشت غده آدرنال افزایشیافته بودند با مصرف کورکومین به میزان قابلتوجهی کاهش یافت (12). فرزانگی و همکاران در سال 2013 نشان دادند که در موشهایی که در معرض مسمومیت با سرب قرارگرفتهاند، تمرینات ورزشی و مصرف مکمل کورکومین منجر به کاهش آسیب بافت کبدی در این حیوانات میشود (10). در راستای بررسی این دو محقق، در مطالعه حاضر، پرخونی سینوزوئیدهای کبدی در گروه PCOS مشاهده شد، سلولهای التهابی (کوپفر) در اطراف ورید مرکزی افزایشیافتهاند و همچنین سلولهای لنفوئیدی به داخل فضای پورت نفوذ یافتهاند. با شمارش سلولهای کوپفر مشاهده شد که تعداد این سلولها در پاسخ به آسیب بافتی، در گروه بیمار مقایسه با گروه کنترل افزایشیافته است. از طرف دیگر بدشکل شدن سلولهای کبدی بهصورت از بین رفتن حدود سیتوپلاسمی سلولهای کبدی و تغییر در هسته سلولها نظیر (لیزشدگی، قطعهقطعه شدن و مچاله شدن هسته) در مقایسه با گروه کنترل نیز افزایش پیداکرده بود. همچنین تعداد سلولهایی که دچار بدشکلی شده بودند نسبت به گروه کنترل افزایشیافته بود. در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که تزریق روزانه کورکومین به میزان 300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 14 روز دارای اثرات درمانی بر بافت کبد بوده است. بهگونهای که تعداد سلولهای تغییر شکل یافته و همچنین تعداد سلولهای کوپفر در بافت کبد رتهای دچار سندرم تخمدان پلیکیستیک پس از تزریق کورکومین بهطور معنیداری از لحاظ آماری نسبت به گروه بیمار کاهش پیدا کرد. بررسی حاضر همچنین نشان داد که افزایش معنیداری که در تعداد سلولهای کوپفر گروه PCOS مشاهده شد، در تیمار با کورکومین کاهش یافت. بهبیاندیگر رتهای تیمار شده با 300 کورکومین کاهش معنیداری نسبت به گروه PCOS از خود نشان دادند. همچنین میزان پرخونی سینوزوئیدها نیز کمتر از گروه PCOS شد. بنابراین نتایج این بررسی مؤکد بررسیهای مروتی و فرزانگی و همکاران بوده است.
اثرات درمانی کورکومین بر کبد در چند مسیر دیگر نیز به اثبات رسیده است. مطالعات گستردهای که در ارتباط با نقش کورکومین در مهار سرطان انجامشده است و نشان دادهاند که این ترکیب مهارکننده مراحل مختلف شبکه رونویسی بوده و بدین ترتیب از تکثیر سلولی جلوگیری میکند (3).
ترکیبات موجود در زردچوبه مثل کورکومین باعث حذف رادیکال های آزاد اکسیژن و افزایش غلظت گلوتاتیون بهعنوان یک ترکیب مقابله کننده با افزایش تولید رادیکال های آزاد اکسیژن و نیز تغییرات شیمیایی اکسیداتیو لیپیدها، اسیدهای نوکلئوئیک و پروتئینها میشود. کورکومین فعالیتهای آنتیاکسیدانی را به شیوه مستقیم و غیرمستقیم توسط مهار اکسیژن واکنشی و القاء پاسخ آنتیاکسیدانی انجام میدهد (17). بر پایه این اطلاعات احتمال میرود کورکومین بهعنوان یک ترکیب آنتیاکسیدان قوی، احتمالاً توانسته است علائم دیس لیپیدمی و التهاب PCOS را کاهش دهد و بازسازی سلولهای آسیبدیده کبدی را موجب شود.
در مطالعه حاضر نتایج نشان داد که تزریق روزانه کورکومین به میزان 300 میلیگرم بر کیلوگرم وزن بدن به مدت 14 روز دارای اثرات درمانی بر بافت کبد بوده است. بهگونهای که تعداد سلولهای بدشکل شده و همچنین تعداد سلولهای کوپفر و میزان پرخونی سینوزوئیدها در بافت کبد و همچنین سطح سرمی شاخص التهاب (CRP) در رتهای دچار سندرم تخمدان پلیکیستیک پس از تزریق کورکومین بهطور معنیداری از لحاظ آماری نسبت به گروه PCOS کاهش پیدا کرد و بهبود عوارض کبدی ناشی از بیماری سندرم تخمدان پلیکیستیک مشاهده شد.
10. Farzanegi, P., Habibian, M., and Salehi, M., 2013. Interactive effect of endurance training and Curcumin supplementation on some indices of liver damage in rats exposed to heavy metal lead. Daneshvar (medicine) shahed University, 20 (102), PP :63-70
11. Ghafurniyan, H., Nabiuni, M., and Karimzadeh, L., 2014. The Effect of Green Tea on IL-6 and CRP level in Model of Polycystic Ovary Syndrome as an Inflammation State. International, Journal of Cellular & Molecular Biotechnology, PP: 1-12.
12. Gonzalez, F., Minium, J., Kirwan, J., 2006. Increased Activation of Nuclear Factor Triggers Inflammation and Insulin Resistance in Polycystic Ovary Syndrome, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 91(4), PP: 1508-1512.
13. Hamden, K., Carreau, S., Ayadi, F., Masmoudi, H., and Feki, A.E., 2009. Inhibitory effect of estrogens, phytoestrogens, and caloric restriction on oxidative stress and hepato-toxicity in aged rats. Biomedical and Environmental Sciences, 22(5), PP: 381-7.
14. Jurenka, J.S., 2009. Anti-infammatory Properties of Curcumin, a Major Constituent of Curcuma longa: A Review of Preclinical and Clinical Research. Alternative Medicine Review, 14(2), PP: 141-153.
15. Karimzadeh, L., Nabiuni, M., Mohseni Kouchesfehani, H., Adham, H., Bagheri, A., and Sheikholeslami, A., 2013. Effect of bee venom on IL-6, COX-2 and VEGF levels in polycystic ovarian syndrome induced in Wistar rats by estradiol valerate, Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 19, 32 p.
16. Kohli, K., Ali, J., Ansari, M.J., and Raheman, Z., 2005. Curcumin: A natural antiinflammatory agent. Indian journal of pharmacology, 37 (3), PP: 141-147.
17. Liu, K.E., Tataryn, I.V., and Sagle, M., 2006. Use of metformin for ovulation induction inwomen who have polycystic ovary syndrome with or without evidence of insulin resistance. Gynaecology, 150, PP: 495-599.
18. Madani, H., Asgari, S., Naderi, G.H.A., and Taleb Al Hosseinni, M., 2006. Hepatoprotective effects of silybum marianum and callendula officinalis polyphenolic extracts in rat. Iranian journal of biology, 19(2), PP: 157-163.
19. Morovvati, H., Najafzadeh, H., and Azizian, H., 2013. Evaluation of effect of curcumin on changes of liver in adrenalectomised rats. Journal of Babol University of Medical Science, 15(3), PP: 59-64.
20. Nasimi, M., Heydari, Nasrabad, M., and Shiravi, A., 2012. The effects of an alchoholic extract of Physalis alkekengi fruit on reproduction and fetus in wistar rats. Iranian journal of biology, 25(2), PP: 276-285.
21. Stener-Victorin, E., and Lindholm, C., 2004. Immunity and b-Endorphin Concentrations in Hypothalamus and Plasma in Rats with Steroid-Induced Polycystic Ovaries. Biology of reproduction, 70, PP: 329–333.
22. Swetha, R., Ravi, B.V., and Nalini, K.S., 2015. Study of Serum Lipoprotein (a) and Lipid Profile in Polycystic Ovarian Syndrome. Journal of Clinical Science Research, 4, PP: 2-6.
23. Tohda, C., Nakayama, N., Hatanaka, F., and Komatsu, K., 2006. Comparison of anti-inflammatory activities of six curcuma rhizomes: A possible curcuminoid-independent pathway mediated by Curcuma phaeocaulis extract. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 3, PP: 255-260.
24. Tsui, K.H., Feng, T.H., Lin, C.M., Chang, P.L., and Juang, H.H., 2008. Curcumin blocks the activation of androgen and interlukin-6 on prostate-specific antigen expression in human prostatic carcinoma cells, Journal of andrology, 29(6), PP: 661-8.