خط‌شناسه گذاری DNA و بررسی تنوع گونه ای کرم های کم تار رودخانه جاجرود

نوع مقاله : مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم‌ها، پژوهشکده علوم محیطی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

2 گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم،پژوهشکده علوم محیطی دانشگاه شهید بهشتی،تهران،ایران

3 گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم، پژوهشکده علوم محیطی، دانشگاه شهید بهشتی،تهران، ایران

چکیده

کم‌تاران به طور کلی به عنوان یک گروه شناخته‌شده از بی‌مهرگان خاک با پراکنش جهانی، از دو نقطه نظر زیست‌محیطی و تاکسونومیکی مورد توجه قرار گرفته‌اند. در این پژوهش تنوع‌گونه‌ای کرم‌های کم‌تار از هفت ایستگاه رودخانه‌‌ی جاجرود در فصول پاییز و زمستان مورد بررسی قرار گرفت. نمونه‌ها با استفاده از روش ضربه و با کمک الک با چشمی ریزصید (500 میکرون) جمع‌آوری شدند. امروزه استفاده از روش‌های نوین از جمله نشانگر‌های ژنتیکی، شناخت دقیق‌تری از گونه‌ها ارائه می‌دهند. به منظور ارزیابی تنوع و شناسایی گونه‌ها، از روش مولکولی خط-شناسه گذاری DNA توسط ناحیه ژن میتوکندریایی سیتوکروم c اکسیداز زیرواحد یک (COI) و کلیدهای شناسایی مرفولوژیک استفاده شد. در طی مطالعه، پنج گونه از خانواده‌ی Lumbricidae و Naididae مربوط به سه جنس Eiseniella، Eisenia و Tubifex شناسایی شد. نمونه‌های شناسایی‌شده عبارتند از Tubifex tubifex،Tubifex sp.، Eiseniella tetraedra، Eisenia fetida و Eisenia sp.. نتایج نشان داد گونه‌ E. tetraedra فراوان‌ترین گونه است که چهار دودمان مجزا را شامل می‌شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

DNA Barcoding and species diversity of Oligochaeta in Jajrood River

نویسندگان [English]

  • Zarangis Nahavandi 1
  • Asghar abdoli 2
  • Faraham Ahmadzadeh 1
  • Mohammad Javidkar 3

1 Department of Biodiversity and Ecosystem Management,Enviromental Sciences Research Institute ,Shahid Beheshti University,Tehran,Iran

2 Department of Biodiversity and Ecosystem Management,Environmental sciences Research Institute,Shahid Beheshti University,G.C., Tehran,Iran

3 Department of Biodiversity and Ecosystem Management,Environmental Sciences Research Institute , Shahid Beheshti University, G.C., Tehran, Iran

چکیده [English]

Generally, oligochaetes as a well-known group of earthworm invertebrates with global distribution have been considered from two Ecological and taxonomical point of view. Species diversity of oligochaetes was investigated in Jajrood River, Caspian Southern basin, Iran. This research began in autumn and winter and specimens were collected from 7 collecting stations using a kick sampling approach across the river. Today, the use of modern methods, including genetic markers, provides a more accurate understanding of the species To evaluate the diversity and facilitate identification of the oligochaete species, both DNA barcoding, using the mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit I (COI), and morphological identification keys were utilized. As a result, five species including Tubifex tubifex, Tubifex sp., Eiseniella tetraedra, Eisenia fetida, and Eisenia sp. belonging to the families Lumbricidae and Naididae were identified. The results showed E. tetraedra to be the most abundant species, which consists of four divergent lineages in this river system.

کلیدواژه‌ها [English]

  • DNA barcoding
  • Species diversity
  • Oligochaeta
  • Jajrood River

خط­شناسه گذاری DNA و بررسی تنوع­گونه­ای کرم­های کم­تار رودخانه جاجرود

زرانگیس نهاوندی، اصغر عبدلی*، فراهم احمدزاده و محمد جاویدکار

ایران، تهران، دانشگاه شهید بهشتی، پژوهشکده علوم محیطی، گروه تنوع زیستی و مدیریت اکوسیستم­ها

تاریخ دریافت: 14/5/1398            تاریخ پذیرش: 10/6/1399

چکیده

کم­تاران به طورکلی به عنوان یک گروه شناخته‌شده از بی­مهرگان خاک با پراکنش جهانی، از دو نقطه نظر زیست‌محیطی و تاکسونومیکی مورد توجه قرار­گرفته­اند. دراین پژوهش تنوع­گونه­ای کرم­های کم­تار از هفت ایستگاه رودخانه­ی جاجرود در فصول پاییز و زمستان مورد بررسی قرارگرفت. نمونه­ها با استفاده از روش ضربه و با کمک الک با چشمی ریزصید (۵۰۰ میکرون) جمع‌آوری شدند. امروزه استفاده از روش­های نوین از جمله نشانگر­های ژنتیکی، شناخت دقیق­تری از گونه­ها ارائه می­دهند. به منظور ارزیابی تنوع و شناسایی گونه­ها، از روش مولکولی خط­شناسه گذاری DNA توسط ناحیه ژن میتوکندریایی سیتوکروم c اکسیداز زیرواحد یک (COI) و کلیدهای شناسایی مرفولوژیک استفاده شد. در طی مطالعه، پنج گونه از خانواده­ی Lumbricidae و Naididae مربوط به سه جنس Eiseniella، Eisenia و Tubifex شناسایی شد. نمونه­های شناسایی‌شده عبارتند از Tubifex tubifex،Tubifex sp.،Eiseniella tetraedra، Eisenia fetida و Eisenia sp.. نتایج نشان داد گونه
E. tetraedra فراوان‌ترین گونه است که چهار دودمان مجزا را شامل می­شود.

واژه­های کلیدی: خط­شناسه گذاری DNA، تنوع­گونه­ای، کم­تاران، رودخانه جاجرود

* نویسنده مسئول، تلفن: 09123977258، پست الکترونیکی: A_Abdoli@sbu.ac.ir

مقدمه

 

در مناطق خشک و نیمه‌خشک ایران، رودخانه­های آب شیرین از مهم­ترین اکوسیستم­های آبی هستند که از نظر تنوع زیستی و تأمین آب آشامیدنی مورد توجه قرارگرفته‍اند (۲ و ۲1). رودخانه­ی جاجرود یکی از رودخانه­های مهم حوضه­های آب شیرین کشور است که به علت وجود پارک­های ملی سرخه­حصار و خجیر در داخل منطقه حفاظت‌شده‌ی جاجرود از اهمیت ویژه­ای برخوردار است (3). این رودخانه با دارا بودن شیب زیاد، بستر سنگلاخی و انجام عمل خودپالایی کامل، اکوسیستمی مناسب برای موجودات آبزی (4) و یکی از منابع تأمین‌کننده‌ی بخش عمده­ی آب شرب شهر تهران محسوب می­شود که انواع متنوعی از آبزیان با ارزش را در خود جای داده است (۱). اغلب فراوان­ترین کفزیان با توزیع جهانی در اکوسیستم­های آب شیرین، کم­تاران (Oligochaeta) هستند (۱4). چندین خانواده از کرم­های کم­تار موجود است که ساکن محیط­های دریایی و یا آب شیرین هستند. کرم­های آب شیرین در طیف وسیعی از زیستگاه­ها مانند چشمه­ها، آب­های زیرزمینی، رودخانه­ها، خورها، استخرهای کوچک موقتی تا اعماق زیاد دریاچه­های بزرگ زندگی می­کنند (38). آن­ها در ساختار رسوبات اکوسیستم آب شیرین و در چرخه­ی غذایی نقش مهمی ایفا می­کنند و انواع مختلف موجودات مانند باکتری­ها، قارچ­ها، گیاهان و حیوانات دیگر را در این چرخه به هم متصل می­کنند (36). فعالیت آن‌ها، افزایش معدنی کردن مواد آلی، فعالیت میکروبی و هوادهی رسوبات را به دنبال دارد (۳2). همچنین جذب اکسیژن و نیترات‌زدایی به هنگام فراوانی بالای این موجودات، افزایش می­یابد (۴2) و درنهایت نقش مهمی در حفظ کیفیت و حاصلخیزی خاک ایفا می‌کنند (۵0). بعضی از کفزیان برای ارزیابی کیفیت اکوسیستم­های آبی کاربرد دارند که کم­تاران آبزی به‌عنوان شاخص­های زیستی بسیار عالی از تغییرات محیطی محسوب می­شوند (10).

تقریباً ۱۱۰۰ گونه از گونه­های شناخته‌شده زیررده­ی کم­تاران (بیش از ۵۰۰۰ گونه)، در آب­های شیرین زندگی می­کنند (۳0) که تاکنون تنها ۲۶ گونه­ی آبزی در آب‌های داخلی ایران فقط براساس ریخت­شناختی ثبت شده‌اند (5،21،22،38). باتوجه به ویژگی­های جغرافیای کشور ایران مانند بزرگی منطقه، مناطق کوهستانی و همچنین ویژگی­های منحصربه‌فرد شبکه هیدرولوژیکی، به ‌احتمال زیاد گونه­های بسیاری از ایران هنوز گزارش نشده‌اند (۲2).

امروزه خط­شناسه گذاری DNA به‌عنوان یک روش مولکولی جهت شناسایی گونه­ها و ارزیابی تنوع زیستی به کار برده می­شود و توانسته تا حدودی مشکلات تاکسونومی کلاسیک را برطرف کند (16 و 44). هدف از این مطالعه بررسی تنوع گونه‌ای و ژنتیکی کم­تاران رودخانه­ی جاجرود بااستفاده از روش خط شناسه گذاری DNA است.

مواد و روشها

نمونه­برداری در فصل­های پاییز (آبان ماه) و زمستان (اسفند ­ماه) در هفت ایستگاه از حاشیه تا وسط بستر رودخانه­ی جاجرود انجام شد (شکل۱). نوع بستر در ایستگاه­ها به طور غالب قلوه‌سنگی و عمق نمونه­برداری بسته به رودخانه و ایستگاه از حدود 30 تا 100 سانتیمتر متفاوت بود. مختصات جغرافیایی ایستگاه­های نمونه­برداری به وسیله­ی GPS (Garmin eTrex Legend) ثبت شد (جدول۱).

 

شکل ۱- نقشه­ ایستگاه‌های مورد مطالعه در رودخانه جاجرود با استفاده از نرم­افزار ArcGIS

(عبارتند از آبنیک، آبنیک پایین، شمشک، فشم، آهار، حاجی‌آباد، سعیدآباد)

 

جدول ۱- مشخصات ایستگاه­های نمونه‌برداری از رودخانه جاجرود

ارتفاع (m)

طول جغرافیایی

عرض جغرافیایی

کد ایستگاه

نام ایستگاه

2404

697/37 °51 شرقی

'197/59 °35 شمالی

J1

آبنیک (ABN)

2175

763/34 °51 شرقی

'573/57 °35 شمالی

J2

آبنیک پایین (ABL)

1970

542/31 °51 شرقی

'681/55 °35 شمالی

J3

شمشک (SHM)

1963

563/31 °51 شرقی

'675/55 °35 شمالی

J4

فشم (FSH)

2097

808/27 °51 شرقی

'039/56 °35 شمالی

J5

آهار (AHR)

1839

163/32 °51 شرقی

'511/52 °35 شمالی

J6

حاجی­آباد (HAJ)

1433

''52 '41 °51 شرقی

''5/40 '43 °35 شمالی

J7

سعید آباد-نزدیک ورودی پارک ملی خجیر (SAI)

 

نمونه­ها با استفاده از روش ضربه و با کمک الک با چشمی ریزصید (۵۰۰ میکرون) جمع‌آوری و در لوله­های حاوی الکل ۹۶% قرار داده شدند. الکل هر نمونه جهت ماندگاری و کیفیت بهتر نمونه، ۳ تا ۴ بار در طول روز اول با همان درصد الکل تعویض شد. سپس، نمونه­ها به آزمایشگاه مولکولی دانشگاه شهید بهشتی منتقل و در دمای °20- سانتی‌گراد نگهداری شدند.

استخراج DNA و واکنش زنجیره­ای پلی­مراز (PCR): نمونه­ها براساس کلیدهای شناسایی برینکهرست (1986، 1971)، پیندر (2010) و جابلونسکا و پسیک (2014) شناخته و کدگذاری شدند (12،13،25،37). این مرحله قبل از انجام استخراج در آزمایشگاه تنوع زیستی با استریومیکروسکوپ با بزرگنمایی ۵ (شرکت
Nisho Optical، ژاپن ) انجام شد.

برش کوچکی از قسمت انتهایی بدن نمونه‌ها تهیه و از پروتکل Gentra (شرکت Qiagen، امریکا) برای استخراج DNA استفاده شد (۴1). در این مطالعه از ژن میتوکندریایی سیتوکروم c اکسیداز زیرواحد یک (COI) استفاده شد. واکنش­های زنجیره­ای پلی­مراز مطابق با جدول ۲، انجام شد (۲1 و 47). بعد از انجام PCR، محصولات هدف تکثیرشده (جدول3) برای توالی­یابی به شرکت ماکروژن کره­جنوبی فرستاده شدند (29).

 

جدول ۲- چرخه حرارتی PCR انجام شده برای کم­تاران

مراحل PCR

دما(° C)

زمان

 

واسرشته­سازی اولیه

94

3 دقیقه

 

واسرشته­سازی

94

30 ثانیه

 

34 سیکل

اتصال

48 (متغیر)

30 ثانیه

طویل سازی

72

1 دقیقه

طویل شدن نهایی

72

5 دقیقه

 

خنک شدن

25

2 دقیقه

 

 

 

جدول ۳- مشخصات مواد مورد نیاز برای انجام PCR

حجم (میکرولیتر)

مواد

5/12

مسترمیکس RED

5/9

آب

1

آغازگر پیشرو (LCO1490  )

1

آغازگر معکوس (HCO2198)

1

DNA

25

حجم نهایی

آنالیز­های ژنتیکی: درمجموع ۱۸۰ نمونه جمع‌آوری شد و ۴۰ توالی (از هرایستگاه ۲ تا ۱۲ فرد) انتخاب شد. توالی­ها با نرم‌افزار Geneious v.11.1.4 (25) ویرایش شدند و سپس با استفاده از الگوریتم Blastn مربوط به Genbank از همساختی و تعلق توالی­ها به کرم­های کم­تار اطمینان حاصل شد. هم­ردیف­سازی با الگوریتم MAFFT انجام شد (۲4). مجموعه داده­ها به طور میانگین ۶۳۳ جفت باز طول داشت. توالی­ها سپس به صورت چشمی کنترل شدند تا از عدم خطاهای نرم‌افزاری در هم­ردیف­سازی اطمینان حاصل شود.

از یک گونه­ پرتارHermodice carunculata (Pallas, 1766)  برای ریشه‌دار کردن درخت‌های فیلوژنتیکی استفاده شد (Accession Number: KF878476.1). جهت تعیین بهترین مدل جایگزینی نوکلئوتیدی برای تفسیر و آنالیز داده­ها از نرم‌افزار Modeltest v.3.7 استفاده شد (39). طبق این آزمون، مدل نوکلئوتیدی TVM + G + I برای تحلیل‌های فیلوژنتیکی انتخاب شد.

آنالیز درخت بیشینه­ی احتمال (Maximum Likelihood) با استفاده از نرم‌افزار v.1.6.1 IQ TREE با Bootstrap 1000 انجام شد (۳3). برای ویرایش درخت­های ژنتیکی از نرم‌افزار FigTree v.1.4.3 استفاده شد (۴3). برای آنالیز شبکه هاپلوتایپی و مشاهدات روابط هاپلوتایپی گونه­های این مطالعه و همچنین توالی‌های گونه­های موجود در بانک ژن از سایر نقاط جهان شامل آمریکا، فرانسه، آلمان، روسیه، انگلستان و نروژ (جدول ۴) برای ژن میتوکندریایی COI از نرم‌افزارHaplotype viewer (www.cibiv.at/~greg/haploviewer) براساس Median joining استفاده شد (46). فواصل ژنتیکی (P-distance) میان افراد مورد مطالعه در درون و بین گونه برای ژن میتوکندریایی COI با استفاده از نرم‌افزار v.10.0.1 MEGA-X محاسبه شد (27). به منظور بررسی شاخص‌های تنوع­ژنتیکی (تنوع هاپلوتایپ و تنوع نوکلئوتیدی) از نرم‌افزار DnaSP v.6.11 استفاده شد (45).

نتایج

تنوع کم­تاران در رودخانه جاجرود: براساس درخت بیشینه احتمال، میزان Bootstrap برای گره‌ها عمدتاً بالای ۹۰ درصد بود. پنج گونه از سه جنس Eiseniella، Eisenia و Tubifex شناسایی شد و سه کلاد مجزا از هم را تشکیل دادند. کلاد اول، Eiseniella tetraedra با تشکیل یک گروه هم نیا (BP=98) چهار دودمان (Lineage) مجزا را شامل شد که دودمان B و C با یکدیگر تشکیل رابطه­ی خواهری (BP=96) دادند. کلاد دوم شامل Eisenia fetida و Eisenia sp. (BP=98) و کلاد سوم Tubifex tubifex و Tubifex sp. را شامل شد (BP=100) (شکل ۲).

 

شکل ۲- درخت بیشینه احتمال با استفاده از ژن میتوکندریایی COI. مناسب­ترین مدل تکاملی نوکلئوتیدی برای این داده‌های ژنیTVM + G + I محاسبه شد. درخت با استفاده از گونه­ی ­ carunculata (Pallas, 1766) Hermodice ریشه‌دار شد. آزمون نسبت تقریبی احتمال برای هر شاخه و همچنین میزان Bootstrap برای هرگره به ترتیب روی هر شاخه با دو مقدار مشخص شده است (SH-aLRT support (%) / ultrafast bootstrap support (%) values). دودمان­های E. tetraedra براساس رنگ خاص خود تفکیک‌شده‌اند (آبی: دودمان B، بنفش: دودمان C، زرد: دودمان A، سبز: دودمان D)

جدول ۴- مشخصات توالی مولکولی نمونه‌های کرم‌های کم تار رودخانه جاجرود و توالی­های گرفته‌شده از بانک ژن (ENG: انگلستان، GER: آلمان، USA: آمریکا، FRC: فرانسه، RUS: روسیه، NWR: نروژ). توالی­ها از ردیف ۱تا ۴۰ متعلق به رودخانه­ی ­جاجرود و از ردیف ۴۱ تا ۵۲ متعلق به سایر نقاط جهان است

ردیف

گونه

دودمان

خانواده

 GenBank Accession number

ES number

مکان

1

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

MT271113

61-ES2159

J6

2

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

MT271114

65-ES2151

J

6

3

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

MT271115

73-ES2003

J1

4

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

MT271116

75-ES2005

J1

5

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

MT271112

49-ES2059

J3

6

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

MT271117

68-ES2093

J5

7

Eiseniella tetraedra

B

Lumbricidae

MT271102

66-ES2152

J6

8

Eiseniella tetraedra

B

Lumbricidae

MT271099

36-ES2060

J3

9

Eiseniella tetraedra

B

Lumbricidae

MT271101

62-ES2161

J6

10

Eiseniella tetraedra

B

Lumbricidae

MT271100

63-ES2164

J6

11

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271054

76-ES2266

J7

12

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271055

85-ES2275

J7

13

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271056

48-ES2084

J4

14

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271065

50-ES2071

J3

15

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271060

79-ES2269

J7

16

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271064

82-ES2272

J7

17

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271063

78-ES2268

J7

18

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271061

30-ES2028

J2

19

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271062

29-ES2027

J2

20

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271059

81-ES2271

J7

21

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

MT271058

80-ES2270

J7

22

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271083

71-ES2001

J1

23

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271087

67-ES2086

J5

24

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271082

69-ES2094

J5

25

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271086

27-ES2046

J2

26

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271074

77-ES2267

J7

27

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271077

74-ES2004

J1

28

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271079

56-ES2117

J5

29

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271078

72-ES2002

J1

30

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271084

1-ES2018

J2

31

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271076

28-ES2006

J2

32

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271081

54-ES2096

J5

33

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271080

55-ES2111

J5

34

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271089

4-ES2034

J2

35

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

MT271088

ES2029-2

J2

36

Tubifex sp.

Naididae

MT271128

ES2273-83

J7

37

Tubifex sp.

Naididae

MT271129

ES2274-84

J7

38

Eisenia fetida

Lumbricidae

MT271119

ES2083-42

J4

39

Eisenia sp.

Lumbricidae

­-

ES2276-86

J7

40

Tubifex tubifex

Naididae

MT271130

ES2277-87

J7

41

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

KY284189.1

­-

ENG

42

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

KY284336.1

­-

GER

43

Eiseniella tetraedra

A

Lumbricidae

KY284292.1

­-

USA

44

Eiseniella tetraedra

B

Lumbricidae

KY284226.1

­-

FRC

45

Eiseniella tetraedra

B

Lumbricidae

KY284232.1

­-

USA

46

Eiseniella tetraedra

R

Lumbricidae

KY284297.1

­-

GER

47

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

KY289303.1

­-

RUS

48

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

KY289302.1

­-

USA

49

Eiseniella tetraedra

C

Lumbricidae

KY284293.1

­-

GER

50

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

KY284324.1

­-

ENG

51

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

KY284309.1

­-

USA

52

Eiseniella tetraedra

D

Lumbricidae

KY284202.1

­-

NWR

 

 

فاصله ژنتیکی: میانگین فاصله­ی ژنتیکی بین‌گونه‌ای
(p-distance) بین 2/18-1/25 % است. تغییرات فاصله­ی ژنتیکی درون­گونه­ای بین دودمان­های E. tetraedra (دودمان­های A، B، C و D) به‌صورت تقریبی بین 2-10 % محاسبه شد (جدول ۵).

 

جدول ۵- فاصله ژنتیکی تصحیح‌نشده براساس ژن COI بین گروه­های مختلف گونه­ای کرم­های کم­تار رودخانه جاجرود

(A، B، C و D دودمان­های گونه­ی E. tetraedra هستند)

 

Tubifex tubifex

Tubifex sp.

Lineage A

Lineage B

Lineage D

Lineage C

 Eisenia fetida

Tubifex tubifex

             

Tubifex sp.

182/0

           

Lineage A

230/0

243/0

         

Lineage B

241/0

247/0

022/0

       

Lineage D

231/0

251/0

091/0

097/0

     

Lineage C

232/0

248/0

084/0

086/0

063/0

   

Eisenia fetida

241/0

243/0

210/0

208/0

217/0

195/0

 

Eisenia sp.

224/0

243/0

217/0

221/0

211/0

204/0

 080/0

 

 

شبکه هاپلوتایپی برای گونه­ی E. tetraedra در ایران و نقاط مختلف جهان: شبکه هاپلوتایپی درمجموع هشت هاپلوتایپ را تشکیل داد که دودمان A یک هاپلوتایپ، دودمان B یک هاپلوتایپ، دودمان C دو هاپلوتایپ و دودمان D چهار هاپلوتایپ را شامل شد. دودمان D بیشترین فراوانی (۴۰ درصد) را نشان داد. هاپلوتایپ دودمان A با آمریکا، انگلستان و آلمان، هاپلوتایپ دودمان B با آمریکا و فرانسه، هاپلوتایپ­های دودمان C با آمریکا، روسیه و آلمان و هاپلوتایپ­های دودمان D با آمریکا، انگلستان و نروژ تشکیل هاپلوتایپ­های مشترک دادند (شکل ۳).

 

شکل ۳- شبکه هاپلوتایپ ترسیم‌شده بین هاپلوتایپ­های موجود دودمان­های این مطالعه و توالی­های گرفته‌شده از بانک ژن برای گونه­ی E. tetraedra براساس ژن میتوکندریایی COI. گره­های آبی جهش­ها هستند که با عدد (1) نشان داده شد. هر ایستگاه و کشور بر اساس رنگ خاص خود تفکیک شده­اند. (آبنیک:ABN، آبنیک­پایین:ABL، حاجی­آباد:HAJ، آهار:AHR، شمشک:SHM، فشم:FSH، سعیدآباد:SAI، آلمان:GER، آمریکا:USA، فرانسه:FRC، روسیه:RUS، نروژ:NWR، انگلستان:ENG)

 

بررسی ساختار جمعیتی- تنوع ژنتیکی E. tetraedra: مطابق جدول ۶، بیشترین تنوع هاپلوتایپی و بیشترین تنوع نوکلئوتیدی در ایستگاه شمشک (به ترتیب ۱ و ۰۰۶۲/۰) و کم­ترین تنوع هاپلوتایپی در ایستگاه سعیدآباد (۲۵/۰) و کم­ترین تنوع نوکلئوتیدی در ایستگاه­های حاجی‌آباد و سعیدآباد (به ترتیب ۰۱۲/۰ و ۰۰۱۵/۰) محاسبه شد. همچنین مقدار تنوع نوکلئوتیدی کم به­دست آمد. به‌طورکلی مقدار تنوع هاپلوتایپی و نوکلئوتیدی دودمان­های E. tetraedra در ایستگاه­های بالا­دست و میان­دست رودخانه بالاتر از پایین­دست رودخانه محاسبه شد.

 

 

جدول ۶- شاخص­های تنوع هاپلوتایپ (h) و نوکلئوتید (π) گونه­ی E. tetraedra در هر ایستگاه

 

آبنیک

آبنیک پایین

شمشک

فشم

آهار

حاجی­آباد

سعیدآباد

h

6/0

81/0

1

-

333/0

8/0

25/0

π

05/0

03/0

062/0

-

028/0

012/0

015/0

محاسبه‌ی شاخص‌های تنوع برای ایستگاه فشم به علت داشتن تنها یک توالی مقدور نشد زیرا شرط محاسبه داشتن بیش از یک توالی است.

 

فراوانی کم­تاران در هر ایستگاه نمونه‌برداری: بیشترین درصد فراوانی گونه در تمامی ایستگاه‌ها برای
E. tetraedra ثبت گردید (87%). فراوانی گونه­های
E. fetida، Eisenia sp.، Tubifex sp. و T. tubifex بین 2-5 درصد محاسبه شدند (شکل ۴).

شکل ۴- فراوانی کل گونه­های کرم کم­تار براساس درصد در ایستگاه­های نمونه‌برداری در رودخانه جاجرود

بحث و نتیجه‌گیری

مطالعات اندکی در خصوص تنوع­زیستی کرم­های کم­تار ایران صورت گرفته است و تحقیقات انجام­گرفته تنها بر اساس ریخت­شناختی گونه­ها را شناسایی کرده است: اولین اطلاعات از کم­تاران آب­های داخلی ایران، در سال 1920 با ثبت چهارگونه Chaetogaster diastrophus، Chaetogaster limnaei، Nais communis و Stylarialacustris گزارش شد (48). از سال 1996 پژوهش­های بیشتری در رابطه با کم­تاران آبزی انجام شد. برای اندازه­گیری فلزات سنگین در رسوبات سطحی در تالاب انزلی، بزرگ بی­مهرگان کفزی را به عنوان شاخص زیستی مورد سنجش قرار دادند و Tubifex tubifex در این تالاب شناسایی شد (40). در رودخانه­های جاجرود و برغان نمونه­هایی از بی­مهرگان کفزی جمع‌آوری شدند که Tubifex tubifex وEiseniella sp.  شناسایی شدند (18). با مطالعه­ی تنوع زیستی گونه­های بی­مهره کفزی در رودخانه ارس، چهار گونه از کم­تاران آبزی ثبت شدند که شامل سه گونه جدید Aulodrilus pigueti، Branchiura sowerbyi و Spirosperma ferox شدند (7). با بررسی بزرگ بی­مهرگان تالاب زرینه در جنوب دریاچه، تنها Branchiura sowerbyi و Limnodrilus hoffmeisteri گزارش شدند (6). در رودخانه جاجرود Ophidonais serpentina، گونه­ای جدید از کم­تاران آبزی نیز گزارش شد (8). ده گونه از کم­تاران طی مطالعه­ی بی­مهرگان رودخانه زرینه­رود ثبت شدند که چهار گونه جدید Limnodrilus udekemianus، Lumbriculus variegatus، Rhyacodrilus coccineus و Aulophorus furcatus را شامل شد (5). برای کاهش میزان لجن زباله­های زیستی تولیدشده در تأسیسات تصفیه فاضلاب در اهواز کرم­های آبزی به کار برده شدند که Lumbriculus variegatus شناسایی شد (9).

براساس چک‌لیست به‌روز شده کم­تاران آبزی ایران در سال 2014، علاوه بر ۱۴ گونه شناسایی‌شده از مطالعات قبل، پنج گونه جدید Dero dorsalis، Embolocephalus velutinus، Haplotaxis gordioides، Pristina breviseta و Psammoryctides albicola شناسایی و ثبت شدند (22). این چک‌لیست با مطالعه نمونه­ها در رسوبات کف و پوشش گیاهی آبزی در تالاب بین‌المللی انزلی با ثبت هفت گونه جدیدLimnodrilus claparedeianus، Potamothrix hammoniensis، Potamothrix bedoti، Nais pardalis، Dero digitata، Slavina appendiculata و Mesenchytraeus sp. به‌روز شد (35).

در مطالعه­ی حاضر برای اولین بار از روش مولکولی جهت بررسی تنوع­گونه­ای کم­تاران آبزی استفاده شد. باتوجه به شکل ۲، پنج گونه شناسایی شد. دوگونه آبزی از خانواده Naididae، T. tubifex و Tubifex sp. ثبت شد. نتایج مطالعات چنگ و جیمز (2011) نشان می­دهد که فاصله­ی ژنتیکی کمتر از ۹ درصد گونه­ مشابه و بالاتر از ۱۵ درصد دو گونه را مجزا می­کند (۱4). T. tubifex و Tubifex sp. با میانگین فاصله­ی ژنتیکی بالا (جدول ۵) و قرار گرفتن در کلاد مجزا با ساپورت بالا (شکل ۲) به احتمال زیاد، دو گونه­ مجزا از هم محسوب می­شوند. فقط T. tubifex در مطالعات گذشته نیز گزارش شد (5،18،34،40). از خانواده­ Lumbricidae، دو گونه­ احتمالاً خشکی­زی Eisenia sp. و E. fetida و چهار دودمان مجزا از گونه نیمه­آبزی
E. tetraedra ثبت شدند. گونه غیربومیE. fetida به صورت تصادفی در این مطالعه یافت شد که در سرتاسر جهان معرفی شده است. محدوده­ی اصلی آن آسیای مرکزی است، در­حالی­که محدوده­ی فعلی آن به اروپا، آمریکای شمالی، آمریکای جنوبی، آفریقا، آسیا و استرالیا گسترش یافته است (15،20،28). T. tubifex، Tubifex sp. و Eisenia sp. تنها در ایستگاه سعید­آباد، E. fetida به صورت تصادفی فقط در ایستگاه فشم و دودمان­های
E. tetraedra در هر هفت ایستگاه­ مشاهده شدند (جدول۴). با توجه به مطالعات یابلوسکا و پسیچ در سال 2014، کشور ایران با دارا بودن ویژگی­های جغرافیایی و هیدرولوژیکی منحصربه­فرد، تنوع­گونه­ای بالایی از کرم­های کم­تار در رودخانه انتظار می­رفت (۲2)، اما در مطالعه حاضر تنوع آن‌ها اندک بود. دراین مطالعه فراوان­ترین (۸۷%) نمونه­های به‌دست‌آمده متعلق به گونه­ E. tetraedra است (شکل۴) که چهار دودمان مجزا را تشکیل داد (شکل۲). E. tetraedra بومی مناطق غربی اروپا است که در حال حاضر عمدتاً در مناطق معتدل در هر دو نیمکره جهان گسترش یافته است و به اکثر نقاط جهان معرفی شده است (11 و 15). این گونه در مناطق غربی کالیفرنیا (49)، ژاپن (۱1)، استرالیا (۳1) و نیوزلند (26) به‌عنوان گونه غیربومی از خانواده­ Lumbricidae شناخته شده است. در ایران نیز در کوه­های البرز مرکزی در طول رودخانه­های هراز و چالوس، غرب استان مازندران، استان تهران، استان کهگیلویه و بویراحمد و همچنین در دو رودخانه­ی حفاظت‌شده‌ی کوهستان‌های البرز جنوبی (کرج و جاجرود) به ثبت رسیده است که زیستگاه­های مرطوب را ترجیح می­دهد، بنابراین در مناطق البرز و غرب مازندران به علت رطوبت و بارندگی بیشتر، توزیع گسترده­تری دارد (19،20،23،28). نتایج مطالعه مارتینسون و همکاران (2015) با نتایج مطالعه­ی حاضر مطابقت دارد.
E. tetraedra که منشأ اروپایی دارد، دودمان­های آن در استرالیا به‌عنوان گونه­ی غیربومی تنوع ژنتیکی درون­گونه­ای بالایی (بین 0- 5/%5) داشت. این گونه با نمونه­های دیگر از نقاط مختلف جهان (اروپا، آمریکای شمالی و مرکزی و آسیای شرق دور) هاپلوتایپ­های مشترک تشکیل داد (۳5). در مطالعه­ی حاضر نیز دودمان­های E. tetraedra هاپلوتایپ­های مشترک با سایر نقاط جهان تشکیل دادند (شکل۳) و تنوع درون‌گونه‌ای بین10-2% را در طول رودخانه جاجرود نشان دادند (جدول۵). جاویدکار و همکاران (2020) پژوهش مشابه و به‌طور هم‌زمان در رودخانه­های کرج و جاجرود انجام دادند که نتایج یکسانی با مطالعه­ی حاضر به دنبال داشت. E. tetraedra فراوان­ترین گونه با شش دودمان مجزا بود و دودمان­های آن با سایر نقاط جهان، تشکیل هاپلوتایپ­های مشترک دادند. همچنین عدم ساختار جمعیتی مشخص از احتمال معرفی شدن توسط انسان حمایت می‌کند و فراوانی گونه­های بومی را تحت تأثیر قرار داده است (۲3). عوامل مختلفی می­تواند فراوانی این گونه را تحت تأثیر قرار دهد. یکی از علل گسترش E. tetraedra در اکثر مناطق جهان، تولیدمثل بکرزا (Parthenogenetic) آن است که قادر است تعداد زیادی پیله (Cocoon) تولید کند. نتایج  دسوسا و همکاران (2017) نشان داد که دودمان­های این گونه­ تنوع ژنتیکی بالایی را در اسپانیا نشان دادند و ساختار جمعیتی مشخصی نداشتند که بیشترین تنوع دودمان­ها در میان­دست محاسبه شد (17). در مطالعه حاضر نیز نتایج مشابه بود و در میان­دست و بالادست، بیشترین تنوع را داشتند. تنوع پایین محاسبه­شده در پایین­دست، تأثیر فعالیت­های انسان و شرایط نامساعد بر تنوع ژنتیکی را نشان می­دهد (جدول۶). باتوجه به فراوانی بالای E. tetraedra در رودخانه جاجرود ارزیابی اثرات و شناخت خطرات بالقوه اکولوژیک و تهدیدات آن بسیار ضروری است.

1- آهنی، م.، عزیزی، ع. و راثی نظامی، س. (1395)..ارزیابی سلامت رودخانه­ها با استفاده از ماکروبنتوز­ها و شاخص زیستی هیلسنهوف (مطالعه موردی: رودخانه جاجرود)، اولین کنفراس بین‌المللی آب، محیط‌زیست و توسعه پایدار.
2- خیرده، ر.، نجفی جیلانی، ع. و گهرنژاد، ح. (1394). کیفیت‌سنجی آب با استفاده از شاخص­های زیستی مطالعه موردی رودخانه جاجرود. دومین کنفرانس بین‌المللی دستاوردهای نوین پژوهشی در عمران، معماری، مدیریت شهری.
3- محمدی، س.، عبدلی، ا.،هاشمی، ح. و کامبوزیا، ج. (1392). استفاده از شاخص زیستی بزرگ بی­مهرگان کفزی برای ارزیابی کیفیت آب مطالعه موردی رودخانه جاجرود (پایین‌دست سد لتیان). پایان‌نامه ارشد رشته مهندسی محیط زیست-آلودگی­های محیط‌زیست. دانشگاه شهید بهشتی.
4- موسوی ندوشن، ر. (1393). بررسی جمعیت کفزیان سرشاخه­های رودخانه جاجرود استان تهران. پژوهش­های علوم و فنون دریایی، شماره 1، 60-72.
 
5- Ahmadi, R., Aliyev, A., Seidgar, M., Bayramov, A. and Ganji, S. (2012). Macroinvertebrate communities differences on riverine parts and reservoirs of Zarrineh River. American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 7(1):71-75.
6- Ahmadi, R., Mohebbi, F., Hagigi, P., Esmailly, L., and Salmanzadeh, R. (2011). Macro-invertebrates in the Wetlands of the Zarrineh estuary at the south of Urmia Lake (Iran). International Journal of Environmental Research, 5(4), 1047-1052.
7- Aliyev, A. and Ahmadi, R. (2010). Biodiversity of benthic invertebrates in Aras River. Iranian Scientific Fisheries Journal,19(2): 131-142.
8- Ardalan, A. A., Mooraki, N. and Sadeghi, M. S. (2011). Occurrence of Ophidonais serpentina in Potamon persicum from Jajrood River,Iran. Iranian Journal of Fisheries Sciences, 10 (1): 177-180.
9- Basim, Y., Farzadkia, M., Jaafarzadeh, N. and Hendrickx, T. (2012). Sludge reduction by lumbriculus variegatus in Ahvas wastewater treatment plant. Iranian journal of environmental health science & engineering, 9(1), 4.
10- Behrend, R. D. L., Takeda, A. M., Gomes, L. C. and Fernandes, S. E. P. (2012). Using oligochaeta assemblages as an indicator of environmental changes. Brazilian Journal of Biology, 72(4), 873-884.
11- Blakemore, R. J., Ito, M. T., and Kaneko, N. (2006b). Alien earthworms in the Asia/Pacific region with a checklist of species and the first records of Eukerria saltensis (Oligochaeta: Ocnerodrilidae) and Eiseniella tetraedra (Lumbricidae) from Japan, and Pontoscolex corethrurus (Glossoscolecidae) from Okinawa. Assessment and control of biological invasion risks, 173-181.
12- Brinkhurst, R. O. (1971). A guide for the identification of British Aguatic Oligochaeta. Ambleside & Westmorland.
13-  Brinkhurst, R. O. (1986). Guide to the freshwater aquatic microdrile oligochaetes of North America. Canad. Spec. Pub. Fish. Aquat. Sci. 84, Ottawa, Ont.
14- Chang, C.-H. & James, S.W. (2011) A critique of earthworm molecular phylogenetics. Pedobiologia, 54, Supplement, S3–S9.
15- Csuzdi, C., and Zicsi, A. (2003). Earthworms of Hungary (Annelida: Oligochaeta, Lumbricidae) (p. 271). Budapest: Hungarian Natural History Museum.
16- Decaëns, T., Porco, D., Rougerie, R., Brown, G. G. and James, S. W. (2013). Potential of DNA barcoding for earthworm research in taxonomy and ecology. Applied Soil Ecology, 65, 35-42.
17- de Sosa, I., Marchán, D. F., Novo, M., Almodóvar, A., and Cosín, D. D. (2017). Bless this phylogeographic mess–Comparative study of Eiseniella tetraedra (Annelida, Oligochaeta) between an Atlantic area and a continental Mediterranean area in Spain. European journal of soil biology, 78, 50-56.
18- Egglishaw, H. J. (1980). Benthic invertebrates of streams on the Alburz Mountain Range near Tehran, Iran. Hydrobiologia, 69, 49–55.
19- Ezzatpanah, S., Robabeh, L., Masoumeh, M. and Hasan, S. (2010). Earthworm fauna of the western Mazandaran province, Iran: (Oligochaeta: Lumbricidae, Megascolecidae). Zoology in the Middle East, 51(sup2), 67-74.
20- Farhadi, Z., Malek, M. and Elahi, E. (2013). Review of the earthworm fauna of Iran with emphasis on
Kohgiluyeh & Boyer-Ahmad Province. Zootaxa, 3670(4), 440-448.
21- Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R. and Vrijenhoek R. (1994).DNA primers for ampilification
of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrats.Mol. Mol Mar
Biol Biotechnol, 3(5): 294-299.
22- Jabłońska, A. and Pešić, V. (2014). Five species of aquatic oligochaetes new to Iran with an updated checklist.international journal of oceanography and hydrobiogy, 43 (1): 100-105.
23-  Javidkar, M., Abdoli, A., Ahmadzadeh, F., Nahavandi, Z. and  Yari, M. (2021). Molecular evidence reveals introduced populations of Eiseniella tetraedra (Savigny, 1826) (Annelida, Lumbricidae) with European origins from protected freshwater ecosystems of  the southern Alborz Mountains. Marine and Freshwater Research, 72(1), 44-57.
24- Katoh, K., and  Standley, D. M. (2013). MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular biology and evolution, 30(4), 772-780.
25- Kearse, M., Moir, R., Wilson, A., Stones-Havas, S., Cheung, M., Sturrock, S., Buxton, S., Cooper, A., Markowitz, S., Duran, C. and Thierer, T. (2012). Geneious basic: an integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics, 28(12), 1647-1649.
26- Kim, Y. N., Dickinson, N., Bowie, M., Robinson, B. and Boyer, S. (2017). Molecular identification and distribution of native and exotic earthworms in New Zealand human-modified soils. New Zealand Journal of Ecology, 41(2), 218-225.
27- Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., and Tamura, K. (2018). MEGA X: molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution, 35(6), 1547–1549.
28- Latif, R., Ezzatpanah, S., Malek, M. and Parsa, H. (2009). Earthworms of the Central Elburz Mountains, Iran. Iranian Journal of Animal Biosystematics, 5 (2): 1-15.
29- Macrogen, k., http://www.macrogen.co.kr.
30- Martin, P., Martinez-Ansemil, E., Pinder, A., Timm, T. and Wetzel, M. J. (2007). Global diversity of
oligochaetous clitellates (“Oligochaeta”; Clitellata) in freshwater. In Freshwater Animal Diversity
Assessment (pp. 117-127). Springer, Dordrecht.
31- Martinsson, S., Cui, Y., Martin, P. J., Pinder, A., Quinlan, K., Wetzel, M. J., & Erséus, C. (2015).
DNA-barcoding of invasive European earthworms (Clitellata: Lumbricidae) in south-western
Australia. Biological invasions, 17(9), 2527-2532.
32- Mermillod-Blondin, F., Nogaro, G., Datry, T., Malard, F. and Gibert, J. (2005). Do tubificid worms influence the fate of organic matter and pollutants in stormwater sediments?. Environmental Pollution, 134(1), 57-69.
33- Minh, B. Q., Trifnopoulos, J., Schrempf, D. and Schmidt, H. A. (2017). IQ-TREE version 1.6.0: Tutorials and Manual Phylogenomic software by maximum likelihood.
34- Mirmonsef, H., Malek, M. and Latif, R. (2011).The Earthworm Fauna of Tehran Province,Iran: an Ecological Characterization.Iranian Journal of Animal Biosystematics,(7).2, 89-97.
35- Nazarhaghighi, F., Timm, T., Mousavi, R. N., Shabanipour, N., Fatemi, M. R. and Mashinchian, A. M. (2014). Oligochaetes (Annelida, Clitellata) in the Anzali International Wetland, north-western Iran. Estonian Journal of Ecology, 63(3): 130–144.
36- Payne, A. I. 1986. The ecology of tropical lakes and rivers. John Wiley, Chichester.301p.
37- Pinder, A. (2010). Tools for identifying selected Australian aquatic oligochaetes (Clitellata: Annelida). Museum Victoria Science Reports, 13: 1-26.
38- Pinder, A. M. and Ohtaka, A. (2012). Annelida: Clitellata, Oligochaeta. Freshwater Invertebrates of the Malaysian Region,162-174.
39- Posada, D. and Crandall, K. A. (1998). Modeltest: testing the model of DNA substitution. Bioinformatics (Oxford, England), 14(9), 817-818.
40- Pourang, N. (1996). Heavy metal concentrations in surficial sediments and benthic macroinvertebrates from Anzali wetland, Iran. Hydrobiologia, 331(1-3), 53-61.
41- Qiagen, (2014).Gentra puregene handbook. Sample and Assay Technologies.( www.qiagen.com).
42- Ragonha, F., Chiaramonte, J. B., Junior, H. M. F., Cunha, E. R. D., Benedito, E. and Takeda, M. (2013). Spatial distribution of aquatic Oligochaeta in Ilha Grande National Park, Brazil. Maringá, 35 (1): 63-70.
43- Rambaut, A., and Drummond, A.J. (2014). FigTree. Version 1.4.3 [computer program]. Available from http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree [accessed 15 August 2017].
44- Richard, B., Decaëns, T., Rougerie, R., James, S. W., Porco, D. and Hebert, P. D. N. (2010). Re‐integrating earthworm juveniles into soil biodiversity studies: species identification through DNA barcoding. Molecular ecology resources, 10(4), 606-614.
45- Rozas, J., Sánchez-DelBarrio, J. C., Messeguer, X. and Rozas, R. (2003). DnaSP, DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods. Bioinformatics, 19(18), 2496-2497.
46- Salzburger, W., Ewing, G. B., & Von Haeseler, A. (2011). The performance of phylogenetic algorithms in estimating haplotype genealogies with migration. Molecular ecology, 20(9), 1952-1963.
47- Shekhovtsov, S. V., Berman, D. I., Bazarova, N. E., Bulakhova, N. A., Porco, D. and Peltek, S. E. (2016). Cryptic genetic lineages in Eisenia nordenskioldi pallida (Oligochaeta,Lumbricidae).European Journal of Soil Biology, 75, 151–156.
48- Stephenson, J. (1920). On a collection of Oligochaeta from the lesser known parts of India and from eastern Persia. Memoirs of the Indian Museum, 7, 191–261
49- Wood, H. B., & James, S. W. (1993). Native and introduced earthworms from selected chaparral, woodland, and riparian zones in southern California. Gen. Tech. Rep. PSW-142. Albany, CA: US Department of Agriculture, Forest Service, Pacific Southwest Research Station. 20 p, 142.
50- Zicsi, A. (1975). Zootische Einflusse auf die Streuzersetzung in Hainbuchen-Eichenwaldern Ungarns.
Pedobiologia, 15(6), 432-438.
دوره 34، شماره 1
فروردین 1400
صفحه 57-68
  • تاریخ دریافت: 22 مرداد 1399
  • تاریخ پذیرش: 10 شهریور 1399